rekombináz

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • Különböző TK fúziós fehérjék öngyilkos hatása
  • Helyspecifikus genomiális integráció a HEK293 sejtekben, phiC31 integráz közvetítésével
  • A rekombinázok helyspecifikus integrálása és kivágása az elsődleges izolált szarvasmarha-magzati fibroblasztokban
  • vita
  • mód
  • Etikai megállapítás
  • Plazmid konstrukció
  • Sejtkultúra és transzfekció
  • Western blot
  • Citotoxicitási vizsgálat
  • Áramlási citometriás elemzés
  • Rekombináns sejtáteresztő fehérje és fehérje transzdukció előkészítése
  • Southern blot
  • Statisztikai analízis
  • További információ
  • PDF fájlok
  • További információ
  • Képfájlok
  • További információ
  • További információ
  • További információ
  • Hozzászólások

elemeket

  • Mezőgazdasági genetika
  • Génmanipuláció
  • Genetikai vektorok

absztrakt

A PhiC31 integráz által közvetített génbevitelt széles körben alkalmazzák az állati génterápiában és a transzgenesisben. A véletlenszerű integrációs eseményeket azonban a különböző emlős sejttípusokba történő phiC31 által közvetített integráció során figyeljük meg; ennek eredményeként a pseudo attP hely-integráció és a helyspecifikus integráció-értékelés hatékonysága veszélybe kerül. A rendszer javítása érdekében negatív szelekciós markerként az attB-TK fúziós gént használtuk, kiküszöbölve a véletlenszerű integrációt a phiC31 által közvetített transzfekció során. Két másik helyspecifikus rekombináz, Cre és Dre felhasználásával kiválasztottunk egy szelekciós rendszert és egy plazmid baktérium gerincet is. Így tiszta transzgénikus szarvasmarha-magzati fibroblaszt sejteket állítottunk elő szelekciós marker és plazmid nélkül bakteriális gerincből. Ezeket a tiszta sejteket használtuk donorként a szomatikus sejtmag transzferben (SCNT), ami arra utal, hogy az SCNT embriók hasonló fejlődési kompetenciát mutatnak, mint a nem transzgén sejtek. Ezért a jelenlegi génbeviteli rendszer megkönnyítette a génterápia és az agrárbiotechnológia fejlődését.

A PhiC31 integráz egy DNS rekombináz, amely a Streptomyces φ C31 1 fágból származik. Ez az enzim közvetítheti a rekombinációt két szekvencia, az attB és az attP 2, 3 között. A PhiC31 integráz nem igényli az attP hely tökéletes megőrzését az attP és az attB 4 helyek közötti rekombináció eléréséhez. Ezek a tökéletlen attP helyek vagy ál attP helyek hasonlítanak a vad típusú 5 attP helyekre, és a 6 genom transzkripciósan aktív régióiban vannak. A PhiC31-integráz viszonylag rövid, de kissé specifikus szekvenciákat ismer fel az emlősök genomjaiban 7. Így a phiC31 integráz rendszernek számos olyan jellemzője van, mint például a helyi specifitás és az egyirányú rekombináció, és lehetővé teszi az integráz sikeres alkalmazását a különféle kutatási területeken, ideértve az in vitro génadagolást 5 vagy az in vivo 8, a génterápiát 9 és a transzgénikus állatok termelését 10. .

Bemutattunk egy megközelítést, amely negatív szelekciós stratégiát alkalmazott a véletlenszerű integráció kizárásához a phiC31 által közvetített transzfekció során. Kiválasztottunk egy szelekciós rendszert és egy plazmid baktérium gerincet két másik rekombináz, nevezetesen Cre és Dre felhasználásával.

az eredmény

Különböző TK fúziós fehérjék öngyilkos hatása

(A) Különböző fuzionált TK konstrukciók vázlata. CMV: a citomegalovírus azonnali korai promótere; loxP és rox: Cre és Dre rekombinázok felismerési célpontjai; attB35 és attBwt: a vad típusú attB hely minimális frakcionális mérete és teljes hossza; G4S × 3: (Gly 4 Ser) 3 rugalmas összekötő; P2A: sertés teschovirus-1-ből származó, önmagában hasító 2A-peptid; ATG: a Kozak hagyományos szekvenciája által határolt iniciációs kodon; kontroll: üres vektor pIRES2-AcGFP1-Nuc. (B) Különböző TK konstrukciókkal transzfektált HEK293 sejtek Western blot elemzése. A blotot HSV-1 TK vagy GAPDH elleni poliklonális antitestekkel vizsgáltuk. A csillagok valószínű proteolitikus bomlástermékeket jelölnek. A teljes hosszúságú blokkokat az S8 kiegészítő ábra mutatja. (C) HEK293 sejtek immunfluoreszcens festése 48 órával a transzfekció után. A magokat DAPI-val (kék) festettük; A TK fehérjéket (vörös) anti-TK antitesttel festettük és Cy3-jelölt másodlagos antitestekkel tettük láthatóvá. Skála skála = 10 μm. (D) Különböző TK konstrukciókkal transzfektált HEK293 sejtek relatív életképessége. A FACS-szelektált transzfektált sejteket 4 napig a GCV nukleozidanalóg különböző koncentrációinak tettük ki. A citotoxicitást a WST-1 assay alkalmazásával határoztuk meg. A "kontroll" az üres pIRES2-AcGFP1-Nuc vektorral transzfektált sejteket jelenti.

Teljes méretű kép

Citotoxicitási vizsgálatot végeztek HEK293 sejteken a különböző TK fúziós fehérjék öngyilkossági hatásának vizsgálatára. Az eredmények azt mutatták, hogy a kontroll transzfektált HEK293 sejtek kivételével az összes TK konstrukció nagy koncentrációban érzékeny volt a ganciklovir (GCV) kezelésre (1D. Ábra). Ezzel szemben a pIRES2-AcGFP1-Nuc-tal transzfektált vektor-kontroll sejtvonal nagyon ellenálló volt 10 ug/ml GCV-vel szemben, és 2,76% -os sejthalált mutatott. 0,1 μg/ml GCV mellett a sejtek 51,1 ± 4,0% -a halt meg az attBrP2ATK transzfektált csoportban, szemben az attBrTK- és attBrG4STK-ban végzett 28,5 ± 7,7% (P = 0,001) és 34,8 ± 4,5% (P = 0,032) sejthalálozással. - transzfektált sejtek 4 napos kezelési periódus után. Ez az eredmény azt mutatta, hogy az attBrP2ATK-val transzfektált sejtek érzékenyebbek voltak a GCV-re, mint a másik két sejt, amelyet az attB-hez fuzionált TK-konstrukcióval transzfektáltak, viszonylag alacsony GCV-koncentráció mellett. Összehasonlításképpen, az attBrP2ATK-val transzfektált sejtek hasonló életképességet mutattak, mint az attB35TK-val és a wt-TK-val transzfektált sejtek, amelyekben a vad típusú fehérje mindkét csoportban expresszálódott. Ezért az attBrP2ATK-t választottuk reprezentatív TK konstrukciónak, amely teljes hosszúságú attB-vel olvadt össze a következő vizsgálatokhoz.

Helyspecifikus genomiális integráció a HEK293 sejtekben, a phiC31 integráz közvetítésével

Asztal teljes méretben

Asztal teljes méretben

A rekombinázok helyspecifikus integrálása és kivágása az elsődleges izolált szarvasmarha-magzati fibroblasztokban

A CMV promótert a CAGGS promóterrel helyettesítettük a TK transzgén expresszió magas szintjének fenntartása érdekében. Az eredmény a pCAG-attBrP2ATK plazmidintegrációs vektor létrehozása volt (2A. Ábra). Hozzáadtunk egy rox és loxP oldalsó többszörös klónozó helyet (MCS) is a kívánt gének (GOI) bejuttatásához, majd az IRES-AcGFP-Nuc kazettát kicseréltük az EF1α promoter által hajtott EGFP-expresszáló kazettára. Az újonnan létrehozott integrációs vektor expressziós hatékonyságának meghatározásához átmenetileg transzfektáltuk a HEK293 sejteket TK konstrukciók segítségével, amelyeket vagy a CMV, vagy a CAGG promoter hajtott. Western-blot vizsgálat azt mutatta, hogy a TK termék erősen expresszálódott a CAGGS promoter alatt (S2A. Kiegészítő ábra). A sejteket fluoreszcens mikroszkóppal figyeltük meg 48 órával a transzfekció után. A pCAG-attBrP2ATK-val transzfektált HEK293 sejtek erős fluoreszcens GFP jelet mutattak (S2B. kiegészítő ábra). Ez az eredmény megfelelő funkciót javasolt az EF1a promoter számára. Ezért további kísérletekben pCAG-attBrP2ATK-t alkalmaztunk, amely valószínűleg erős transzgén expressziót eredményezett az elsődleges izolált sejtekben.

Teljes méretű kép

Az SCNT transzgén embriók előállításához nukleáris donorként integrált tiszta transzgén sejtek egyszeri biztonságos kikötőjét használták szelekciós markerek és kivágott vektor gerinc nélkül. Ezen túlmenően, normális magzati szarvasmarha-fibroblasztokat, amelyek ugyanabból a magzatból származnak és hasonló passzusszámmal rendelkeznek, használtunk kontrollként a transzgenikus eljárások SCNT embriók fejlődési potenciáljára gyakorolt ​​hatásának vizsgálatára. Amikor kivágott sejteket használtunk nukleáris donorként a nem transzfektált szarvasmarha-magzati szarvasmarha-fibroblaszt sejtekhez képest, a hasítás és a blasztociszta képződés sebességében nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget (77, 4 ± 2,6% vs. 78,6 ± 4,3%, P = 0,7 hasítási sebesség, 32,6 ± 2,9% vs 36,3 ± 4,0%, P = 0,3 blasztociszta képződési sebesség esetén). Hasonló terhességi arányokat figyeltünk meg az embriótranszfer után a kontroll csoporthoz képest (25,9 ± 2,4% vs. 32,3 ± 4,7%, P = 0,1).

vita

Bevezettünk egy új stratégiát, amely felhasználható a phiC31 által közvetített pszeudo-specifikus integráció szelektálására véletlenszerű integrációból, és tiszta transzgén sejtek előállítására szelekciós markerek és vektor gerinc nélkül. A phiC31 integrázt alkalmaztuk a helyspecifikus genomiális integráció elérésére az álhelyeken. AttB-TK fúziós fehérjéket is használtunk negatív szelekciós markerként a véletlenszerű integráció kizárására. A tiszta transzgén sejteket fluoreszcenciával aktivált sejtrendezéssel állítottuk elő Cre- és Dre-rekombináz kezelés után.

Végül ez a tanulmány bemutat egy egyszerű phiC31 által közvetített stratégiát a transzgén biztonságos genomi kikötőbe történő integrálásához azáltal, hogy megakadályozza a véletlenszerű integrációt, és kombinálja a sejteket áteresztő fehérjék transzdukcióját és a fluoreszcenciával aktivált sejtek válogatását a szelekciós rendszer és a vektor gerincének eltávolítása érdekében. Ez a nem vírusos megközelítés egyszerű és biztonságos alternatívát kínál tiszta transzgén sejtek termeléséhez szelekciós markerek és plazmid baktérium gerinc nélkül. Ezért stratégiánk értékes eszköz a génterápiában és az állatok transzgenézisében.

mód

Etikai megállapítás

A kísérleti eljárást a Kínai Északnyugati Egyetem A&F Állategészségügyi Főiskolájának Állatgondozási Bizottsága hagyta jóvá. A levágott, érett tehenekből származó szarvasmarha-tojásokat a Tumen Vágóhíztól (Xi'An, Kína) gyűjtötték. Újszülött nőstény holstein borjakat alkalmaztak nukleáris donorok sejttenyészeteinek előállításához, kellemes állatokként pedig Angus szarvasmarha teheneket (Yangling Keyuan Cloning Co., Ltd., PR China).

