fokozott

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • Az exogén cAMP javítja az idősebb egerek öregedésével járó fenotípust
  • A cAMP a sirtuinszint növelésével utánozza a kalóriakorlátozás hatásait
  • A CAMP kezelés javítja a zsíranyagcserét, hogy csökkentse a kalóriákat
  • A cAMP szaporítja a sirtuint az oxidatív károsodás és a sejtek öregedésének megakadályozása érdekében
  • A cAMP közvetlenül megköti a SIRT1-et és a SIRT3-at
  • vita
  • Kísérleti eljárások
  • Állatok és diéták
  • Sejtkultúra és kezelés
  • Viselkedési tesztek
  • A karboniltartalom mérése 8
  • Nukleotid mérés
  • Biokémiai mérések
  • A hisztokémiai metszetek megfigyelése
  • Fehérje elemzés
  • Felszíni plazma rezonancia
  • Statisztikai elemzések
  • További részletek
  • További információ
  • PDF fájlok
  • További információ
  • Hozzászólások

elemeket

absztrakt

A ciklikus adenozin-monofoszfát (cAMP) fontos szerepet játszik számos biológiai folyamatban, mint második hírvivő, és a cAMP-kezelésről beszámoltak arról, hogy meghosszabbítja a vad típusú Drosophila melanogaster életét. Vizsgálatunk kimutatta, hogy az exogén cAMP javította az öregedéssel kapcsolatos fenotípusokat azáltal, hogy növelte a sirtuinok szintjét, ami megakadályozta, hogy az anyagcserezavarok utánozzák a kalóriák hatását. In vitro kísérletek azt mutatták, hogy a cAMP közvetlenül a SIRT1-hez és a SIRT3-hoz kötődött, és ezután növelte aktivitásukat. Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a cAMP lassítja az öregedési folyamatot, és jó jelölt a kalória-korlátozás utánzására. Kutatásunk ígéretes terápiás stratégiát kínál az anyagcserezavar okozta öregedéssel kapcsolatos betegségekre.

A kalória korlátozás hatékony beavatkozás az átlagos és a maximális élet meghosszabbítására egyaránt 1. A kalóriacsökkentés öregedésgátló hatásához azonban a kalóriabevitel körülbelül 30–40% -os csökkentésére van szükség, ami a legtöbb ember számára elviselhetetlen. Számos kutató megpróbált olyan gyógyszert találni, amely utánozza az energiafogyasztás csökkentése nélkül az öregedésgátló hatású kalóriakorlátozást, például a resveratrol 2. Egy nemrégiben készült tanulmány arról számolt be, hogy a resveratrol öregedésgátló hatású, mivel gátolja a cAMP hidrolízisét. A cAMP hidrolízist specifikusan gátló Rolipram-nak hasonló hatása volt, mint a resveratrol 3-ra, ami arra utal, hogy a cAMP kalória-korlátozott jelölt utánzó szerként szerepelhet. Egy másik tanulmány kimutatta, hogy a vad típusú Drosophila melanogaster élettartama a cAMP 4 kezelés után jelentősen megnőtt, ami arra utal, hogy a cAMP kulcsszerepet játszhat a szervezetek öregedési folyamatának késleltetésében.

A SIRT1-t öregedésgátló fehérjeként javasolták, és aktiválása számos szervezet számára pozitív egészségügyi előnyökhöz vezet 5. Beszámoltak arról, hogy a CAMP nem kötődik a reszponzív elemekhez (CREB) és csökkenti a SIRT1 expressziót; A CREB közvetlenül szabályozza a Sirt1 transzkripciót az idegsejtekben azáltal, hogy kötődik a Sirt1 kromatin 6-hoz. Egy nemrégiben készült tanulmány kimutatta, hogy a cAMP aktiválta a kalmodulin-kináz-kináz II-t (CaMKKII) az AMPK foszforiláció szintjének növelése érdekében, ezáltal elősegítve a NAD + termelést és a SIRT1 aktivációt. Egy másik tanulmány kimutatta, hogy a cAMP-PKA jelátviteli út aktiválása a SIRT1 gyors foszforilációjához vezetett a NAD + 7 szintjének megváltoztatása nélkül. Ezek az eredmények rávilágítottak a cAMP és a SIRT1 közötti kapcsolatra a különböző utakban, és arra utaltak, hogy a cAMP a SIRT1 specifikus aktivátora lehet, és utánozhatja a kalóriakorlátozás öregedésgátló hatását.

A SIRT3, mint a SIRT1 homológ dezacetiláza, főleg a mitokondriumokban található meg, ahol csökkenti a sejtek öregedésének kiváltásáért felelős reaktív oxigénfajok (ROS) mennyiségét 8, 9. Ezenkívül létezik egy független rendszer a cAMP termelésének és lebomlásának szabályozására a mitokondriumokban az ROS 10, 11 keletkezésének szabályozására, de hogy a cAMP képes-e szabályozni a SIRT3-t az oxidatív stressz csökkentése érdekében, arról nem számoltak be.

A cAMP különféle anyagcsere-folyamatokat hajt végre, amelyek másodlagos hírvivőként kapcsolódnak a hormon metabolizmusához, és a cAMP válasza sok hormon esetében elhalványul az öregedéssel 12, ami arra utal, hogy a cAMP-nek fontos szerepet kell játszania az öregedési folyamat szabályozásában. Vizsgálatunk kimutatta, hogy az exogén cAMP (dibutiril-ciklikus adenozin, db-cAMP) adagolása növelte a sirtuin fehérje szintjét, hogy utánozza a kalória-korlátozás öregedésgátló hatásait, beleértve az anyagcserezavarok megelőzését és az életkorral kapcsolatos fenotípusok javulását. Az eredmények azt mutatták, hogy a cAMP közvetlenül kombinálható a SIRT1/SIRT3-mal, ami arra utal, hogy a cAMP öregedésgátló hatású és jó jelölt a korlátozott kalóriatartalmú utánzókra.

az eredmény

Az exogén cAMP javítja az idősebb egerek öregedésével járó fenotípust

A CAMP kezelés javítja a zsíranyagcserét, hogy csökkentse a kalóriákat

A cAMP szerepének bemutatásához a kalória csökkentésében magas zsírtartalmú étrendet (60% zsírtartalmú energiát) etettünk egereknek, amelyek pozitív kontrollként különféle dózisú cAMP-t vagy resveratrolt tartalmaztak. Az eredmények azt mutatták, hogy a cAMP-val kezelt egerek testtömege dózisfüggő csökkenést mutatott a magas zsírtartalmú étrenddel kezelt kezeletlen egerekhez képest (2A. Ábra), a táplálékbevitel jelentős változása nélkül (2B. Ábra). A magas zsírtartalmú étrend összehangolt funkcionális csökkenéshez vezetett, amelyet a túlsúly okozott; A CAMP-kezelés javította a magas zsírtartalmú egerek motoros koordinációját (2C. Ábra). Elemeztük az egerek epididymális zsírszövetét, és megállapítottuk, hogy a cAMP-kezelés dózisfüggő csökkenést okozott a zsírszövet méretében (2D. Ábra). A biopsziás eredmények azt mutatták, hogy a magas zsírtartalmú étrend az adipocita méretének növekedéséhez vezetett az egér májában és a hasi zsírszövetben; a cAMP-kezelés után az adipocita mérete normálissá vált (2E, F ábra). A magas zsírtartalmú csoportban a triglicerid és az összkoleszterin szint emelkedett a kezeletlen csoporthoz képest, és a cAMP-val kezelt csoportban mindkettő alacsonyabb volt, ami arra utal, hogy a cAMP javíthatja az anyagcserezavarokat (2G. Ábra, H).

A cAMP szaporítja a sirtuint az oxidatív károsodás és a sejtek öregedésének megakadályozása érdekében

A csökkent sejtszaporodás és a megnövekedett oxidatív stressz a sejtek öregedésének két fontos oka. A cAMP öregedésgátló hatásának hátterében álló mechanizmus vizsgálatához megvizsgáltuk a sejtciklus változását cAMP kezeléssel vagy anélkül, összehasonlítva a Roliprammal, mint pozitív kontrollal. Az eredmények azt mutatták, hogy az S-fázisú sejtek aránya növekvő tendenciát mutatott, de nem érte el a statisztikai szignifikanciát, ami arra utal, hogy az anti-aging cAMP mechanizmusa nem függ a fokozott sejtproliferációtól (3A. Ábra).

A cAMP szirtuinra gyakorolt ​​aktiváló hatásának igazolásához megmértük az intracelluláris cAMP szinteket és a differenciálódási eredményeket a C2C12 sejtvonalban (3F. Ábra, G ábra), mivel a glükóz restrikció a SIRT122 aktiválásával gátolja a csontváz myoblast differenciálódását. Az eredmények azt mutatták, hogy a cAMP-kezelés gátolta a C2C12 sejtek differenciálódását, ami arra utal, hogy a cAMP növeli a SIRT1 aktivitást. Állatkísérleteink eredményei alapján feltételeztük, hogy a cAMP öregedésgátló hatása az oxidatív stressz csökkentésével érhető el, ezért hidrogén-peroxidot (ROS által generált) alkalmaztunk a sejtek öregedésének kiváltására. Az öregedéssel társult β-galaktozidáz (SA-β-gal) eredményei azt mutatták, hogy a cAMP-kezelés megakadályozhatja a ROS-indukálta sejtek öregedését (3H. Ábra), ami arra utal, hogy a cAMP csökkenti az oxidatív stresszt. Az eredmények azt is megmutatták, hogy a db-cAMP kezelés elvesztette funkcióját a pozitív festő sejtek számának csökkentésében EX-527 (sirtuin inhibitor) kezeléssel, ami arra utal, hogy a cAMP oxidációs képessége a sirtuintól függ (S ábra). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a cAMP antioxidáns hatása mind a SIRT1, mind a SIRT3 aktivitás növekedésétől függ.

A cAMP közvetlenül megköti a SIRT1-et és a SIRT3-at

A cAMP sirtuinra gyakorolt ​​szabályozó hatásának mechanizmusának további vizsgálatához in vitro sirtuin aktivitási vizsgálatot végeztünk. Az eredmények arra utalnak, hogy a cAMP növelheti a SIRT1 és a SIRT3 aktivitását (4A. Ábra, B). Ezenkívül a felszíni plazmon rezonancia (SPR) technikát alkalmaztuk a cAMP és a sirtuin közötti kölcsönhatás kimutatására. Az eredmények azt mutatták, hogy a cAMP közvetlenül kötődhet a SIRT1-hez (KD = 1,05) és a SIRT3-hoz (KD = 4,708) in vitro (4C-E ábra). Mivel a SIRT1 és a SIRT3 egyaránt NAD + -függő lizin-deacetilázok, és a NAD + tartalmaz AMP-részt, a cAMP NAD + -hoz való hasonlósága hasonló megkötési képességhez vezetett. Autotransport analízist hajtottak végre a cAMP SIRT1-hez való kötődésének kimenetelét megalapozó mechanizmus magyarázatára, és a cAMP kötőhelyei hasonlónak bizonyultak a NAD + -hoz, amikor SIRT1 fehérjéhez kötődtek (4F. Ábra, G). Munkánk kiindulópontot jelenthet a cAMP sirtuinra gyakorolt ​​szabályozó hatásának alapvető mechanizmusának tanulmányozásához (5. ábra).

( A ) A SIRT1 aktivitás elemzése. ( B ) A SIRT3 aktivitás elemzése. ( C - E ) Felszíni plazmon rezonancia, amely a cAMP vagy db-cAMP SIRT1 vagy SIRT3 fehérjékhez való kötődését méri. A SIRT1 vagy SIRT3 fehérjéket immobilizáltuk egy CM5 szenzor chipre. A kötődési vizsgálatokat a cAMP vagy db-cAMP koncentrációk tartományának (15, 6–500 μM) felhasználásával végeztük. ( F, G ) A cAMP és a SIRT1 közötti kölcsönhatás mechanikai diagramja dokk elemzéssel. Az első grafikon a NAD és a SIRT1 közötti kölcsönhatást mutatja a második grafikonhoz képest, amely a cAMP és a SIRT1 közötti kölcsönhatást mutatja. Az összes statisztikai elemzést egyirányú ANOVA alkalmazásával végeztük. # p ## p ### p

Teljes méretű kép

vita

Vizsgálatunk azt mutatja, hogy az étrendi cAMP-kiegészítők növelhetik a sirtuin fehérje szintjének szabályozását, ezáltal késleltethetik az életkorral kapcsolatos fenotípusok megjelenését az anyagcserezavarok megelőzésével. Megmutattuk, hogy a cAMP közvetlenül képes kötődni mind a SIRT1, mind a SIRT3-hoz in vitro, ezáltal növelve a SIRT1 és SIRT3 aktivitását és utánozva a kalóriakorlátozás hatásait. Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a cAMP fontos szerepet játszik az öregedési folyamatban, és ígéretes lehetősége van kalória-korlátozott utánzó szerként az öregedéssel összefüggő betegségek megelőzésében.

