elemeket

absztrakt

A 2-es típusú cukorbetegség krónikus anyagcsere-rendellenesség, amelyet elsősorban az inzulinrezisztencia okoz, amelynek fő oka az elhízás. Az árva G fehérje-kapcsolt receptor (GPCR) expressziós szintje, a GPR21, a magas zsírtartalmú, magas zsírtartalmú (HFHS) egerekben az epididymális zsírpárnák jelentős növekedésének tendenciáját mutatta. Ahhoz, hogy további betekintést nyerjünk abba a potenciális szerepbe, amelyet ez az új cél játszhat az elhízással társuló 2-es típusú cukorbetegség kialakulásában, a receptor jelátviteli képességeit vizsgálták. A HEK293T sejtekben végzett túlexpressziós vizsgálatok kimutatták, hogy a GPR21 egy konstitutívan aktív receptor, amely kötődik a G típusú G qq fehérjékhez, ami a mitogén által aktivált protein kinázok (MAPK) aktivációjához vezet. A GPR21 in vitro túlzott expressziója szintén jelentősen gyengítette az inzulin szignalizációt. Érdekes módon a GPR21 MAPK-ra és inzulinjelzésre gyakorolt ​​hatása szérum jelenlétében csökkent, ami natív gátló ligandum lehetőségét eredményezte. Homológ modellezés és liganddokkolási vizsgálatok egy új vegyület azonosításához vezettek, amely gátolta a GPR21 aktivitását. Hatásai antidiabetikus farmakológiai stratégiában rejlenek, mert bebizonyosodott, hogy ellensúlyozza a GPR21 inzulin jelátviteli útra gyakorolt ​​hatását.

A 2-es típusú cukorbetegséget elsősorban az inzulinrezisztens szisztémás állapot okozza, amelyet a növekvő viszkózus zsírszövet okoz, amely krónikus, alacsony fokú gyulladást vált ki, amely hátrányosan befolyásolja az 1, 2 inzulinjelátviteli utat. A 2-es típusú cukorbetegség növekvő előfordulása, a jelenlegi kezelési rend korlátozásaival együtt, innovatív, hatékony stratégiákat tesz szükségessé e betegség kialakulásának és progressziójának megakadályozására. A G fehérjéhez kapcsolt receptorok (GPCR), amelyek a genom legnagyobb fehérje szupercsaládja, gazdag forrás a gyógyszer célpontjainak, mert könnyen továbbítják a külső jeleket a sejt belső környezetébe: a forgalmazott gyógyszerek körülbelül 30-40% -a célozza meg ezeket az univerzális receptorokat 3 .

Megfigyeltük a GPCR, GPR21 expressziós szintjének növekedését a magas cukortartalmú egerek zsírszövetében (HFHS). Noha ez a növekedés nem érte el a statisztikailag szignifikáns szintet, a GPR21 új eszközt jelenthet, amellyel a cél 2-es típusú fenotípus megcélozható, mivel ezt a GPCR-t úgy tervezték, hogy párosuljon a G q q G altípusú fehérjékkel, a Gaq10 és a Ga15/16 11-vel. A homológiai modellezés és a ligandumok dokkolásának előrehaladása nagyban megkönnyítette az árva GPCR-ek célzott terápiáinak kidolgozását 12. Mivel a GPR21 szerkezete továbbra sem ismert, ezeket a technikákat alkalmazták potenciális kismolekulák azonosítására, amelyek képesek megkötni és szabályozni a receptor hatásait.

Ez a munka a GPR21 által kiváltott szignáltranszdukció elemzését nyújtja, amely áttekintést nyújt azokról a mechanizmusokról, amelyek révén ez a receptor a 2-es típusú diabéteszes fenotípusra képes hatni, és ezáltal lehetőséget jelenthet egy új terápiás stratégia kialakítására. A GPR21 megfigyelt konstitutív aktivitását, amely elősegíti a MAPK aktiválódását és hátrányosan befolyásolja az inzulinjelátviteli utat, a szérumban jelen lévő natív ligandum szabályozhatja. Ezenkívül egy új vegyületről, amelyet úgy terveztek megkötni, hogy kötődjön a GPR21-hez, úgy találtak, hogy védelmet nyújt a receptor inzulinjelátviteli útra gyakorolt ​​megfigyelt hatásaival szemben.