Plazmid konstrukció

Több TK fúziós konstrukciót állítottunk elő a TOVÁBBI ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK szerint leírva (1A. Ábra). A vizsgálatban használt primer szekvenciákat, restrikciós helyeket és templátokat az SI táblázat tartalmazza.

Sejtkultúra és transzfekció

A HEK293 sejteket Dulbecco módosított Eagle táptalajában (DMEM; GIBCO, Carlsbad, CA) 10% magzati szarvasmarha-szérummal (FBS; GIBCO) kiegészítve 37 ° C-on, nedvesített atmoszférában, 5% CO 2 -val tenyésztettük. A szarvasmarha-magzati fibroblasztokat egy Holstein-magzatból (50-60 napos; Yangling Keyuan Biotechnology Inc., Kína) izoláltuk a fej nélküli test és a belek szétbontásával; a fibroblasztokat 10% FBS-sel kiegészített DMEM-ben tenyésztettük 38,5 ° C-on, nedvesített atmoszférában, 5% CO 2 -val. A szarvasmarhafélék magzati fibroblasztjait az összefolyáskor tripszinezéssel összegyűjtötték, és passzálásnak vagy krioprezerválásnak vetették alá.

A sejttranszfekciót a korábban leírt módon hajtottuk végre20. Röviden: a HEK293 sejteket vagy a szarvasmarha magzati fibroblasztjait 0,2 ml hígított elektroporációs munkapufferben szuszpendáltuk, amely csak donor plazmidot (5 μg) vagy donor plazmidot (5 μg) tartalmazott phiC31 mRNS-sel (1 μg). Az elektroporációt BTX ECM2001 (BTX, San Diego, CA) készülékkel végeztük, egy 2 ms impulzusra állítva 510 V feszültségen. Az elektroporáció után 24 órával a sejteket 10 cm-es csészében hígítottuk friss táptalajjal, amelyet G418-mal (400 μg)/ml egészítettünk ki. 600 μg/ml) vagy G418/GCV (400 μg/ml - 600 μg/ml és 1 μg/ml - 10 μg/ml) a stabilan transzfektált sejtek kiválasztásához. A szelekciót 12-15 napig végeztük, amíg az egyes telepeket összegyűjtöttük és megszámoltuk.

Western blot

A timidin-kináz fehérje expresszióját Western-blot segítségével detektáltuk. Sejtlizátumokat készítettünk üres vektor-kontrollal (pIRES2-AcGFP1-Nuc) vagy különféle TK-konstrukciókkal (attB35TK, attBrTK, attBrG4STK, attBrP2ATK és wt-TK) transzfektált HEK293 sejtekből. 48 órával a transzfekció után a sejteket összegyűjtöttük és foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) szuszpendáltuk. Az összes fehérjét (10 μg) 12% SDS-PAGE gélen egyetlen sávba töltöttük. A gélt polivinilidén-fluorid membránokra (Millipore, Billerica, MA) vittük át, és Western blot elemzésnek vetettük alá a szokásos protokoll szerint. Kecske poliklonális antitestje a HSV-1 timidin kináz (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia) és a HRP-vel jelölt szamár anti-kecske IgG (H + L; 1: 1000; Beyotime, Jiangsu, Kína) ellen. TK-termékek kimutatására használták. GAPDH ellen nyúl poliklonális antitestet (1: 1000, Sigma) és HRP-vel jelölt kecske anti-nyúl IgG-t (H + L; 1: 1000; Beyotime) alkalmaztunk, amelyet belső kontrollként alkalmaztunk.

Citotoxicitási vizsgálat

A HEK293 sejteket különböző TK konstrukciókkal transzfektáltuk phiC31 integráz hiányában. A transzfektált sejteket GFP expresszióval határoztuk meg, és a transzfekció után 48 órával FACS szerint rendeztük. A válogatott GFP-pozitív sejteket 96 lyukú lemezekre oltottuk 5,0x103 sejt/üreg sejtsűrűséggel. GCV-koncentrációkat (0, 0,01, 0,1, 1, 10 és 20 μg/ml) adtunk a transzfektált sejtekhez. 4 nap múlva a GCV ölő hatását WST-1 sejtproliferációs és citotoxicitási vizsgálati készlet (Beyotime) segítségével mértük a gyártó utasításainak megfelelően.

Áramlási citometriás elemzés

A transzfekció után 2 vagy 5 nap múlva minden TK fúziós konstrukcióval vagy TK fúziós konstrukcióval vagy TK fúziós konstrukcióval és a phiC31 mRNS-sel transzfektált 2 x 107 sejtet tripszinezéssel gyűjtöttünk be, és 2% FBS-t tartalmazó PBS-ben szuszpendáltuk újra. A sejteket ezután áramlási citometriával elemeztük a GFP expresszió meghatározásához. Az áramlási citometriás elemzést a BD FACSAria (BD Biosciences, San Jose, CA) alkalmazásával végeztük.

Rekombináns sejtáteresztő fehérje és fehérje transzdukció előkészítése

pET-28a (+) - His-TAT-Dre-NLS plazmidokat úgy állítottunk elő, hogy a TAT-Dre-NLS szekvenciát a His6 expressziós vektorba pET-28a (+) klónoztuk. A pET-28a (+) - His-NLS-TAT-Cre 20 és pET-28a (+) - His-TAT-Dre-NLS expressziós vektort használtuk az Escherichia coli BL21 (DE3) törzs transzformálására, külön az IPTG-indukálható expresszióhoz. a His-jelölt Cre és Dre fehérjék közül. A His-jelölt Cre és Dre fehérjék expresszióját és tisztítását a korábban leírt részletes protokoll szerint hajtottuk végre20. A fehérjekoncentrációkat BCA protein assay kit (Beyotime) segítségével mértük. A fehérje transzdukciós kísérletekhez 2 × 106 sejtet oltottunk egy 24 lyukú lemezre, és 24 órán át tenyésztettük. A sejtpermean fehérjéket szűréssel sterilizáltuk 0,22 μm-es szűrővel (Millipore). A sejteket 4 órán át inkubáltuk 100 μg/ml His-NLS-TAT-Cre és 100 μg/ml His-TAT-Dre-NLS fehérjéket tartalmazó táptalajban. Transzdukció után a sejteket PBS-sel mostuk, és további 72 órán át tenyésztettük normál táptalajban, mielőtt az áramlási citometriás elemzést elvégeztük.

Southern blot

Körülbelül 10 - 20 μg nem transzfektált sejtekből vagy stabilan transzfektált sejttelepekből származó genomi DNS-t emésztettünk BamHI és HindIII (New England Biolabs, Peking, Kína) éjszakán át, és agaróz gélelektroforézissel feloldottuk. A DNS-t átvittük, UV-keresztkötésnek vetettük alá egy Hybond N + nejlon membránon (Roche, South San Francisco, CA), és hibridizáltuk TK-szondával vagy DIG High Prime Labeling and Detection Starter Kit II segítségével előállított neo-próbával. (Roche). A primer szekvenciákat a következőképpen soroltuk fel: a TK próbához az 5'-CAGCAAGAAGCCACGGAAGT-3 '(előre) és az 5'-GCCCGAAACAGGGTAAATAACG-3' (fordított); neo-szondához: 5′-GGATTGCACGCAGGTTCTCCG-3 ′ (előre) és 5′-CGCCGCCAAGCTCTTCAGCAA-3 ′ (hátramenet).

Statisztikai analízis

Minden kísérletet legalább háromszor hajtottak végre. Az adatokat SPSS 20.0 (IBM Corporation, Somers, NY, USA) alkalmazásával elemeztük egyirányú ANOVA és legkevésbé szignifikáns különbségtesztekkel. Az adatokat átlag ± SEM értékként jelentették. P