ghrelin

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • A ghrelin-GOAT rendszer cirkadián szabályozása egerekben
  • A ghrelin-GOAT rendszer cirkadián szabályozása egér ghrelinoma sejtvonalban
  • vita
  • mód
  • vadállat
  • Kísérleti tervezés: a ghrelin cirkadián szabályozása WT és Bmal1-KO egerekben
  • Sejtkultúra, szérum sokk és stimulációs kísérletek
  • Kísérletek alacsony RNS interferenciával
  • Ghrelin RIA
  • Kvantitatív valós idejű PCR
  • immunhisztokémia
  • Statisztikai analízis
  • További részletek
  • Hozzászólások

elemeket

absztrakt

A Ghrelint, egy 28 aminosavú bélpeptidet 1999-ben azonosították az 1A típusú növekedési hormon szekretagóg receptorának endogén ligandumaként. A ghrelin poszttranszlációs oktanilezését Serine-3-vá, amelyet a ghrelin-O-aciltranszferáz (GOAT) enzim katalizálja, elengedhetetlennek tartják a biológiai aktivitása szempontjából. Mindazonáltal az oktanoil-ghrelin az összes keringő ghrelin csak körülbelül 10% -át teszi ki, míg a fennmaradó 90% nem acilezett 4. A felfedezést követő években a ghrelin nemcsak a növekedési hormon felszabadulását közvetíti, hanem más alapvető fiziológiai funkciókat is szabályoz. A Ghrelin növeli az ételbevitelt azáltal, hogy stimulálja az orexigén neuropeptidek, az agouti-rokon peptid (AgRP) és az Y neuropeptid (NPY) felszabadulását az 5. hipotalamusz ívének magjából, ezért fiziológiás ételindítónak számít. Ezenkívül stimuláló hatást gyakorol az adipozitásra és a gyomor motilitására, és fontos közvetítője a glükóz homeosztázisnak 6, 7. A ghrelin egyéb fiziológiai funkciói közé tartozik a sejtproliferáció, az immunrendszer, a porc és a csont homeosztázisának modulálása, az alvás, az emlékezet és a viselkedési hatások.

Több mediátor együttes hatása miatt a plazma ghrelin szintje a nap folyamán folyamatosan ingadozik. A táplálkozási állapot az endogén ghrelin felszabadulás első és jól dokumentált szabályozója. Rágcsálóknál a keringő ghrelin szintet a 8., 9. éhezés növeli, és ismételt adagolással 9 elnyomja. Hasonlóképpen, a plazma ghrelinszintje egészséges önkéntesekben körülbelül egy órával a rendszeresen időzített étkezés előtt emelkedik, majd hirtelen csökken 10. Az éhgyomorra kiváltott plazma ghrelin szint növekedése a vegetatív idegrendszer 11, 12, 13 kolinerg és adrenerg karjaitól függ, míg a ghrelin szint étkezés utáni szuppresszióját a kalóriatartalom és a 14, 15 tápanyagok típusa közvetíti, bár nem teljesen Úgy gondolják, hogy a tápanyagok érzékelését elsősorban az enteroendokrin sejtekben jelen lévő különféle ízreceptorok, köztük a gyomor ghrelin sejtjeinek 16, 17, 18, 19 aktiválása közvetíti. .

A tanulmány célja a génfunkció jelentőségének vizsgálata volt az órák számára a ghrelin expresszió és szekréció cirkadián ritmusában. Először a Bmal1 nukleáris óra gén genetikai deléciójának hatását vizsgáltuk a plazma és a gyomor ghrelin szintjének 24 órás ingadozására és a GOAT expressziójára egerekben. Másodszor azt vizsgáltuk, hogy a ghrelin-szekretáló sejtek képesek-e FEO-ként működni, az éhgyomorra vagy a cue-etetésre gyakorolt ​​hatások tanulmányozásával, mint a cirkadián ritmus kiváltó tényezői a ghrelinoma sejtvonalban.

az eredmény

A ghrelin-GOAT rendszer cirkadián szabályozása egerekben

A WT egerek tipikus éjszakai viselkedést mutattak, és táplálékuk nagy részét a sötét ciklus alatt fogyasztották el (1a. Ábra). A táplálékfelvétel a Zeitgeber (ZT) 8-szorosa óta növekedni kezdett, és a ZT 21-nél elérte a legmagasabb szintet, amely meghatározza a ritmusos akrofázist. Mivel az ételbevitelt az agouti-rokon orexigén peptid (AgRP) felszabadulása stimulálja az ívmagból, meghatározott neuropeptid hipotalamusz mRNS mRNS expressziós szintje. Az AgRP mRNS expressziójának cirkadián ritmusának akrofáza (ZT 21) (periódus 23 óra, P

( a ) Táplálékbevitel, ( b ) az AgRP mRNS expressziójának hipotalamusz relatív szintje, ( c ) az oktanoil-ghrelin és ( d ) a teljes plazma ghrelinszintek WT vagy Bmal1-KO egerekben ad libitum. ( e, f ) Relatív ghrelin expressziós szintek ( e ) és a Kecske ( f ) mRNS a WT vagy Bmal1-KO egerek gyomrában (n = 7-8 egér/idõpont/genotípus). A világos és a sötét fázist fehér és szürke árnyékolja. (AU = bármely egység).

Teljes méretű kép

WT egerekben az oktanoil-ghrelin plazmakoncentrációi cirkadián módon oszcilláltak (23 óra; P

( a - f ) WT egerekben az oktanoil-ghrelinre festett korpusz szakaszok reprezentatív szakaszai ( a - c ) vagy Bmal1-KO ( d - f ) a ZT 8-ban ( a, d ), ZT 12 ( lenni ) és a ZT 20 ( c, f ). g ) A negatív kontroll szakasz képe primer antitestek nélkül. ( h ) Az oktanoil-ghrelin/mm2 esetén immunreaktív sejtek száma én ) az oktanoil-ghrelin festés intenzitása a WT vagy Bmal1-KO egerek korpusz részein (n = 3 egér/idõpont/genotípus). A világos és a sötét fázist fehér és szürke árnyékolja. (AU = bármely egység).

Teljes méretű kép

A gyomor mRNS ghrelin expressziós szintjének cirkadián oszcillációit WT egereknél is megfigyelték (20 órás periódus, a P 29 robusztus oszcillációkat indukált az összes gén mRNS transzkripciós felhalmozódásában az órák kivételével (3. ábra).

Relatív mRNS expressziós szintek ( a ) Bmal1, ( b Óra, ( c ) Cry1 és Cry2, ( d ) Per1 és Per2, ( e ) Per3 a ( f ) Rev-erb-α az MGN3-1 ghrelinoma sejtekben, válaszként a szérum sokk szinkronizálására. (AU = bármely egység).

Teljes méretű kép

Továbbá megvizsgáltuk, hogy a ghrelin szekréció cirkadián ritmust követ-e a ghrelin felszabadulását közvetítő vegyületek stimulációjára üres gyomorban (L-epinefrin) vagy telítettségben (pepton, aminosavak és peptidek keveréke). Erre a célra a szérum sokkos sejteket 4 óránként 3 órán át inkubáltuk ezekkel a vegyületekkel. A bazális oktanoil-ghrelin szekréció (vivőanyag-kezelés) nem mutatott cirkadián ritmust, szemben a teljes ghrelin-szekrécióval (26 órás periódus, P

Ebben a tanulmányban elsőként bizonyítottuk, hogy az óramag Bmal1 génjének genetikai törlése nemcsak a ghrelin szignalizáció cirkadián ritmusát, és ezáltal az étkezés bevitelének cirkadián ritmusát szünteti meg, hanem gyengíti a ghrelin és a GOAT abszolút termelését is mRNS. Meggyőző bizonyítékokat szolgáltatunk továbbá arról, hogy nagyobb óra hiányában az étellel kapcsolatos jelek molekuláris órát vonhatnak be a gyomor ghrelin-szekretáló sejtjébe és szabályozhatják a ritmikus ghrelin szekréciót. Ezenkívül az oktanoil és az étellel együtt a peptonra leadott teljes válaszreakciók, valamint a GOAT ritmikus expressziója, de a ghrelinoma sejtekben a ghrelin mRNS nem, azt sugallják, hogy egy olyan ghrelin sejt, mint a FEO, nemcsak a cirkadián ghrelin ritmust szabályozza, hanem talán még jobban is ami a Kecskéből származik.

WT egereken végzett in vivo vizsgálatunk megerősíti a korábbi megfigyeléseket, miszerint a ghrelin plazmaszintjei cirkadián módon oszcillálnak, és a 20, 21, 22, 23 test inaktív fázisában érik el a maximális szintet. A ghrelin és a GOAT mRNS ZT4-ben történő felhalmozódásának növekedése arra utal, hogy a cirkadián rendszer megjósolta a ghrelin felszabadulását a ZT 8-ban, feltehetőleg ezeknek a géneknek a ritmusát okozva az E-box elemek révén a promoter régióikban Az immunreaktív sejtek száma 24 órán át állandó maradt, ami azt jelzi, hogy normális körülmények között az összes gyomor ghrelin sejt is hozzájárul ennek a peptidnek a kiválasztódásához. Továbbá a ghrelin festés intenzitása antifázisban fordult elő a plazma ghrelin szinttel, ami hangsúlyozza, hogy a gyomor szolgál a keringő ghrelin 32, 33, 34 fő forrásaként .

