elemeket
absztrakt
Ehhez a tanulmányhoz a már megszokott PAS paradigmánkat (szagló kondicionáló eljárással) használtuk fel a CB1 receptor szignalizáció modulációs hatásának tisztázására a hedonikus jutalom feldolgozásában. Mivel a PAS-t eddig csak patkányokban értékelték, e vizsgálat másik célja paradigma meghatározása és megerősítése volt laboratóriumi egerekben. A természetes ingereknek való kitettség és a kábítószerrel való visszaélés jutalommal összefüggő neuroplasztikus változásokhoz vezet az agyi régiókban, és nemrégiben kimutattuk, hogy a jóízű szaglóinger akut megjelenése patkányokban stimulálja a közvetlen korai c-Fos gént a striatális területeken (Friemel et al., 2010). Ebben a tanulmányban arra törekedtünk, hogy bővítsük eredményeinket, hogy megvizsgáljuk más transzkripciós tényezők bevonását. A neuronális jutalom feldolgozásának potenciális különbségeinek vizsgálatához WT és KO egerekben emellett megvizsgáltuk a kondicionált szag képességét a striatális FosB/AFosB expresszió stimulálására.
TÁRGYAK ÉS MÓDSZEREK
elemeket
Összesen 132 állatot használtak fel erre a vizsgálatra. A hím felnőtt Wistar patkányokat a Wistar Harlan Laboratories-től (AN Venray, Hollandia) szereztük be. A Bonn Egyetemen tenyésztett, hím felnőtt vad típusú (WT) és CB1 receptor knockout (CB1 KO) egereket C57BL/6J genetikai háttérrel (Zimmer és mtsai, 1999) szállítottuk Mannheimbe (Németország). Az állatokat hagyták kiheverni a szállítás után, és az érkezés után legalább 7 napig hozzászoktak az új környezethez. A jelen kísérletekben használt összes állat életkor szerinti volt (patkányok: 4 hónap; egerek: 2-3 hónap). Az egereket egyedileg helyeztük el a fodrász és az agresszív viselkedés elkerülése érdekében a Makrolon ketrecekben (Eurostandard II. Típusú), és a patkányokat négyes csoportokban (Eurostandard IV. Típusú) helyeztük el egy állatszobában egy 12 órás világos-sötét kolóniában (világítás 07:00 órakor - 1900 óra). Az állatok az érkezés utáni első héten szabad hozzáférést kaptak a vízhez és a szokásos laboratóriumi takarmányokhoz, és a viselkedéses tesztek során testtömegük körülbelül 95-97% -át tartották fenn, amikor magas kalóriatartalmú édesített sűrített tejet biztosítottak.
Minden kísérletet a laboratóriumi állatok gondozásának és felhasználásának kézikönyve szerint hajtottak végre, amelyet az Országos Egészségügyi Intézet elfogadott és deklarált, és amelyet a helyi állatgondozási bizottság (Karlsruhe, Németország) jóváhagyott.
Kísérleti terv
Az első kísérletben a CB1 receptor antagonista/inverz agonista SR141716 (SR; Rimonabant) és a szintetikus kannabinoid receptor agonista WIN 55 212-2 (WIN) hatásait vizsgáltuk patkányokban a jól bevált PAS-eljárásra. A patkányok ezért 1 mg/kg SR/hordozóanyag vagy 0,3 mg/kg WIN/hordozó egyszeri injekciót kaptak az edzés során (SR kísérlet: SR n = 16, hordozó n = 12; WIN kísérlet: WIN n = 9, hordozó n = 12 ). Mint ismeretes, hogy a kannabinoid agonisták első injekciója a korábban kezeletlen kábítószer-rágcsálókban averzívnek tekinthető (Schneider és Koch, 2002; Chaperon és Thiebot, 1999), ráadásul a WIN kísérletben szereplő állatoknak egyetlen elsődleges injekciót adtak . 0,3 mg/kg WIN, 48 órával a PAS edzés megkezdése előtt. Annak kizárása érdekében, hogy a krónikus SR/WIN beadás önmagában is befolyásolhatja az ASR amplitúdóját, emellett értékeltük az ASR-t egy másik olyan kohorszban is, amelyek nem részesültek jutalmazási asszociációs képzésben. Ezeket az állatokat kétszer tesztelték ASR-re is: egyszer a WIN/SR gyógyszerek vagy a megfelelő hordozó krónikus beadása előtt és után (WIN kísérlet: WIN n = 6, hordozó: n = 9; SR kísérlet: SR n = 6, hordozó: n = 7).