Amióta 1971-ben felfedezték a cAMP-t mint második hírvivőt, amely a kutató Nobel-díját nyerte, a tanulmányok a cAMP-re összpontosítottak. A mai napig azonban a cAMP nem jelent meg a kalória-korlátozás utánzó jelöltjeként, hogy lassítsa az öregedési folyamatot. Tanulmányok kimutatták, hogy az éhezés növeli a cAMP-szintet a magas glükagonszint vagy az alacsony inzulin/IGF-1 jelátvitel következtében 15, 23, ami arra utal, hogy a cAMP fontos szerepet játszhat a kalória korlátozásban. Vizsgálatunk előtt azonban az exogén cAMP-t nem jelölték a kalória-korlátozás utánzó jelöltjeként. Munkánk bizonyítékokkal támasztja alá, hogy a kalória-korlátozás növeli az endogén cAMP-szinteket több szervben az öregedéssel kapcsolatos fenotípusok javítása érdekében. Ezenkívül az exogén cAMP utánozhatja a kalóriakorlátozás öregedésgátló hatását, ideértve a SIRT1 és a SIRT3 up-szabályozását is, amelyek kulcsfontosságú fehérjék az anyagcserében és az öregedésben.

A cAMP fiziológiás intracelluláris koncentrációja 0,1 - 1 μM, de hormonok vagy stressz esetén a cAMP koncentrációja több mint százszorosára (kb. 100 μM) növekedhet. A SIRT1 és SIRT3 aktivitás értékelésekor 100 μM cAMP-t és db-cAMP-t használtunk a fiziológiai tartományban lévő koncentrációk utánzásához. Mivel a kiegészített cAMP csak egy része tudott stabilan bejutni a sejtekbe, azt javasoljuk, hogy ezeknek a koncentrációknak hasonló hatása lehet, mint az enyhe stressz állapotoknak, azaz a kalória korlátozásnak.

Nemrégiben arról számoltak be, hogy a resveratrol foszfodiészteráz (PDE4) inhibitor, amely kompetitív módon kötődik a PDE4-hez és gátolja a cAMP 3 lebomlását. Feltételeztük, hogy a cAMP kötődhet a SIRT1-hez, és az SPR eredmények bebizonyították hipotézisünket és bebizonyították, hogy a cAMP és a SIRT1 közvetlen interakcióval rendelkezik in vitro. Érdekesebb, hogy a cAMP közvetlen interakcióban áll a SIRT3-mal is, amely szabályozza a mitokondriális ROS termelést és lassítja az öregedési folyamatot. A SIRT1 és a SIRT3 egyaránt NAD + -függő lizin-deacetiláz. A NAD + tartalmaz AMP-részt, így a cAMP közvetlenül kölcsönhatásba lép a Sirtuin fehérjecsaláddal. Munkánk bizonyítékot szolgáltatott arra, hogy a cAMP alacsony kalóriatartalmú körülmények között a sirtuin szubsztrát analógja lehet.

Az automatikus dokkolás eredményei azt mutatták, hogy a cAMP kölcsönhatásba lépett a NAD + SIRT1 kötő zsebbel, de nem blokkolta a katalitikus helyet. A sirtuin és a NAD + reakciója a NAD + két részre, NAM-ra és 2'-O-acetil-ADP-ribózra történő hidrolíziséhez vezetett. A cAMP és a NAD + molekulaszerkezeti elemzése alapján megfigyelhettük, hogy amikor a SIRT1-hez kötött cAMP, a kötőzsáknak csak a fele volt elfoglalva, és katalitikus oldal állt rendelkezésre a SIRT1 és a NAD + közötti reakcióhoz. Ebben az esetben a NAD + kölcsönhatásba lép a katalitikus hellyel, ami magasabb NAD + hidrolízis kockázatához vezet. Feltételeztük, hogy a cAMP kötése a sirtuinhoz csökkentette a NAD + stabilitását, ami javította a NAD + és a sirtuin közötti reakció hatékonyságát.

Feltételeztük, hogy a cAMP és a SIRT1 megkötése megvédi azt a katalitikus helyet, amely a Sirtuin és a NAD + kötő zsebe volt. Ily módon a cAMP posttranszkripcionálisan növelheti a SIRT1 fehérje szintjét, amint azt már tárgyaltuk. Feltételezzük, hogy a cAMP hatása a SIRT1 és SIRT3 fehérjeszintek növekedésére azon alapult, hogy kötés útján növelte fehérje stabilitását, ami korlátozhatja a fehérje lebomlását.

Munkánk megmutatta, hogy a cAMP jó jelölt a kalória-korlátozás utánzására. A cAMP intracelluláris második hírvivőként számos biológiai folyamatban fontos. Az öregedési folyamat szintén bonyolult, és nem magyarázható egyetlen jelátviteli úton. Úgy gondoljuk, hogy a cAMP öregedésgátló hatása függhet egy jelátviteli hálózattól, amely egynél több célpontot tartalmaz, vagyis a cAMP több jelzési kaszkádot is megcéloz az öregedési folyamat szabályozásában.

Kísérleti eljárások

Állatok és diéták

Fiatal (3 hónapos) hím BALB/c egereket a Vital River Laboratories-tól vásároltak, és a kínai intézményi etikai bizottság utasításainak és jóváhagyásának megfelelően kezelték őket. További részletek a kiegészítő anyagban találhatók.

Sejtkultúra és kezelés

A C2C12 és 3T3-L1 sejtvonalakat DMEM-ben (Thermo Scientific) tenyésztettük, kiegészítve 10% FBS-szel, 5% CO 2 -val. Az Ex-527-et, a C vegyületet, az STO609-et (Sigma) és a H89-t (sejtjelzési technológia) 1 órával a ciklikus AMP, a db-cAMP és a Rolipram (Enzo Life Sciences) beadása előtt adtuk hozzá. A sejteket ezután még 1 órán át inkubáltuk a betakarítás előtt. További részletek a kiegészítő anyagban találhatók.

Viselkedési tesztek

Minden csoport esetében a motoros koordináció és egyensúly teszteléséhez a gyorsuló forgórúd (Kínai Orvostudományi Akadémia) mérése óta eltelt helyi motoros aktivitás és idő eltelt. A Morris-vízlabirintust és a húrpróbákból való zuhanás késleltetését a Tsinghua Egyetem Élettudományi Központjának berendezésével hajtották végre.

A karboniltartalom mérése 8

A fehérje-karbonil-csoportokat 2,4-dinitrofenil-hidrazinnal (DNPH) számszerűsítettük. Röviden, 1 ml 0,5 mg fehérjét 200 ml 10 mM DNPH-val (2 M sósavban oldva) kezeltünk 1 órán át, majd 10% triklór-ecetsavval kicsaptuk. Az üledéket háromszor mossuk 1: 1 (v/v) etanol: etil-acetát eleggyel és feloldjuk 0,5 ml 0,2% -os SDS-ben, 20 mM Tris-Cl (pH 6, 8). Ezután meghatározzuk a fehérje koncentrációját a végső oldatban. BCA kit (Thermo Scientific) felhasználásával, és az abszorbanciát 360 nm-en mértük a karbonil-tartalom kiszámításához. Blankként HCl-nel kezelt fehérjemintákat használtunk, de DNPH-val nem.

Nukleotid mérés

A cAMP mérést a gyártó utasításai szerint, Glo-cAMP assay kit (Promega) alkalmazásával végeztük. További részletek a kiegészítő anyagban találhatók.

Biokémiai mérések

Az összkoleszterin, a trigliceridek és az MDA mérését a gyártó utasításai szerint végeztük mennyiségi meghatározó készlet (Blue Gene) alkalmazásával. Az SA-ß-gal festést a gyártó utasításai szerint végeztük (Sigma).

A hisztokémiai metszetek megfigyelése

A máj és a zsírszövet metszeteit hematoxilinnal és eozinnal festették; a bőr kollagénjét Masson trikrómjával festették. A megfigyeléseket fénymikroszkóppal (Leica) végeztük, és 40-szeres nagyítással szkenneltük.

Fehérje elemzés

A Western blot mintáit 10% SDS-poliakrilamid géleken futtattuk, és PVDF membránokba helyeztük. A következő antitesteket használtuk: SIRT1, SIRT3 NF-κB és PPARγ (Sejtjelzési technológia) és CaMKKII, PKAc, SIRT6 (Abgent) és PEPCK és Actin (Santa Cruz).

Felszíni plazma rezonancia

A tisztított SIRT1 (Abcam, tisztaság = 95%) vagy a SIRT3 (R&D, tisztaság = 95%) fehérjéket immobilizáltuk egy CM5 szenzor chipre (T200 Biacore, GE). A pH-rendezés és az immobilizálás eredményeit a kiegészítő információk tartalmazzák (S3-4. Ábra).

Statisztikai elemzések

A csoportok összehasonlítását egyirányú ANOVA-val végeztük. A különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük p