absztrakt

Ez a munka közvetlen bizonyítékot mutat be arra vonatkozóan, hogy a bcl-2 gént transzkripciósan szabályozza a -B nukleáris faktor (NF-KB), és közvetlenül összekapcsolja a TNF-a/NF-KB jelátviteli utat a Bcl-2 expresszióval és annak válaszával az emberi túlélésre. prosztatarák sejtek. A DNáz I nyomai, a gél retardációja és a szupershift analízis egy NF-κB helyet azonosított a bcl-2 β2 promotorban. A minimális promóter összefüggésében ez a bcl-2 p2 1. hely a transzkripciót tízszeresére növelte a p50/p65 expressziós vektorok jelenlétében, összehasonlítva az NF-KB konszenzusos helyen megfigyelt növekedéssel, míg a teljes p2 promoter esetében, a régióban a transzkripciós régió aktivitása hatszorosára nőtt, az NF-κB expressziója, a hatás a bcl-2 p2 1. helyének mutációjával szűnt meg. A Bcl-2 expresszió az előrehaladott prosztatarák hormonrezisztens fenotípusával társult. Itt megmutattuk, hogy a humán prosztatarák sejtvonalában az LNCaP Bcl-2 expressziós szintjének növekedése, amelyet a hormon megvonására adott válaszként figyeltek meg, tovább fokozza a TNF-α kezelés, és ezt a hatást az NF-κB inhibitorok gyengítik. Ugyanakkor az LNCaP sejtekben végzett bcl-2 β2 promóterek vizsgálata a hormon hiányában a TNF-α-val való stimuláció után a promóter aktivitásának 40-szeres növekedését mutatja.

Az elmúlt néhány évben egyre több bizonyíték áll rendelkezésre arról, hogy az apoptózis jelátviteli útvonalak számos betegségben részt vesznek, beleértve a rákot is. Az apoptózis kulcsszereplője a Bcl-2 fehérjecsalád, amely felosztható akár anti-apoptózisra (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W, A1 és Mcl-1), akár pro-apoptózisra (Bax, Bid, Bad, Bak, Bic, Bok, Bcl-XS és Hrk) tagjai (áttekintve: Gross et al., 1999). Számos tanulmány azt sugallja, hogy ezen proapoptotikus és antiapoptotikus fehérjék relatív szintje egy sejtben meghatározza, hogy a sejt él-e vagy meghal-e az apoptotikus szignalizációra válaszul (Oltvai et al., 1993; Oltvai és Korsmeyer, 1994). Még mindig nem világos, hogy a Bcl-2 milyen módon nyújt védelmet az apoptózis ellen; azonban úgy gondolják, hogy közvetlenül vagy közvetve megakadályozza a citokróm c felszabadulását a mitokondriumokból, ami viszont megakadályozza az Apaf-1 és a downstream kaszpázok aktiválódását (Zou et al., 1997).

Asztal teljes méretben

A legújabb tanulmányok a Bcl-2 expresszióját összekapcsolják az előrehaladott prosztatarák hormonrezisztens fenotípusának kialakulásával (Colombel et al., 1993; McDonnell et al., 1992; Raffo et al., 1995). Most az is látszik, hogy a Bcl-2 expresszió megvédheti a prosztatarák sejtjeit számos különböző apoptotikus ingertől, például hormon ablációtól, sugárterápiától és kemoterápiától, beleértve a TNFα kezelést is (Apakama et al., 1996; Chaudhary et al., 1999; Huang et et. és mtsai., 1998, Mackey és mtsai., 1998). A Bcl-2 és az NF-κB kapcsolatát vizsgáló vizsgálatok a prosztatarák sejtjeiben a TNF-α által indukált apoptózis szabályozásában azt találták, hogy az NF-κB nukleáris export gátlása domináns-negatív IκB mutáns érzékeny sejtek által a TNF-α által indukált az apoptózis és az exogén Bcl-β 2 túlzott expresszió hatékonyan blokkolta ezt a hatást (Herrmann és mtsai, 1997). Ebben a tanulmányban a bcl-2 NF-κB általi transzkripciós szabályozását és annak jelentőségét vizsgáljuk az endogén Bcl-2 expresszió szempontjából humán prosztatarák sejtekben a TNF-α expozíció után.