A következő kísérleteket CB1 KO egerekkel és a megfelelő WT alomtársakkal végeztük. A viselkedés tesztelésére a WT/KO egerek első kohortját használtuk. Az I. csoportot édesített sűrített tej (SCM) bevitelre, PAS-ra és a szagpreferencia szerepére teszteltük (WT és CB1 KO: n = 11). A viselkedési tesztek között az állatokat zavartalanul hagyták 3-4 napig. A II. Csoportot hamisan képezték ki, és kontrollként szolgált a PAS teszt során (WT és CB1 KO: n = 7). A FosB/AFosB kísérlethez egy második egércsoportot használtunk (WT: kiképzett és gúnyosan képzett: n = 5; CB1 KO: nevelett n = 4, szimulált n = 5).
Minden magatartási kísérlethez SCM palackot (Nestle AG, Frankfurt, Németország; csapvízzel 1: 3 arányban hígítva) használtunk. Valamennyi állat a viselkedési tesztelés vagy a képzés megkezdése előtt legalább 4 napig 24 órán át megszokta az SCM-t otthoni ketrecükben, hogy elkerüljék az újdonságok által kiváltott jutalom figyelmen kívül hagyását.
drogok
Az SR-t (általában NIMH) etanolban és Tween-80-ban oldjuk, majd sóoldattal hígítjuk (1: 1: 18). A WIN-t (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Németország) 0,1% Tween-80-ban oldjuk, és sóoldattal (0,9%) hígítjuk. Mindkét gyógyszert intraperitoneálisan adtuk be 1 mg/kg (SR) és 0,3 mg/kg (WIN) dózisban. Az SR-t 30 perccel injektálták, és a WIN-t közvetlenül edzés előtt 1 ml/kg injekciós térfogattal injektálták.
Viselkedésvizsgálat
PAS patkányokban
A PAS vizsgálatokat meglepetéskamrában (SR-LAB; San Diego Instruments, San Diego, CA) végeztük a fent leírtak szerint (Schneider és Spanagel, 2008; Schneider és mtsai, 2010; Brand és mtsai, 2012). Az ijedtség teszteléséhez fehér zajimpulzust (40 ms, hangnyomásszint 100 dB (SPL)) használtunk ingerimpulzusként. 5 perces akklimatizációs időt, amely alatt a patkányok nem kaptak ingert, a háttérzaj (60 dB) kivételével öt kezdeti inger mutatta be. A következő vizsgálati protokoll 30 megdöbbentő impulzusból állt, intertrial intervallummal, véletlenszerűen elosztva 10 és 20 s között. Meglepetés-teszteket kétszer hajtottak végre szagjelek (narancs, illóolajok; Primavera Life, Sulzberg, Németország) jelenlétében, egyszer korábban (kiindulási ASR; ASR1) és ismét 48 órával a szag társulási edzés után (ASR2). A szag (30 μl) egy petri-csészében volt, amelyet a megszokás során egy meglepetésdobozba tettek. A PAS-t a kiindulási ASR amplitúdó átlagos százalékos csökkenésének számításával számítottuk (100- (100x átlagos ASR2 amplitúdó/átlagos ASR1 amplitúdó (alapvonal)).
A javadalmazási képzés 5 napig tartott. Minden napi 90 perces edzés során a patkányokat külön ketrecekbe helyezték (Eurostandard III. Típusú), és véletlenszerű időpontokban három szag-megjelenést tapasztaltak. A szagot (narancssárga, 15 μl) egy kis Petri-csészéhez adták, amelyet a drótfedél közepére tettek, 2 cm-rel az SCM-palack nyílása alatt. Miután 5 percig ingyenesen jutottak a jutalomhoz, eltávolították a szagot és az üveget. Harminc perccel (SR kísérlet) vagy közvetlenül (WIN kísérlet) minden edzés kezdete előtt minden állat egy injekciót kapott a megfelelő gyógyszerből vagy hordozóból.
PAS CB1 KO és WT egerekben
Az egereken végzett megdöbbentő tesztek nem különböztek a patkányok fent leírt protokolljától, kivéve a megriadási intenzitást (115 dB SPL). Az egereken végzett asszociációs képzés 5 napig tartott, és kissé eltért a patkányprotokolltól. Az edzést házi egerek ketrecében hajtották végre. A napi 6 órás (1000-től 1600 óráig terjedő) időkeretben az összes egér öt szagjutalmat mutatott be véletlenszerű időpontokban. A szagot (narancssárga, 15 μl) egy kis Petri-csészébe juttatták, amely a huzat fedele közepén, 2 cm-rel a palack nyílása alatt helyezkedik el. Miután 5 percig ingyenesen jutottak a jutalomhoz, eltávolították a szagot és az üveget.