az eredmény

A GPR21 konstitutívan aktív receptor szignál a Ga15/16-on keresztül

szabályozása

A kontroll és a HFHS-vel táplált C57BL/6J egerek epididimális zsírpárnáit lizáltuk, a fehérjéket SDS-PAGE-val elválasztottuk és expresszióval ( a ) GPR21 a ( b ) egy makrofág marker, F4/80, Western blot alkalmazásával. A reprezentatív Western-blotokat az Image J szoftverrel meghatározott relatív sűrűségekkel együtt mutatjuk be, átlag ± SEM-ként, n = 9. Az F4/80 expresszió szignifikáns növekedését figyeltük meg párosítatlan Student t-teszttel p

Teljes méretű kép

Mivel a GPR21 túlzott expresszió a JNK foszforilációjának jelentős növekedését okozta, értékeltük a receptor hatását az inzulin szignál útjára. A GPR21-t túlzott mértékben expresszáló HEK293T sejtek nem reagáltak a receptoruk inzulin által kiváltott stimulációjára, amely eredmény szérum jelenlétében kissé csökkent (2e. Ábra). A GPR21 útvonal mögött az overexpresszió megakadályozta az IRS1, Akt és AS160 foszforilációját inzulin jelenlétében és hiányában. Ez az eredmény ismét csökkent, amikor a sejteket szérumtartalmú táptalajjal inkubáltuk. Kapcsolódó eredményt figyeltünk meg, amikor a GPR21 a Ga 15/16-hoz társult (2f. Ábra), bár a szérum hatása enyhe volt. Az attenuált inzulin jelátviteli út miatt a GPR21 a glükózfelvétel jelentős csökkenését is okozta, amelyet részben izoláltak szérum jelenlétében (2g. Ábra). Amikor a G15 15/16-mal együtt expresszáltuk, hasonló tendencia figyelhető meg (2h ábra). A GPR21 hatása az inzulin szignálútra nem korlátozódik a HEK293T sejtekre, mivel ez a hatás megfigyelhető a receptort túlzottan expresszáló CHO sejtekben is (lásd az S1. Kiegészítő ábrát).

Az új vegyület véd a GPR21 hatásaitól

Ez a munka bemutatja a GPR21 potenciális szerepét a 2-es típusú cukorbetegség kialakulásában (4. ábra). Az elhízás által kiváltott 2-es típusú cukorbetegség a GPR21 diszregulációjához társulhat a megnövekedett receptor expresszió, megnövekedett endogén agonista vagy csökkent inverz agonista révén, ami olyan MAPK-k stimulálásához vezet, amelyek hozzájárulnak a GPR21 gátló hatásához. A GPR21 inverz agonistával történő megcélzása, mint amilyen ebben a tanulmányban szerepel, korlátozhatja az inzulinrezisztencia és a 2-es típusú cukorbetegség kialakulásához hozzájáruló számos szempont egy részét.

Konstitutívan aktív GPR21 megszerzi és aktiválja a G15 15/16-ot, ami megkönnyíti a PIP 2 DAG és IP3 hidrolízisét PLC-vel. A DAG és az IP 3 egyaránt aktiválja a PKC-t, amely jelzi és aktiválja a MAPK kaszkádot. A MAPK JNK kulcsszerepet játszik az inzulinrezisztencia kialakulásában, mert elősegíti az IRS1 inzulinjelző kaszkád egyik kulcsfontosságú komponensének a Ser 307-ben történő foszforilezését, megakadályozva ezzel az inzulin által kiváltott tirozin-foszforilációt. A GPR21 által kiváltott MAPK aktiváció hozzájárulhat a 2-es típusú cukorbetegség kialakulásához. A natív inverz agonista szérumban rejlő potenciálja miatt a GPR21 jelátvitelt normális fiziológiai körülmények között szigorúan szabályozzák. Elhízás esetén azonban a megnövekedett GPR21 aktivitás káros lehet, ami elősegítheti az inzulinrezisztencia kialakulását.

Teljes méretű kép

mód

A hím C57BL/6J egereket 4 hetes korban (n = 18, Charles River, Calco, Lecco, Olaszország), szabályozott hőmérsékletű környezetben tartottuk, 12 órás világos/sötét ciklussal. Az állatokat 1 hétig pellet-étrenden tartottuk, majd véletlenszerűen két csoportra osztottuk: normál étrend (kontroll, n = 9) és magas cukortartalmú, magas cukortartalmú étrend (HFHS, n = 9) 16 hétig. A HFHS étrend 45% kcal zsírt, 35% kcal szénhidrátot és 20% kcal fehérjét tartalmazott (D12451, ssniff Spezialdiäten GmbH, Németország). Az ebben a vizsgálatban alkalmazott eljárásokat a Torinói Egyetem Állathasználati és Gondozási Bizottsága, majd az Maynooth Ír Nemzeti Egyetem Etikai Bizottsága (BSRESC-2014-008) hagyta jóvá. A protokollok összhangban voltak a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló 2010/63/EU európai irányelvvel.

Sejtkultúra, transzfekció és kezelés

A HEK293T sejteket teljes tápközegben tartottuk (Dulbecco által módosított Eagle magas glükózszintű táptalaj (DMEM), amely 2 mM L-glutamint és 100 ug/ml penicillin-sztreptomicint tartalmaz), 10% (v/v) szarvasmarha-magzati szérummal (FBS) kiegészítve (Sigma). 37 ° C-on, 5% CO 2 nedvesített atmoszférában. A sejteket 2 μg humán GPR21-vel transzfektáltuk, amely a C-terminális vagy üres vektorba beépített myc-jelet, a pCMV6-Entry (OriGene Technologies), a gyártó protokolljainak megfelelően Lipofectamine® 2000-vel (Invitrogen). Ha együtt transzfektáltuk a G-protein, Gaq, Ga15/16 és Ga14 (cDNS Resource Center) α-alegységeinek megfelelő cDNS-sel, mindegyik plazmidból 1 μg-ot használtunk. A sejteket 24 órán át 37 ° C-on inkubáltuk, hogy lehetővé tegyük a plazmid DNS beépülését. A szérum GPR21 aktivitásra gyakorolt ​​hatásának meghatározásához a sejteket további 24 órán át inkubáltuk friss teljes tápközeg ± 10% (v/v) FBS-sel. A vegyületekkel történő kezelést (GF109203X, U73122 és SP600125, Sigma) teljes szérummentes táptalajban végeztük. A GPR21 inzulinjelzésre gyakorolt ​​hatásának meghatározásához a HEK293T sejteket 100 nM inzulinnal (Sigma) stimuláltuk Kreb Ringer pufferében (KRB); 136 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4,7 mM KCl, 1 mM MgSO 4, 1 mM CaCl 2, 4,0 mM Na 2 HPO 4, 0,95 mM NaH 2 PO 4, pH 7,4, 5 mM glükózt tartalmaz 1 órán át 37 ° C-on,

Inozitol-foszfát (IP-one) homogén fluoreszcencia idő (HTRF)

A sejtes IP 1 szinteket a HTRF IP-one assay kit (Cisbio) 13 segítségével mértük. Röviden, a szubkonfluens sejteket tripszinezéssel elválasztottuk a sejttenyésztő csészétől, és újraszuszpendáltuk a megfelelő térfogatú vizsgálati stimulációs pufferben (10 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 4,2 mM KCl, 146 mM NaCl, 5,5 mM glükóz). . 50 mM LiCl-ot (pH 7,4) 37 ° C-ra melegítünk 6x106 sejt/ml koncentrációig. A sejtszuszpenziót egy fehér fél térfogatú 384-lyukú lemezre (Greiner) adtuk a vizsgált vegyülettel együtt, és 2 órán át 37 ° C-on inkubáltuk. 5% IP-one-d2 konjugátumot tartalmazó IP-one lízispuffert adunk a megfelelő üregekhez, majd 5% anti-IP-one Tb kriptát konjugátumot. A mintákat sötétben inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten. A lemezt egy BMG labte lemezen olvastuk le, 340 nm-en gerjesztett és 615 nm-en és 665 nm-en kibocsátott lemezekkel. A fluoreszcencia-rezonancia-energiaátviteli (FRET) arányokat (665 nm/615 nm) IP 1 koncentrációkká alakítottuk át az IP 1 standard görbe értékeinek interpolálásával. .

Lizátumok előállítása és Western blot elemzés

A fagyasztott egér epididymális zsírpárnákat jéghideg lízispufferben (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 1 mM EGTA, 1,5 mM MgCl2, 2 mM Na 3 VO 4, 10% (v/v) homogenizáltuk. v/v) glicerin, mM Na4P2O7, 1 mM PMSF, 1X SigmaFAST proteáz inhibitor koktél és 1% (v/v) Triton x-100 1: 5 (w: v) arányban egy kézi T10 Basic Homogenizer (IKA). A sejteket háromszor jéghideg foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) mostuk, majd lízispufferben szuszpendáltuk. A nyers extraktumokat keverés közben 1 órán át 4 ° C-on inkubáltuk. A mintákat 17 000 x g sebességgel 10 percig 4 ° C-on centrifugáltuk, az oldhatatlan pelleteket eltávolítottuk, és a fehérjekoncentrációt a Pierce protein assay (PN22660) alkalmazásával határoztuk meg.

Az azonos fehérjekoncentrációjú lizátumokat SDS-PAGE-vel elválasztottuk, PVDF-membránra vittük és Tris-pufferolt sóoldatban (150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,6) 0,1% (v/v) 1 órán át blokkoltuk. ./vol.) Tween -20, 5% (w/v) szarvasmarha-szérum albumint (BSA) tartalmaz. A membránokat primer antitestekkel inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on, majd torma-peroxidázzal konjugált szekunder antitesteket 2 órán át szobahőmérsékleten. A fehérjeszalagokat röntgenképen jelenítettük meg megnövekedett kemilumineszcenciával (Roche). Az immundetektálást a Cell Signaling Technology következő antitestjeivel érték el; foszfo-PKC-k Thr 505 (9374), foszfo-Erk Thr 202/Tyr 204 (4370), Erk (4695), foszfo-p38 Thr 180/Tyr 182 (4511), p38 (9212), foszfo-JNK Thr 183/Tyr 185 (4668), JNK (9258), foszfo-inzulin receptor p Tyr 1150/1151 (3024), IRS1 (3407), foszfo-Akt Ser 473 (9271), Akt (9272), foszfo-AS160 Thr 642 (8881), foszfo-AS160 Ser 588 (8730), AS 160 (2670) és myc (2276). A Phospho-IRS1 Tyr 612-et (44-816G) a Life Technologies szállította, és a β inzulinreceptort (ab69508), a GPR21 (ab139654), az F4/80 (ab74383) és a β-aktint (ab8226) az Abcam cégtől vásároltuk.

2-dezoxi-glükóz felvétele

A glükózfelvételt Yun és mtsai. 18 szerint módosítottuk. A transzfektált HEK293T sejteket egyszer mossuk 37 ° C-ra melegített KRB-vel, majd inkubáljuk 1 μCi/ml [3H] -2-dezoxiglükózzal (PerkinElmer, NET328A001MC), amelyet KRB-ben készítettünk 37 ° C-on 10 percig. A vizsgálat befejezéséhez a sejteket háromszor jéghideg KRB-vel mostuk, és 0,1% (w/v) SDS-ben 37 ° C-on 30 percig lizáltuk. A sejtlizátumokat 1: 4 arányban hígítottuk p-szcintillációs folyadékban (Beta-Plate Scint, PerkinElmer). A [3H] -2-deoxi-glükóz beépülését Wallac 1450 Microbeta Liquid Scintillation Counter (PerkinElmer) alkalmazásával számszerűsítettük, az eredményeket percenként számítva (CPM) fejezzük ki. Az összes fehérjetartalmat a Bicinchoninic Acid 19 eljárással határoztuk meg, hogy az eredményeket CPM/mg-ként határozzuk meg.

GPR21 homológ ligandum modellezés és dokkolás

A GPR21 belső szerkezeti modellt a Biovia Discovery Studio 20-ba épített Modeller szoftver segítségével készítették el. A GPCR templátok (2RH1 21, 4GBR 22) és a hGPR21 (Swissprot csatlakozási kód: Q99679) aminosav-szekvenciáit szekvencia-összehasonlításokkal állítottuk össze, és manuálisan ellenőriztük a 23 konzervált maradékok helyes illesztését. Az igazítás felhasználásával 1000 különféle modell készült, egy későbbi finomítási protokollal, amelyet a 24, 25 hurkok területeire alkalmaztunk. Diszulfidkötések alakultak ki a Cys 102 és a Cys181 között. A végső modellt a Modeller objektív pontszám és a fehérje kiértékelő eszközök segítségével választották ki (//services.mbi.ucla.edu/SAVES/) 26, 27 .

E kifejlesztett fehérjemodell felhasználásával virtuális szűrési folyamatokat hajtottak végre az adatbázisok nagy adatbázisainak (pl. Specs, www.specs.net) in silico vizsgálatára molekuláris dokkoló vizsgálatok révén (OpenEye, Fred 28, 29, 30). A molekulákat standardizáltuk, és a tautomereket és a sztereoizomereket kiszámítottuk Biovia Pipeline Pilot 20 alkalmazásával. A konformátorokat az Openeye-től származó Omega 31, 32, 33 alkalmazásával állítottuk elő, mielőtt a Fred 29-es standard paraméterekkel és a chemgauss3 pontozási funkcióval végzett pontozással dokkoltak volna. A fenti listából 11 vegyületet rendeltek el kísérleti validálás céljából.

Adatelemzés

Az adatokat az átlag ± az átlag standard hibájaként (SEM) mutatjuk be. A párok nélküli Student-féle t-tesztet használtuk a csoportok közötti szignifikancia meghatározásához. Az egyirányú varianciaanalízist (ANOVA) post-hoc Tukey teszttel alkalmaztuk három vagy több csoport közötti szignifikancia meghatározására. A jelentőséget p