az eredmény

Az NF-κB transzkripciós faktor kötőhely (ek) azonosítása a bcl-2 p2 promóterben rekombináns NF-κB1 alkalmazásával

Az NF-KB transzkripciós faktor kötőhely (ek) helyét a bcl-2 promoter régióiban DNáz I lábnyomelemzéssel azonosítottuk tisztított rekombináns p50 fehérje (NF-KB) alkalmazásával (1. ábra). A védelmet egyértelműen megfigyelték a bcl-2 p2 promóter egyik régiójában (1. hely) (1. ábra, 2. sáv), és ennek a megfigyelésnek megfelelően a régió szekvenciája azt találta, hogy az NF- κB konszenzus szekvencia (1. táblázat). Egy kevésbé meggyőző második helyet (a helyet) is azonosítottak, de ebben a régióban csak a konszenzus szekvenciával találtak gyenge egyezést (1. táblázat, amelyet 2. helynek neveznek). A bcl-2 p1 promoter régiójában nem észleltünk nyomokat (az adatokat nem mutatjuk be).

szerepe

A bcl-2 β2 promoter DNF-I elemzése NF-κB rekombináns fehérjével. Az 5'-véggel jelölt p2 DNS-fragmenst inkubáltuk DNAS emésztés előtt (1. sáv) vagy rekombináns p50 jelenlétében (2. sáv). A nem kapcsolódó DNS-szekvencia (markerek) az 1. sáv szomszédságában található, és az 1. és az NF-KB hely felkutatására használták. láb. A nyilak jelzik a védett régiók helyét. Az autoradiográf egy reprezentatív kísérletet mutat

Teljes méretű kép

Rekombináns NF-kB1 fehérjével végzett bcl-2 p2 promoter szabályozó régiók gél retardációja és komplex szupershift analízise 33 P-jelölt kettős szálú oligonukleotid szondát elemeztünk a bcl-2 p2 1. helyről (4. és 5. sáv), a 2. helyről (6. és 7. sáv) és az NF-KB konszenzusról (1., 2., 3., 8. és 9. sáv). rekombináns p50 gél retardációs és szupershift komplexek kialakítására való képességük miatt. A nyúl anti-p50 antitestet (Calbiochem-Novabiochem Corp.) az elemzett kivonattal inkubáltuk a jelzésnek megfelelően. A kettős szálú oligonukleotid jelöletlen NF-κB konszenzus szekvenciáját versenyzőként alkalmaztuk az 1. sávban, a 8. és 9. sávban pedig egy, a hepatocita versengés nem jelölt, kompetitív nukleáris faktorát (HNF-3) adtuk hozzá. a megfigyelt komplex. A kölcsönhatás specificitásának tesztelésére egy kétszálú szekvencia konszenzust is jelöltek, amelyet cAMP válaszelemként (CRE) jelöltek meg. Az autoradiográf egy reprezentatív kísérletet mutat

Teljes méretű kép

Az NF-κB promóter feltételezett bF1-2 p2 kötődési helyével kölcsönhatásba lépő, TNF-α-val kezelt LNCaP vagy WEHI 231 sejtek sejtjeinek DNS-kötő fehérjéinek jellemzése.

Teljes méretű kép

Az anti-sp1 irreleváns antitesttel nem figyeltek meg túlcserélt komplexeket (az adatokat nem közöljük). Így ez az anti-p65 és anti-p50 antitestekkel végzett szupershift elemzés további fizikai bizonyítékot szolgáltat arra vonatkozóan, hogy a bcl-2 p2 1. hely valóban megköti az NF-KB komplexeket.

Az NF-κB transzkripcióját a bcl-2 p2 promoterből a bcl-2 p2 hely közvetíti.

Az NF-kB promóter feltételezett bcl-2 p2 helyeinek funkcionális elemzése a minimális promoter összefüggésében. A vizsgált konstrukciók konszenzusos NF-KB szekvenciát (KB), bcl-2 p2 1. helyet (1. hely) és bcl-2 p2 2. helyet (2. hely) tartalmaznak a pTATA minimális promóter konstrukcióba klónozott kettős szálú oligonukleotidokat (lásd a sémát). felül). A konstrukcióban lévő oligonukleotid kópiaszámát zárójelben tüntettük fel a konstrukciók nevében. A Hela S3 sejtekben a konstrukciók relatív aktivitását exogén módon expresszált p50/p65 (NF-KB) jelenlétében (+) és (-) vizsgálva vizsgáltuk a pCMVp50 és pCMVp65 expressziós vektorok alkalmazásával. A transzkripciós aktivitásokról a pNF-KB konstrukcióhoz (2) képest NF-KB jelenlétében számolunk be, amelyet 1,0 relatív aktivitású receptornak nevezünk. A transzfekció hatékonyságának korrigálására PRL-TK-t használtunk. Ezek az eredmények három külön kísérlet átlagát jelentik, és a hibasávok a szórást mutatják

Teljes méretű kép

A bcl-2 p2 promóter transzkripciójának transzfektálása NF-KB által, és ennek a hatásnak a feltételezett 1. hely hely-irányú mutagenezisével történő megszüntetése. A p2LUC konstrukciók tartalmaznak egy bcl-2 p2 promoter szekvenciát -754 és +1 között, közvetlenül a ′ A promotermentes luciferáz promoter gén (LUC) nélkül alapban (Promega) úgy, hogy a bcl-2 p2 promoter irányítsa a LUC gén expresszióját. A mutált 1. vagy 2. helyet tartalmazó p2M1LUC és p2M2LUC plazmidokat a p2LUC-ból állítottuk elő a GeneEditor hely-irányított mutagenezis készlet (Promega) segítségével. A Hela S3 sejtekben a konstrukciók relatív aktivitását exogén módon expresszált p50/p65 jelenlétében (+) és hiányában (-) vizsgáltuk a pCMVp50 és pCMVp65 expressziós vektorok alkalmazásával. A transzkripciós aktivitásokról a p2LUC konstrukcióhoz viszonyítva számoltak be NF-KB hiányában, amelynek relatív aktivitása 1,0-re utal. A transzfekció hatékonyságának korrigálására PRL-TK-t használtunk. Ezek az eredmények négy külön kísérlet átlagát jelentik, és a hibasávok a szórást mutatják

Teljes méretű kép

TNF-α kezelés és Bcl-2 expresszió humán prosztatarák LNCaP sejtekben

A hormonfelvételre adott válasz fokozott Bcl-2 expressziója tovább nő a TNF-a jelenlétében. Az LNCaP humán prosztatarák sejtjeit 10% szérumot tartalmazó aktív tápanyagban tenyésztettük aktív szén elfogyasztását (+ H) vagy (-H) hormon (0,5 nM 6α-fluorotesztoszteron) jelenlétében vagy éjszakán át, mielőtt NF-κB és/vagy TNF-β inhibitorok: a. Az inhibitorokat (Bay 11-7082 [10 μM] és a sejteket áteresztő NF-KB gátló peptid [100 mg/ml] vagy a sejteket áteresztő NF-KB kontroll peptideket (100 mg/ml) 15 napig inkubáltuk a sejtekkel. min. 37 ° C-on, mielőtt hozzáadnánk TNF-a-t (10 ng/ml). Az inkubálást 37 ° C-on további 6 órán át folytattuk a sejtek lízise és a fehérje-analízis (100 μg) előtt Bcl-2 elleni immunblottozással. Ugyanezt a terhelést Ponceau S oldattal (Sigma Chemical Co) festéssel igazoltuk

Teljes méretű kép

A bcl-2 p2 promóter transzkripciójának transzaktiválása LNCaP sejtekben a hormonelvonás és a TNF-α stimuláció hatására

A hormonelvonás és a TNF-α stimuláció bcl-2 p2 promóter aktivitására gyakorolt ​​hatásának vizsgálatához LNCaP sejtekben tranziens transzfekciós kísérleteket végeztünk a p2 promoter konstrukció (p2LUC) alkalmazásával, amely a teljes hosszúságú bcl-2 p2 promotert tartalmazza a nyálkahártya luciferáz génje. 7A. ábra). A transzkripciós aktivitásokat összehasonlítjuk a p2LUC konstrukcióval TNF-α (-TNF-α) hiányában és egy hormon (+ hormon) jelenlétében, amelyet 1,0 relatív aktivitású receptornak jelölünk.

Teljes méretű kép

Megállapították, hogy a hormonfelvétel 8-szorosára növeli a β2 promóter transzkripciós aktivitását, és a TNF-α hormonhiányos kezelése drámai módon fokozza a promoter aktivitását, 40-szeresére növeli a p2LUC-t TNF-α hiányában és jelenlétében. a hormon. (A pázikus kontroll vektor elhanyagolható aktivitást mutatott minden körülmények között). Ezek az eredmények megerősítik az LNCaP sejtekben a Bcl-2 fehérje expressziójára kapott eredményeket. Annak további bizonyítása érdekében, hogy a bcl-2 p2 promoter transzkripcióját az LNCaP sejtekben a hormonfelvételre és a TNF-a stimulációjára reagálva az NF-KB közvetíti, a bcl-2 p2 promoter transzkripciós aktivitását ilyen körülmények között értékelték . és az LNCaP sejtek együttes transzfektálása után a domináns negatív pCMV IκB konstrukcióval (Upstate Biotechnology). Ez a vektor nem foszforilálható, nem lebontható IκB-t expresszál (7B. Ábra). Az itt közölt eredmények azt mutatják, hogy a bcl-2 β2 promóter transzaktivációját a TNF-a-aktivált LNCaP sejtekben gátolja az NF-kB jelátvitel ablációja. Összességében ezek az adatok arra utalnak, hogy a TNF-α/NF-κB útvonal meghatározó szerepet játszik a prosztatarák sejtjeiben a bcl-2 transzkripciós szabályozásában a p2 promoter révén.

A $ config [ads_text16] nem található

vita

Anyagok és metódusok

Sejtkultúra, transzfekciók és luciferáz vizsgálatok

Az éretlen B-sejtvonalat, a WEHI 231-et és az emberi nyaki karcinóma sejtvonalat, a Hela S3-at (ATCC) fenntartottuk Dulbecco módosított Eagle-táptalajában (DMEM), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal és 0,45% -os glükózzal (Gibco Laboratories). 37 ° C-on, 5% CO 2/levegőben. A WEHI 231 sejteket 50 μM β-merkaptoetanollal egészítettük ki, ahogy azt másutt leírták (McCormack et al., 1984). A kezelés előtt a WEHI 231 sejteket 3,5x105 sejt/ml sűrűségűre hígítottuk friss tápközeggel, és 5 órán át inkubáltuk. Az emberi prosztata karcinóma sejtvonalat, az LNCaP-FGC-t (ATCC), amelyet ebben a jelentésben LNCaP-ként emlegetnek, RPMI-1640-ben tenyésztették, 10% magzati szarvasmarha-szérummal vagy magzati szénmentes magzati szarvasmarha-szérummal (Gemini Bioproducts) kiegészítve, amely 10 szarvasmarha-magzati szérum%. 50 egység/ml penicillin és 50 ug/ml sztreptomicin.

A transzfekciókat 6 lyukú lemezeken hajtottuk végre, a fentiek szerint (Graham és van der Eb, 1973; Sorge és mtsai, 1984). A transzfektált DNS-keverék 5 μg házi légi LUC plazmidot tartalmazott (lásd alább a klónozási és mutagenezis részt) és 250 ng pRL-Tk-t (Promega), amely belső kontrollként szolgált a transzfekció hatékonyságához. A pRL-TK a herpes simplex vírus timidin-kináz promóterének felhasználásával szabályozza a renilla luciferáz (RL) gén expresszióját. Adott esetben a DNS-keverék tartalmazott 100-250 ng NF-KB expressziós vektort (pCMV-p50 és pCMV-p65), a pCMV-PA kontrollvektort (nagyvonalú ajándék az LR Faust-tól) vagy IκB domináns negatív pUSE-IκB cDNS-t is (S32A/S36A) (Upstate Biotechnology). A sejtkivonatokat 48 órával a transzfekció után készítettük el, és a stop és glo kit (Promega) alkalmazásával, a gyártó utasításainak megfelelően, megvizsgáltuk a sáska és renilláris luciferáz aktivitást.

Klónozás és mutagenezis

Kivonatok magokból és teljes sejtekből

Nukleáris kivonatokat készítettünk LNCaP-ból vagy WEHI 231-ből lényegében a leírtak szerint (Prösch et al., 2000). A sejteket TNF-a-val (50 ng/ml) (Sigma) kezeltük 2 órán át 37 ° C-on egy éjszakán át, mielőtt kivonatokat készítettünk. Az LNCaP sejtkivonatokat lényegében a máshol leírtak szerint állítottuk elő (Miyake et al., 1998). A Bcl-2 expressziós analízishez a sejteket 10% szérumot tartalmazó aktív tápközegben inkubáltuk, aktív szén nélkül, hormon (0,5 nM 6α-fluor-tesztoszteron) jelenlétében vagy hiányában egy éjszakán át, mielőtt NF-KB inhibitorokat és/vagy TNF-a-t adtunk volna hozzá. Az inhibitorokat (Bay 11-7082 gátló peptid vagy NF-KB) vagy a kontroll peptidet (mindegyik a Biomol cégtől származik) 15 percig inkubáltuk sejtekkel 37 ° C-on, mielőtt TNF-a-t (10 ng/ml) adtunk volna hozzá. Az inkubálást 37 ° C-on további 6 órán át folytattuk, majd a sejteket lizáltuk és immunblottolással elemeztük.

Immunblot elemzés

A Bcl-2 expressziót lényegében másutt vizsgáltuk (Miyake és mtsai., 1998). A 100 μg fehérjét tartalmazó mintákat SDS-PAGE-nak vetettük alá, és nitrocellulóz membránra vittük. A szűrőket 5% sovány tejport tartalmazó PBS-ben blokkoltuk szobahőmérsékleten 1 órán át, majd 3 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk anti-bcl-2 egér monoklonális antitest 1: 100 hígításával (Santa Cruz, CA, USA). A membránokat ezután 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk lúgos foszfatázzal konjugált anti-egér IgG antitesttel (Caltag), és a specifikus fehérjéket kolorimetriás rendszerrel (BCIP/NBT) tettük láthatóvá a gyártó utasításainak megfelelően (Biorad). Ugyanezt a terhelést Ponceau S festéssel igazoltuk (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA).

DNáz I lábnyom, elektromobilitás géleltolódás és szupershift tesztek

A lábnyomreakciókat a DNáz I-vel az előzőekben leírtak szerint hajtottuk végre (Briggs és mtsai., 1986; Johnson és mtsai., 1995). A reakciók 1-5 ng véggel jelölt DNS-fragmenst tartalmaztak 100 μl 10 mM Trisz-hidrokloridot (pH 7,9), 50 mM KCl, 0,5 mM EDTA, 1 m D DTT, 0,5 m M PMSF tartalmazó 100 μl reakcióelegyben. % (v/v) glicerin, 1 μg poli [d (IC)] és tisztított p50 (Promega). A kötést 15 percig 0 ° C-on, majd 2 percig végeztük, majd 100 μl 1% (w/v) NaDodS04, 20 mM EDTA, 200 mM NaCl 250 μg/ml hozzáadásával leállítottuk. tRNS. Az elegyet ezután fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és 6% -os karbamid-akrilamid gélelektroforézissel és autoradiográfiával elemezzük.

köszönöm

Ezt a munkát részben támogatta az USPHS AI-44434 támogatás, a Stein Alapítvány és a Skaggs Education Grant. Ezúton szeretnénk köszönetet mondani Julia M Ruediának a technikai segítségért és Carol Fedoryszynnek a kézirat elkészítésében. A PC Atterton technikai írási szolgáltatásokat nyújtott.