Az új PAS protokoll validálásához egerekben egy további csoportot teszteltünk szimulált körülmények között. Ezeknek az állatoknak egy szimulációs képzési eljárást hajtottak végre, ahol napi 5 napon keresztül, 25 percen keresztül, véletlenszerű időpontokban hozzáférést kaptak az SCM-hez, szag egyidejű megjelenése nélkül. A szag expozícióját független módon végeztük legalább 4 órával az SCM megközelítés után/előtt.
Korlátozott SCM felvétel CB1 KO és WT egerekben
Az állatokat SCM-bevitelre tesztelték háziketrecükben. A teszt napján megmérettük a testtömegét (BW), és az állatokat visszahelyeztük háziketrecükbe. Itt 30 percig ingyenes hozzáférést kaptak az SCM palackhoz. Ezután az SCM bevitelt g/kg testtömegként számoltuk.
Szagpreferencia teszt CB1 KO és WT egereken
A szagpreferencia szerepét a nyílt terepen (20 × 20 x 25 cm 3) alkalmazták a szag kimutatásának képességének értékelésére CB1 KO egerekben. A tesztelés során két azonos alakú (perforált fém kupakkal ellátott) üvegsót rázogattak, amely 15 μl vízben vagy citromolajban áztatott szűrőpapírt tartalmaz. Az egereket az arénához és (nem központi) alanyokhoz szokták szokni 10 percig, 24 órán keresztül a tesztelés előtt. A tárgypreferencia teszteléséhez az egereknek 6 percig szabadon megvizsgálták az illatanyagokat. Az állatokat videóra vettük, és az egyes objektumok felmérési idejét egy offline kísérletező elemezte, az egér genotípusára vakon. A szagdiszkrimináció százalékos arányának kiszámításához a citromfű illatanyagok felmérési idejét mindkét tárgy teljes felmérési idejének százalékában fejeztük ki.
immunhisztokémia
FosB/AFosB stimuláció és az agy előkészítése
A FosB/AFosB fehérje expressziójának mérésére az egereket 5 napig képezték (vagy szükség esetén gúnyképzéssel látták el), hogy a narancs illatot társítsák az SCM jelenlétével, amint azt a PAS edzésprotokollnál fent leírtuk. Minden állatot narancsszagnak (15 μl) tettek ki 10 percig 48 órán keresztül az utolsó asszociációs edzés után. Az állatokat 90 perccel később lefejezéssel feláldoztuk, az agyakat eltávolítottuk, metil-butánban 90 másodpercig gyorsfagyasztottuk és -80 ° C-on tároltuk. A fagyasztott agyakat 12 mm vastag koronaszeletekre vágtuk kriosztátokon, és a Superfrost tárgylemezeken azonnal felolvasztottuk és tároltuk. Két jutalomhoz kapcsolódó agyi régiót, a nucleus accumbens (NAC) és a dorsalis striatumot (dStr) választottuk ki érdekes régiónak.
FosB/AFosB immunhisztokémia
A tárgylemezeket felolvasztjuk és szobahőmérsékleten szárítjuk, majd 4% PFA-ban rögzítjük. A tárgylemezeket foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) és PBS-sel mossuk 0,1% Tween-20-tal (PBS-T). 30 perces metanolban oldott 0,3% H 2 O 2 -val történő inkubálás és PBS/PBS-T-ben történő mosás után az elsődleges FosB monoklonális antitest (2251. sz.; New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Németország), amely felismeri mind a FosB-t, mind a FosB-t. Az AFosB fehérjéket 1: 400 koncentrációban inkubáltuk PBS-ben 0,2% normál kecskeszérummal egy éjszakán át 4 ° C-on. A tárgylemezeket ismét PBS/PBS-T-ben mostuk, és tovább kezeltük nyúl IgG Vectastain ABC kit-el (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a gyártó utasításainak megfelelően. A tárgylemezeket szekunder antitesttel inkubáljuk 1 órán át szobahőmérsékleten, mossuk és 1 órán át szobahőmérsékleten avidinnel és biotinnal kezeljük. Ezután a metszeteket mossuk, és immunhisztokémiai úton diaminobenzidinnel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) festjük, majd lépésenként etanol- és xilol-oldatsorozatokba helyezzük, majd Eukitte-ben (O Kindler GmbH, Freiburg, Németország) lefedjük.
