áfonyában

  • absztrakt
  • A fő
  • ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
  • Áfonyakivonat és endotoxin szuszpenzió készítése
  • Állatok és kezelések
  • elektroretinogram
  • Immunblot elemzések
  • A külső szegmens hosszának mérése
  • Kvantitatív valós idejű RT-PCR
  • ROS mérés
  • Statisztikai elemzések
  • AZ EREDMÉNYEK
  • Az antocianinban gazdag áfonyakivonat védő hatása a vizuális működésre az EIU alatt
  • A rodopszinszint fenntartása antocianinban gazdag áfonyakivonattal az EIU során
  • Az antocianinban gazdag áfonyakivonat gátló hatása a retina által indukált STAT3 aktiválására EIU által
  • A gyulladáscsökkentő citokin elnyomása antocianinban gazdag áfonyakivonattal a retinában EIU segítségével
  • Az oxidatív stressz csökkentése antocianinban gazdag áfonyakivonattal a retinában EIU felhasználásával
  • Az NF-kB B szuppressziója antocianinban gazdag áfonyakivonattal a retinában EIU alkalmazásával
  • VITA

absztrakt

A fő

A legújabb technológiai fejlődés orvosi szempontból hasznos kémiai vegyületek szintéziséhez vezetett. Másrészt hosszú történelmi precedens létezik az élőlényekből származó gyógyszerek kifejlesztésére, gyakran növényi kivonatok formájában. Például a szívgyógyszer digitalis először a digitalis virág (Digitalis purpurea L.) leveleiben jelent meg, 1 és az ópiummákban (Papaver somniferum L.) találtak fájdalomcsillapító morfiumot. 2

Itt az ehető bogyókra, az áfonyára (Vaccinium myrtillus L.) koncentrálunk, amelyek gazdag antocianinokat tartalmaznak. Az antocianinok az antocianinok vízben oldódó glikozidjai, amelyek a flavilium-kationok származékai. Az áfonyában 15 különböző antocianin található. 3 Korábbi jelentések azt sugallják, hogy az antocianinok felelősek az áfonya fő gyógyszerészeti hatásaiért, ideértve az antioxidáns aktivitást, a 4, 5, 6 és a szabad gyökök felderítésének képességét. 7 Az antocianinban gazdag áfonyakivonat régóta népszerű kezelés a különböző szemkörülmények között. Például úgy gondolják, hogy javítja az éjszakai látást, amelyhez klinikai vizsgálatokat végeztek. 8 Ez a kivonat megakadályozza a szürkehályogot és a glaukómát is. 9 A látásfunkcióra és az alapvető biológiai mechanizmusokra gyakorolt ​​hatásainak mértékét azonban nem sikerült tisztázni.

A túlzott oxidatív stressz számos betegségben tönkreteszi a szöveteket, ideértve a neurodegeneratív betegségeket, mint amyotróf laterális szklerózis, 10 szív- és érrendszeri betegség, 11 és a rák. A szembetegség, beleértve az életkorral összefüggő makula degenerációt13, szintén a reaktív oxigénfajták (ROS) túltermelése által okozott oxidatív stressz következménye. Mivel az antioxidáns, az antocianinokban gazdag áfonyakivonat hatással lehet a szövetek védelmére, gyógyszerészeti alkalmazásai lehetnek az emberek megelőző kezelésében.

Korábban kimutattuk, hogy egyes növényi eredetű molekulák képesek megelőzni vagy enyhíteni a retina károsodását: a lutein megakadályozza az idegi diszfunkciót, a resveratrol pedig a retina érrendszeri diszfunkcióját az endotoxin-indukálta uveitis (EIU) egérmodelljében. 14, 15 Ebben a modellben a veleszületett immunitás a látásfunkció károsodását okozza, amelyet az elektroretinogram (ERG), 15, 16, 17 és a kóros leukocitaadhézió is láthat, ami a retinában termelődő gyulladásos citokinek által okozott kóros keringéssel jár. Ezen egerek 18 ERG-je a fotoreceptor sejtek működésének károsodását mutatja, ami a rodopsin, egy STAT3-függő vizuális anyag túlzott lebomlásával jár. 17, 19

Ebben a tanulmányban feltártuk az antocianinban gazdag áfonyakivonat biológiai hatásait az EIU egerek vizuális funkciójára, valamint annak molekuláris mechanizmusára. Megállapításaink alátámasztják ennek a kivonatnak a megelőző terápiásként történő jövőbeni felhasználását.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Áfonyakivonat és endotoxin szuszpenzió készítése

A Wakasa Seikatsu (Kiotó, Japán) által szolgáltatott áfonyakivonatot (amely körülbelül 39% antocianint tartalmaz) 50 mg/ml koncentrációban foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) szuszpendáltunk. Az Escherichia coli 055: B5-ből származó lipopoliszacharidot (LPS) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) PBS-ben oldjuk 1 mg/ml koncentrációban.

Állatok és kezelések

A C57BL/6 egereket (6 hetesek) a CLEA Japan-tól (Tokió, Japán) vásároltuk, és egy légkondicionált helyiségbe (23 ± 1 ° C) helyeztük sötétség/12 óra fény (fény 8: 00-tól) ciklusokban. 20: 00-ig), ingyenes hozzáféréssel a szokásos élelmiszerekhez (CLEA Japan) és csapvízhez. Az egereket véletlenszerűen három csoportra osztottuk. Az egerek gazdagok voltak antocianinban gazdag áfonyakivonatban (500 mg/testtömeg-kg) az áfonya-csoportban vagy a PBS-ben a kontroll és a vivőanyag-csoportokban. 3 órával az utolsó beadás után a vivőanyag és az áfonya csoportok egy intraperitoneális LPS injekciót kaptak (6,0 mg/testtömeg-kg), hogy létrehozzanak egy EIU-modellt, míg a PBS-t a kontrollcsoportba injektálták. Az egereket 1, 5 (a foszforilált NF-kB mérésére) és 24 (mások számára) órát értékeltük LPS vagy PBS injekció után, amikor nyilvánvalóak a retina patológiás változásai. 15, 20 Minden állatkísérletet az állatok szemészeti és látáskutatásban való felhasználásáról szóló ARVO-nyilatkozatnak megfelelően hajtottak végre.

elektroretinogram

Az egereket legalább 12 órán át sötétre igazítottuk, gyenge vörös fény alatt készítettük el, és 70 mg/testtömeg-kg nátrium-pentobarbitállal altattuk (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, Osaka, Japán). A kísérlet során fűtőbetétre helyezték őket. A hallgatókat egyetlen csepp 0,5% tropikamid és 0,5% fenilefrin keverékkel bővítettük (Santen Pharmaceutical, Osaka, Japán). A földelt elektróda a tűt szubkután a farokba, a referencia elektród pedig a szájba helyezte. Az aktív elektródák a szaruhártyára helyezett arany huzalok voltak. Felvételeket készítettünk (PowerLab System 2/25; AD Instruments, NSW, Ausztrália), és a reakciókat differenciáltan felerősítettük és 0,313–1000 Hz tartományú digitális sávszűrőn keresztül α- és β-hullámokat kaptunk. 800 cd időtartamú fényimpulzusok · s/m 2 és 4 ms-ot kereskedelmi stimulátorral szállítottunk (Ganzfeld System SG-2002; LKC Technologies, Gaithersburg, MD, USA). Az elektródák impedanciáját minden mérés előtt és után minden állatnál ellenőriztük a készülék beépített funkciójával. Az α- és β-hullámok alapértelmezett idejét az inger kezdetétől az egyes hullámok csúcsáig mértük. Az a-hullám amplitúdóját az alapvonaltól az a-hullám vályújáig, a b-hullám amplitúdóját pedig az a-hullám vályújától a b-hullám csúcsáig mértük.

Immunblot elemzések

A külső szegmens hosszának mérése

A retinákat (10 μm) 4% paraformaldehidben rögzítettük, és hematoxilinnel és eozinnal (HE) festettük, és a külső szegmens (OS) hosszát a hátsó retinában négy pontban mértük, kettőt a látóideg mindkét oldalán. 200 és 500 távolságra egymástól az ImageJ segítségével, és átlagoltuk. Valamennyi metszetet digitális fényképezőgéppel ellátott mikroszkóp alatt vizsgáltuk (BIOREVO BZ-9000, Keyence, Osaka, Japán).

Kvantitatív valós idejű RT-PCR

A retinát TRIzole reagensbe helyeztük (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) az össz-RNS kivonására. Komplementer DNS-t (cDNS) készítettünk úgy, hogy 1 μg teljes RNS-t adtunk hozzá egy nagy áteresztőképességű RNS-k-cDNS Master Mix-hez (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) és reverz átírással a gyártó utasításainak megfelelően. A rodopsin, az interleukin-6 (IL-6) és a TNF-a mRNS szintjét normalizáltuk a GAPDH mRNS szintjére. A PCR-t StepOnePlus Real Time PCR rendszer (Applied Biosystems) alkalmazásával végeztük, és a delta delta CT módszert alkalmaztuk a génexpresszió számszerűsítésére. A következő génspecifikus primereket alkalmaztuk: rodopsin előre: 5'-GCTTCCCTACGCCAGTGTG-3 'és fordított: 5'-CAGTGGATTCTTGCCGCAG-3'; il-6 előre: 5'-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3 'és hátra: 5'-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3'; tnf-a előre: 5'-ACGTGGAACTGGCAGAAGAG-3 'és visszafelé: 5'-GGTCTGGGCCATAGAACTGA-3'; és előre rés: 5'-TGTCTTCACCACCATGGAGA-3 'és hátra: 5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGA-3'.

ROS mérés

Az ROS mérési protokoll néhány módosítással a közzétett 22. módszeren alapult. A szemeket elkülönítették és azonnal lefagyasztották a TOT-ban (Sakura Finetek, Torrance, Kalifornia, USA). A rögzítetlen kriozekciókat (10 μm) inkubáltuk 5 μM dihidroetídiummal (DHE; Invitrogen-Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 10 percig szobahőmérsékleten. A DHE reagál az intracelluláris szuperoxid anionnal és átalakul a vörös fluoreszcens etidium vegyület magjává. A metszeteket digitális fényképezőgéppel (BIOREVO BZ-9000, Keyence) felszerelt mikroszkóppal vizsgáltuk ugyanazon expozíciós körülmények között, és a belső plexiform réteg (INL) festésének intenzitását a hátsó retinában négy ponton, kettőt a látóideg mindkét oldala, 200 és 500 μm távolságra, ImageJ alkalmazásával és átlagolva.

Statisztikai elemzések

Az értékeket átlag ± sd-ként fejeztük ki. A különbségek statisztikai szignifikanciájának értékeléséhez nem párosított Student-féle t-tesztet használtunk. P

Az antocianinban gazdag áfonyakivonat védő hatása a vizuális működésre az EIU alatt. Az egyes egerek reprezentatív válaszai az egyes csoportokban ( a ). A-hullám amplitúdó-csökkentés ( b ) és b-hullámok ( c ) az EIU során az antocianinban gazdag áfonyakivonat jelentősen elnyomta. Az a-wave alapértelmezett ideje nem változott ( d ). Az implicit b-hullám idő meghosszabbodását az EIU során antocianinban gazdag áfonyakivonat ( e ). * P ** P

A rodopszinszint fenntartása antocianinban gazdag áfonyakivonattal az EIU során. Immunblot elemzés ( a, b ). Az EIU során a rodopsin fehérjetartalmának csökkenését antocianinban gazdag áfonyakivonat akadályozta meg. * P ** P 14

Az antocianinban gazdag áfonyakivonat gátló hatása a retina által indukált STAT3 aktiválására EIU által

A retinában a rodopsinszint csökkenése korrelál a gyulladással járó STAT3 aktivációval. A 16., 17. immunblot-elemzés azt mutatta, hogy az aktivált STAT3 az EIU alatt szabályozott volt, és ezt a növekedést elnyomta az antocianinban gazdag áfonyakivonat (3. ábra). Így a STAT3 aktiváció negatívan korrelált a rodopsin szinttel.

Az antocianinban gazdag áfonyakivonat gátló hatása a retina által indukált STAT3 aktiválására EIU által. Immunblot elemzés ( a, b ). Az aktivált STAT3-at a pSTAT3 mérésével értékeltük. Az EIU során a pSTAT3 növekedését jelentősen megakadályozta antocianinban gazdag áfonyakivonattal történő kezelés. * P ** P

A gyulladáscsökkentő citokin elnyomása antocianinban gazdag áfonyakivonattal a retinában EIU segítségével. Valós idejű PCR. Az IL-6 mRNS szintjét az EIU modell retinájában szabályoztuk, és antocianinban gazdag áfonyakivonattal szuppresszáltuk. * P 23 A vörös fluoreszcenciát, amely ROS-t képvisel, az ECLU modellekben felülszabályozták a GCL, INL és ONL modellekben; ezt a változást azonban antocianinban gazdag áfonyakivonattal kezelték (5. ábra).

Az oxidatív stressz csökkentése antocianinban gazdag áfonyakivonattal a retinában EIU-val. A retina metszeteinek reprezentatív digitális képei mindegyik csoportban DHE-vel reagáltak ( a ). A fluoreszcencia intenzitását ImageJ-vel mértük és átlagoltuk ( b ). Az EIU során a DHE fluoreszcencia növekedését az antocianinban gazdag áfonyakivonat elnyomta. ** P 24, amely az IL-6-tal ellentétes irányú lehet. Immunoblot analízissel mértük a retinában a foszforilált p65-et, amely az aktivált NF-κB egyik komponense, a retinában. Az aktivált NF-κB szintje emelkedett a retinában az EIU során; azonban jelentősen elnyomta az antocianinban gazdag áfonyakivonat (6. ábra).

Mind a homozigóta, mind a hemizigóta rodopsin knockout egerekben a fotoreceptor sejtek felnőttkorban elvesznek. A hosszan tartó gyulladás következtében fennálló tartós rodopszinhiány később fotoreceptor sejtek degenerációját okozhatja. Ezért az antocianinban gazdag áfonyakivonat szerepet játszhat a késői neurodegeneráció megelőzésében. Gyakorlati szempontból a gyulladás az EIU modellben nem tart tovább 10 napnál, 17, 28, ez lehet az oka annak, hogy nem figyelhető meg apoptózis.

A rodopsin csökkenése a STAT3 aktivációval és az IL-6 expresszióval társult. Korábbi tanulmányunk kimutatta, hogy a gyulladás során a STAT3-hoz társuló rodhodin csökkenése egy poszt-transzkripciós mechanizmusnak tudható be, amelyet túlzott lebontásnak találtunk az ubiquitin és a proteaszóma rendszerek által. Az aktivált STAT3 az Ubr1 E3-ubiquutin ligázt indukálja, amely a gyulladás során fokozza a rodopsin lebomlását, és az ROS módosíthatja a rodopsin fehérjét, ami felgyorsítja az ubiquitinációt és az azt követő lebomlást. Megfigyeltük azt is, hogy a rodopsin mRNS szintje kontroll körülmények között vagy gyulladás során nem változott, tekintet nélkül az antocianinban gazdag áfonyakivonattal történő kezelésre (az adatokat nem mutatjuk be), összhangban a poszt-transzkripciós módosítással. Ezért a jelenlegi tanulmányban valószínű, hogy a megnövekedett lebomlás ugyanaz a mechanizmusa fogja figyelembe venni a csökkent rodopszinszintet. Az antocianinban gazdag áfonyakivonat elnyomta a STAT3 aktiválódást és a ROS termelést, ami megakadályozhatta a rodopsin UPS által közvetített lebomlását.

Noha a STAT3 aktiválódhat különböző típusú ligandumokkal, ez a tanulmány kimutatta, hogy a gyulladásos retinában való aktiválódásának egyik jelöltje IL-6 volt. Valójában ismert, hogy az IL-6 Müller gliasejtjeiben expresszálódik 29, ami a downstream STAT3 aktivációt indukálja. Az antocianinban gazdag áfonyakivonat a retinában lévő helyi IL-6-STAT3 jelátvitel ezen ördögi körének blokkolásával járhatott. Ezzel szemben a másik gyulladáscsökkentő citokin, a TNF-α szintje nem változott ebben a vizsgálatban (az adatokat nem közöltük).

Az oxidatív stressz a helyi gyulladás és a szövetkárosodás egyik fő kiváltó oka a gyulladásos folyamatok során. 19 A DHE-t a különféle biológiai rendszerekben termelt szuperoxid-anion kimutatására használják in vivo és in vitro. Nemrégiben azt találták, hogy a DHE más oxidánsokkal is reagálhat, például H 2 O 2 -val és ONOO-val. Így a retina gyulladása során a DHE vörös fluoreszcenciája a retinában felhalmozódott több ROS-fajt jelezhetett. Az áfonya 3-ban található 15 antocianin nagy része érintetlenül kerül az élő állatok szemébe vagy retinájába. 31, 32 Ezek a korábbi eredmények alátámasztják azt az elképzelést, hogy a bevitt antocianinok ebben a tanulmányban az EIU egerek retinájába kerültek, ahol közvetlenül befogták a ROS-t.

Az aktivált NF-κB növekedett a retinában, ahol az ROS felhalmozódott az EIU hatására, és elnyomta azt, miután az antocianinban gazdag áfonya kivonat csökkentette a ROS-t, ami arra utal, hogy az extraktum ezen redox-érzékeny transzkripciós faktorra gyakorolt ​​hatása a ROS modulációja volt, antioxidáns. Az NF-κB célgén magában foglalja az IL-6-ot, amely alátámasztja azt az elképzelést, hogy az antocianinban gazdag áfonyakivonat STAT3-aktivációra gyakorolt ​​hatása a ROS-indukálta NF-κB-IL-6 tengely elnyomása volt.

Érdekes módon az antocianinban gazdag áfonyakivonat gátolja az angiotenzin-konvertáló enzim (ACE) aktivitását az érrendszeri endothelsejtekben azáltal, hogy képes megkötni és kelátképezni a Zn-t az ACE aktív helyén. Az angiotenzin II erősen szabályozott a retina gyulladása során, és az 1-es típusú angiotenzin II receptor-STAT3 aktivációs út szintén hozzájárul a rodopsin redukciójához a gyulladás során. Így az antocianinban gazdag áfonyakivonat az angiotenzin II jelátvitel módosításával elnyomhatja a rodopsin redukcióját. Az angiotenzin II ismert módon stimulálja a vas metabolizmusával összefüggő fehérjék helyi génexpresszióját 34, ami fokozhatja az ion transzporterek szabályozását és megkönnyítheti a vas felvételét. A vas túlterhelése oxidatív károsodáshoz vezet 35, így az antocianinban gazdag áfonyakivonat gátolhatja ezt az utat, hogy megvédje a fotoreceptor sejteket az oxidatív stressztől. Az antocianinban gazdag áfonyakivonat ezért gátolhatja a retina több útját a vizuális funkció védelme érdekében.

Az elmúlt négy évtized során az antocianinban gazdag áfonyakivonat alap- és klinikai tanulmányait a lehetséges egészségügyi előnyök miatt fokozták. 8, 36 Ennek a kivonatnak a részletes molekuláris mechanizmusa (i) azonban további vizsgálatokat igényel in vivo és in vitro. Ebben a tanulmányban bebizonyítottuk, hogy az antocianinban gazdag áfonyakivonat gyulladáscsökkentő és antioxidáns hatással rendelkezik in vivo. Eredményeink hozzájárulhatnak az új terápiás megközelítések jövőbeni fejlesztéséhez a vizuális funkció védelme érdekében a retina gyulladása során.