Annak ellenére, hogy növekszik a kalóriabevitel, a Bmal1-KO egerek testtömege szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a WT kontrolloké. Számos tanulmány kiemelte, hogy a cirkadián óra gének deléciója egerekben drasztikusan megváltoztathatja a testtömeget és a testösszetételt 37, 38, 39, 40. A jelentések szerint a Bmal1 döntő szerepet játszik az adipogenezis és a lipid metabolizmus szabályozásában 41, 42. A Bmal1-KO egerek csökkenő zsírtartó képessége megmagyarázhatja, hogy a táplálékfelvétel növekedése miért nem társult a testtömeg növekedésével.

Érdekes, hogy az in vivo vizsgálatunkkal ellentétben az MGN3-1 sejtekben a ghrelin mRNS expressziója cirkadián módon oszcillál, ami arra utal, hogy az in vivo ghrelin mRNS szintekben megfigyelt ritmushoz külső input szükséges. A ghrelinnel ellentétben a tenyésztett sejtekben a GOAT mRNS expressziója cirkadián mintát mutatott, ami arra utal, hogy ennek az enzimnek a ritmusa a fő órától függetlenül szabályozott.

Az eredmények értelmezését bonyolította az a megfigyelés, hogy a felhasznált ingerekre reagálva a teljes ghrelin szekréció mintázata nem mindig egyezik meg az oktanoil-ghrelin mintázatával. Míg a HEPES puffer nem váltott ki ritmust az oktanoil-ghrelin szekréciójában, a teljes ghrelin szekrécióban igen. Ezzel szemben a pepton ellenkezőjét figyelték meg, az oktanil-csoportban a ritmusosság detektálódott, a teljes ghrelin-szekrécióban azonban nem. Ezenkívül az L-adrenalin ritmusosságot tudott kiváltani a ghrelin mindkét formájában. Ezekkel a különbségekkel nem jártak a ghrelin vagy a GOAT mRNS expressziós mintázatának változásai. Nem zárhatjuk ki azonban, hogy ezek az etetési vagy éhomi tünetek megváltoztatták a fehérje szintjét vagy befolyásolták a GOAT enzim aktivitását. A jövőbeni vizsgálatoknak tovább kell vizsgálniuk, hogy a ghrelin jelátvitel cirkadián szabályozását valóban képes-e közvetíteni ennek az egyedülálló oktanoilező enzimnek az aktivitása vagy a fehérje szintjének időbeli különbsége.

Ezek az eredmények együttesen azt sugallják, hogy a ghrelin-szekretáló gyomorsejtek molekuláris órái nemcsak a ghrelin, hanem a GOAT aktivitását is szabályozzák, reagálva a különféle étellel kapcsolatos ingerekre. Továbbá azt sugallják, hogy a ghrelin szekréciójának szabályozása még bonyolultabb, mint azt eredetileg gondolták, éhgyomorra és étkezés után is. További vizsgálatokra van szükség az alapul szolgáló mechanizmusok további azonosításához.

A ghrelinoma sejtek Bmal1-specifikus siRNS-sel történő transzfekciója nem változtatta meg a ghrelin-szekretáló sejtek peptonra vagy L-epinefrinre gyakorolt ​​szekréciós válaszát. Tekintettel arra, hogy mindkét inger cirkadián mintát tudott kiváltani az MGN3-1 sejtek szekréciós válaszában, és hogy a Bmal1-KO egereknél hiányzott a cirkadián ritmus a ghrelin felszabadulásában, ez inkább ellentmondásos megállapítás volt. A Bmal1 siRNS által közvetített leütését azonban szérum sokk elnyomhatta. A sejt cirkadián órájának szinkronizálásához szükséges magas szérumkoncentrációk stimulálhatják a sejtek növekedését és osztódását, ezáltal megzavarva a leütési folyamatot. Másrészt a legújabb tanulmányok azt sugallják, hogy az órahálózat az egyszerű redundancia helyett aktív kompenzációs mechanizmusokat használ, hogy genetikai kiegyensúlyozó rendszerként működjön az óra működésének fenntartása érdekében, amikor genetikai és környezeti rendellenességekkel szembesülnek 52, 53. A Bmal1 leütését tehát a cirkadián rendszer más komponensei befolyásolhatják, biztosítva ezzel a molekuláris óra ellenállását.

Összefoglalva: ez a tanulmány hangsúlyozza a Bmal1 nukleáris óra gén fontosságát a ghrelin cirkadián ritmusában, és ezáltal az étel bevitelének cirkadián ritmusában. Az a megállapítás, hogy a gyomor-ghrelin-szekretáló sejt endogén cirkadián szekréciós választ mutat az élelmiszerekkel kapcsolatos jelzésekre, hangsúlyozza az élelmiszer-fogyasztás időzítésének fontosságát a ghrelin-felszabadulás meghatározásában. Továbbá, mivel a cirkadián rendszer úgy tűnik, hogy a GOAT oktanoilező enzim révén is kontrollálja a ghrelin jelátvitelt, ezek az eredmények rávilágítanak az egyedi enzim szerepének további jellemzésére és a GOAT aktivitás farmakológiai modulátorainak fejlesztésére.

mód

A Bmal1-heterozigóta egerek tenyészpárjait R. Lijnen (KU Leuven, Leuven, Belgium) kérte. Az összes KO egeret és WT almaikat egy Leuven KU állati létesítményben helyezték el, és az összes farok genomi DNS-en végzett PCR-analízissel genotipizálták őket. Az egereket szabályozott hőmérsékletű környezetben (20-22 ° C) helyeztük el 12 óra/12 óra fény/sötét ciklusban (ahol a ZT 0 a hagyományos fénykapcsoló), és ad libitum hozzáférést kaptak az ételhez és az ivóvízhez. Valamennyi kísérletet a Leuveni KU állatkísérletekkel foglalkozó etikai bizottsága hagyta jóvá, és a jóváhagyott irányelveknek megfelelően hajtotta végre.

Kísérleti tervezés: a ghrelin cirkadián szabályozása WT és Bmal1-KO egerekben

A 12-16 hetes WT és Bmal1-KO egereket (50% hím és 50% nőstény) 24 órán át 4 órás időközönként feláldoztuk. A vért szívpunkcióval vettük fel, és feldolgoztuk a ghrelin meghatározásához. A hipotalamust összegyűjtöttük, RNS-anyagban (Qiagen, Hilden, Németország) tároltuk és valós idejű PCR-re dolgoztuk fel. A gyomrot egy nagyobb ív mentén nyitották ki. A csíkot függőlegesen, felülről lefelé, a gyomor közepére vágtuk, RNAlaterben tároltuk és valós idejű PCR-re dolgoztuk fel. A gyomor bal részét azonnal rögzítettük az immunhisztokémia szempontjából.

Sejtkultúra, szérum sokk és stimulációs kísérletek

MGN3-1 54 ghrelinoma sejteket tenyésztettünk DMEM-ben, kiegészítve 10% marha-magzati szérummal (FBS) és 1% penicillin (100 E/ml) és sztreptomicin (100 mg/ml) (P/S) keverékével 37 ° C-on. 5 ° C-on,% CO 2. A sejteket a következő szérum sokkos eljárással szinkronizáltuk. Az oltás után egy nappal a táptalajt szérummentes DMEM-re cseréltük. 12 óra elteltével ezt a táptalajt 2 órán át szérumban gazdag tápközeggel (DMEM + P/S, 50% lószérummal kiegészítve) helyettesítettük. A sejteket ezután DMEM + 2% FBS-sel szélesztettük a stimulációig. Hat különböző időpontban, 24 óra alatt, a szinkronizált sejteket 3 órán át inkubáltuk vivőanyagban (HEPES puffer), 3% peptonban (kazein enzimatikus hasítása, Sigma (St. Louis, MO, USA) vagy 5 μM L-adrinein (Sigma) A sejtek felülúszóját ghrelin radioimmunassay-re (RIA) dolgoztuk fel az alábbiakban leírtak szerint, és a sejteket valós idejű PCR-re dolgoztuk fel.

Kísérletek alacsony RNS interferenciával

A Bmal1 szekvenciát megcélzó négy előre tervezett siRNS keverékét a GE Healthcare-től vásároltuk. Négy siRNS konstrukció keverékét, amelynek célja az emberi, egér vagy patkány nem ismert génjeinek megcélzása (nem célzott siRNS csoport, GE Healthcare), negatív kontroll siRNS-ként alkalmazták a mellékhatások detektálására. A sihr ghrelinoma sejtek (25 nM) transzfekcióját interferonnal végeztük (Polyplus transzfekció). 48 óra elteltével a sejteket szérum sokk szinkronizálásnak vetették alá (a fent leírtak szerint), és 16 órán át DMEM + 2% FBS-sel helyezték el. A szinkronizált sejteket ezután 3 órán át inkubáltuk vivőanyagban (HEPES puffer), 3% peptonban vagy 5 μM L-epinefrinben. A transzfekció hatékonyságát valós idejű PCR-rel határoztuk meg. A sejt felülúszót ghrelin RIA -vá dolgoztuk fel.

Ghrelin RIA

A ghrelinoma sejtekből származó sejtrétegeket vagy plazmamintákat megsavanyítottuk (10% HCl), Sep-Pak C18 oszlopon extraháltuk és vákuumban szárítottuk. Az oktanoil-ghrelin vizsgálatot a 19. korábbiakban leírtak szerint végeztük, 125 g [Tyr24] humán ghrelin marker [1-23] és nyúl anti-humán ghrelin antitest [1-8] felhasználásával, amelyek nem ismerik fel a nem acilezett grelint. A teljes ghrelin meghatározásához nyúl anti-humán ghrelin antitestet [14-28] alkalmaztunk, amely felismeri az oktanoil- és a nem acilezett grelint.

Kvantitatív valós idejű PCR

A teljes RNS-t a Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Németország) alkalmazásával izoláltuk, és a SuperScript II reverz transzkriptáz segítségével (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) reverz transzkripciót cDNS-be. Valós idejű kvantitatív PCR-t a fent leírtak szerint végeztünk 55. A primer szekvenciákat az 1. táblázat mutatja. A relatív expressziós szinteket a GAPDH-hoz viszonyítva fejeztük ki, és korrigáltuk a futtatások közötti változékonyságra.

Asztal teljes méretben

immunhisztokémia

A gyomorszöveteket (3 egér/genotípus/idõpont) 4% paraformaldehiddel rögzítettük 2 órán át (4 ° C), majd egy éjszakán át krioprotektálást végeztünk 30% szacharózban 4 ° C¹on. A kriosztátos szakaszokat (6 μm) 2 órán át inkubáltuk 0,1% PBS-ben, amely 10% szamár szérumot és 0,3% Triton X-100-at tartalmazott, majd nyúl antioktanoil-ghrelinnel (Ab5044, házon belül kifejlesztve) inkubáltuk 4 ° C-on egy éjszakán át. A nem-specifikus kötődés vizsgálatához nem vontunk be elsődleges antitestkontrollt. Mosás után a metszeteket szamár anti-nyúl Alexa488-mal (Santa Cruz Biotechnology) inkubáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten. A metszeteket Citifluor-ban szereltük fel, és fluoreszcens mikroszkóp alatt (Olympus BX41) tettük láthatóvá. Minden gyomor két szakaszát elemeztük a Cell ^ F képalkotó szoftverrel (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, Németország). A ghrelin-pozitív sejtek számát 4 véletlenszerűen kiválasztott mezőben számoltuk (20 ×). A festés intenzitását kiszámítottuk, és szürkeértékként fejeztük ki 0 (legsötétebb képpont) és 0,655535 (legfényesebb képpont) között.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. A cirkadián ritmusanalízist a szabad Cosinor szoftver (2.3 verzió) segítségével végeztük, amely Nelson és munkatársai által leírt módon a cosinor eljárás segítségével kiszámítja az adatkészlet cirkadián periódusát. 1979-ben 56. Az összes többi adatot a Statistica 11 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA) segítségével elemeztük. A Student t-tesztjét két független csoport közötti különbségek kimutatására végeztük, amikor egy- vagy kétirányú ANOVA-t alkalmaztunk több csoport összehasonlítására. A jelentőséget 5% -os szinten fogadták el.

További részletek

Hogyan lehet idézni ezt a cikket: Laermans, J. és mtsai. A Bmal1 óra gén és a gyomor ghrelin szekretáló sejt szerepe a ghrelin-GOAT rendszer cirkadián szabályozásában. Sci. ismétlés. 5., 16748; doi: 10.1038/srep16748 (2015).

Hozzászólások

Megjegyzés benyújtásával elfogadja az Általános Szerződési Feltételeinket és a közösségi irányelveket. Ha bármi sértőnek vagy összeegyeztethetetlennek tűnik a feltételeinkkel vagy irányelveinkkel, jelölje meg nem megfelelőként.