Statisztikai analízis
A WIN és SR farmakológiai hatásait a PAS százalékára képzett és képzetlen patkányokban kétirányú varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük. A genotípus (WT/KO) viselkedési teljesítményre gyakorolt hatásait Student t-tesztjeivel értékeltük, kivéve az ASR és a PAS időbeli lefolyását KO és WT egerekben. Ezeket az adatokat, valamint az SCM felvételét a PAS edzés során a WIN és SR kísérletek során ANOVA ismételt mérésekkel elemeztük, post-hoc elemzésként a Student-Neuman-Keuls tesztet. A szag által kiváltott FosB/AFosB stimulációt NAC-ban és dStr-ben minden genotípusra elemeztük Student t-tesztjeivel. A c-Fos stimulációval kapcsolatos korábbi megállapításaink szerint (Friemel és mtsai, 2010) a WT állatok szagképzése után megnövekedett FosB/AFosB expressziót vártunk. Emiatt egyoldalú t-teszteket alkalmaztunk a WT egerek adatainak elemzésére. Minden adatot átlag ± SEM-ben fejezünk ki. A statisztikai szignifikancia szintjét p-ként határoztuk meg 
Örül a csillapított megkönnyebbülés (PAS), az akusztikus megdöbbentő válasz (ASR) és az édesített sűrített tej (SCM) bevitele CB1 knockout (KO) és vad típusú (WT) egerekben. Stabil PAS választ figyeltünk meg WT egerekben; a CB1 KO egerekben azonban kiderült, hogy a PAS szinte hiányzik (a). A próbamenetek közötti megdöbbentő szokás lehetséges változásainak ellenőrzésére a KO és a WT egerek második kohorszát szimulált szagmentes képzési eljárásnak vetették alá, és a PAS protokoll szerint tesztelték. Nem tapasztaltunk különbséget a genotípusok között, ami az ASR hasonló ismétlődését jelzi a CB1 KO és a WT (b) állatokban végzett újratesztelés után. A kondicionált szagtábor mérsékelte az ASR nagyságát a WT állatokban a második megrázkódtatás során (c), míg a CB1 KO egerekben (d) nem észleltek ilyen csökkenést. Az idő lefutása a PAS százalékában szignifikánsan alacsonyabb volt a CB1 KO egerekben a teszt során (e). Végül a szabad SCM felvétele csökkent a CB1 KO egerekben a WT (f) kontrollokhoz képest. Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki (p
Szagpreferencia a CB1 knockout (KO) és a vad típusú (WT) egerekben. A szagdiszkriminációs tesztek során mindkét genotípus hasonló preferenciát mutatott az illatos tárggyal szemben, ami a szag észlelésének hasonló képességét jelzi CB1 KO és WT állatokban. Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki (WT és CB1 KO: n = 11).
Teljes méretű kép
- Töltse le a PowerPoint diát
Szag által kiváltott FosB/AFosB stimuláció CB1 KO és WT egerekben
A FosB/AFosB dStr festés mindkét genotípusú szagkontrollált és álkontrollált állatokból a 4. ábrán látható. A FosB/AFosB expresszió szagtábor általi indukciója szignifikánsan magasabb volt azokon a WT egereknél, amelyek jutalom asszociációs képzésen estek át. szimulált edzéssel rendelkező egerekben NAC-ban (t 8 = -1, 99, p = 0,04) (5a. ábra) és dStr-ben (t8 = -1, 91, p = 0,047) (5b. ábra). Ilyen különbség azonban nem volt megfigyelhető a CB1 KO egereknél (NAC: t7 = 0,88, p = 0,41; dStr: t7 = -0,21, p = 0,84) (5c és d ábra), jelezve, hogy az akut jutalom-expozícióval kapcsolatos szag nem képzett CB1 KO állatokban a jutalomhoz kapcsolódó agyterületek jelentős stimulációjához vezetnek.
Striatális mintavételi helyek és példaértékű FosB/AFosB festés. A koronális agy vázlata szemlélteti a mintavételi szemcsék (500 × 500 μm 2) stabil helyzetét a dorsalis striatum (dStr) és a nucleus accumbens (NAC) esetében a metszetsíkban, amely megfelel a +1, 45 és +1, 35 értékeknek. Bregma. A jobb oldalon a reprezentatív FosB/AFosB dStr festés látható egerek szimulált szagával és mindkét genotípus szagával.
Teljes méretű kép
- Töltse le a PowerPoint diát
FosB/AFosB stimuláció étvágyszag megjelenítéssel CB1 knockout (KO) és vad típusú (WT) egerekben. Megállapítottuk, hogy a kondicionált szagjelző jelentősen növeli a FosB/AFosB expressziót képzett WT állatokban a nucleus accumbens (NAC) (a) és a dorzális striatumban (dStr) (b) az ál-kezelt kontrollokhoz képest. Nem volt megfigyelhető ilyen fokozott expresszió a CB1 KO egereknél sem NAC (c), sem dStr (d) -ben. Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki (p