elemeket

absztrakt

Az axonális útkeresés pontossága és a funkcionális idegáramkörök kialakulása kulcsfontosságú a test számára az információk feldolgozásához, tárolásához és visszakereséséhez a belső hálózatokból, valamint a környezetből. Úgy gondolják, hogy az axonális migráció variációi hurokképződéshez és önfasikulációhoz vezetnek, ami erősen diszfunkcionális idegrendszerhez vezethet, ezért úgy gondolják, hogy a szinaptogenezis szabályozásának szabályozó mechanizmusa axonális önkorlátozás. Bemutatjuk egy újonnan kifejlesztett, kontaktus nélküli optikai módszer alkalmazását gyengén fókuszált, közel infravörös lézersugárral a rendkívül hatékony axonális vezetéshez, és bemutatjuk az axonális hurkok kialakulását a kortikális neuronokban, megmutatva, hogy a kortikális neuronok maguk is képesek fasciculálni önkerülés. A fény azon képessége, hogy axonális nano-hurkot alkosson, új utakat nyit meg a komplex idegi áramkörök felépítésében és az idegsejtek nem invazív vezetésében nagy távolságban a sérült idegi kapcsolatok és funkciók helyreállításához.

A topográfiai 17 és kémiai 18 ingerek mellett számos más innovatív módszert alkalmaztak, beleértve az elektromos 19, az optikai 20, 21, 22, 23 és hibrid megközelítéseket, például az elektrokémiai 24, az optofluid fluxusokat 25 és a fotokémiai 26 ingereket . axonális irányítás céljából. Míg a meglévő optikai módszerek a vonzó vezetés elvein alapulnak, azt találtuk, hogy a közeli infravörös (NIR) lézersugarak taszító jelként működhetnek 27, 28. Ebben az esetben gyengén fókuszált NIR lézersugarat használtunk a patkányok kortikális axonjainak rendkívül hatékony irányításához, amely lehetővé tette számunkra, hogy különböző sugarú hurkokat alkossunk, és először megfigyeljük az axon fasciculációt. Ennek a technológiának az optikai manipuláció és képalkotás egyéb eszközeivel történő gyorsított megvalósításának és integrálásának köszönhetően hatékony eszközt képviselünk az idegi áramkörök alapvető építőköveinek in vitro nagy hűséggel történő felépítésében és tanulmányozásában, végül a komplex idegi áramkörök megértésében és irányításában. in vivo térbeli és időbeli területeken. Végső soron ez a módszer új lehetőségeket kínálhat az axonok elmozdulásával járó idegrendszeri rendellenességek kezelésére is.

Eredmények és vita

Bár a fényről kiderült, hogy vonzó címkeként működik, miközben a növekedési kúpot közvetlenül megüt (konkrét besugárzási tervekkel), a távolsághatást egy gyengén fókuszált NIR fényforrás felhasználásával használtuk, amely jelenleg szerintünk fototermikus. 28, 29. A hurokképződéshez véletlenszerűen 20xm/h növekedési sebességű axonokat választottunk ki. Továbbá a lézerfoltot nem csak a növekedési kúpotól (GC) keresztirányú távolságban (2 - 8 μm) alkalmazzák, hanem az alacsony NA-objektív (0,5 NA, 20 × mikroszkóp-objektív) axiális távolságra

kortikális

a) Optikai vezeték környezeti kamrával. (b) Bal oldali panel: egy tipikus axon képe kanyar előtt és után. A lézerpont helyzetét piros kör jelzi. Jobb panel: az axon tengely késleltetett időbeli átfedése a lézersugárral való kölcsönhatás után. A kezdeti növekedési kúp irányát nyíl jelzi. Az axon tengelyén különböző időpontokban húzott és egymást átfedő álszínes vonalak. A színek közötti időintervallum 2 perc a színsávon.

Teljes méretű kép

a) Két patkányi kérgi neuron fáziskontraszt képe (a) optikai vezetés előtt és (b) után. Téglalap, amely az optikai vezetés érdekelt területét mutatja. Méret: 50 μm. (c - k) Optikailag előállított axonális hurok időzített képei, amelyek a lézerpontok helyzetét mutatják (piros körök). (l - n) Az axon önbecsülése. Méret: 10 μm.

Teljes méretű kép

A hurokképződés (2k ábra) bemutatja ennek az taszító optikai jelzésnek a példátlan képességét arra, hogy topográfiai határok nélkül teljes kör alakú vezetést érjen el, amelynek lehetővé kell tennie komplex idegi áramkörök létrehozását in situ. Érdekes módon az ezzel a módszerrel kialakított hurok görbületi sugara megfigyelhető

5 μm (megegyezik az in vitro spontán kialakuló véletlenszerű hurokokban észlelt legkisebb sugárral, 1. ábra. Kiegészítés). Az optikailag vezetett hurokképződés után (2k. Ábra), bár feltételeztük, hogy a GC továbbhalad az eredeti axon tengelyen, a patkány optikailag vezetett kérgi axonja tovább nőtt egymás mellett, nagy távolságokon és időn keresztül megfigyelve az öncsilingelést (2. ábra l). - n). Ez elhiteti velünk, hogy az önmegtartóztatási hipotézis nem feltétlenül univerzális minden axontípus esetében, és hogy a specifikus idegsejtek ezt előnyükre használhatják, ha önmagukkal fasciákat képeznek, ezáltal csökkentve a szinaptogenezist 16. Suppl. A 3. és 4. film bemutatja az O-hurok kialakulásának nagyított területét és teljes látóterét, valamint az önfasculációs folyamatot a lézer által kiváltott taszító jel tér-idő modulációjával. A hurokképző folyamatból vett axon tengely kontúr álszínes fedvényeit a Suppl. ÁBRA.

a) A kortikális axon forgásszögének kinetikája, amelyet lézerrel vezérelnek 20x-os mikroszkóppal ellátott lencsével. b) Kumulatív grafikonok a lézerrel irányított axonális forgásszögek eloszlásához. c) A nettó axonális növekedés kinetikája az optikai vezetés során. d) Növekedési sebesség az időmodulált lézersugár többlépcsős forgása során. e) Az axonális vezetés képei időintervallummal (3 perc) egy tér alakú (piros vonallal jelölt) nyalábprofil alkalmazásával. Méret: 10 μm.

Teljes méretű kép

Továbbá megvizsgáltuk, hogy az impulzusos fénycímke segítségével kisebb görbületi sugarakkal kialakíthatók-e axonális hurkok, és hogy a kortikális axon önfasikulációját ilyen éles fordulat modulálja-e. A 2. ábrán A 4A. Ábra mutatja az 5 μm görbületi sugárú axonális hurok lézerrel támogatott gyártásának időintervallumú képeit (a - j) stabilnak találták, a kisebb hurkok stabilitása a hurok sugárának csökkenésével csökkent (4C. Ábra).

(A) Az I hurok felépítése a lézeres axonális vezetés módszerével. (a - j) Optikailag gyártott I-hurok fáziskontraszt képei a kortikális axon teljes tengelyig tartó összeszerelésének időintervallumával (3 perc). Méret: 10 μm. (B) Lézerrel támogatott e-hurok gyártása. (a - d) A patkány agykérgi neuronjában lévő hurok optikai megvalósításának fáziskontraszt képei (4 perc). e - h) Az optikailag vezetett axon öntisztulása és az optikailag elkészített hurok görbületi sugarának csökkentése. Méret: 10 μm. A lézerpontok helyzetét piros körök jelzik. (C) A hurokátmérő változási kinetikája különböző sugarú axonális hurkoknál. (D) Különböző mikrotubulusszámú axonok (10-100 a 10 lépésben) ábrázolja a sugár sugarát és az ekvivalens erőt. A függőleges vonalak (piros: I-hurok, fekete: e-hurok, kék: o-hurok) az axonális hurkok három elért végső görbületi sugarát jelzik.

Teljes méretű kép

(A) A fáziskontrasztos képek gyorsított sorozata, amely patkány kérgi axonokban repulzív optikai jelzéssel szemlélteti a prospektív hurokképződés megakadályozását (vörös karikával jelölt lézerpont). A lézerfoltot 8 perc múlva mozgatták és 23 perc múlva kikapcsolták. A megfigyelések szerint Axon 26 perc múlva elbűvöli önmagát. (B) A relatív szögdinamika a hurokmegelőzés során elfordult a kezdeti (rövid piros nyíl) és a másodlagos (hosszú piros nyíl) optikai vezetés miatt. (C) Relatív hosszdinamika a hurokmegelőzés során a kezdeti (rövid piros nyíl) és a másodlagos (hosszú piros nyíl) optikai vonalak miatt. Az optikai vonal végét fekete nyíl jelöli.

Teljes méretű kép

Az új optikai ingerlő és képalkotó eszközök 40 legújabb fejlődésével lehetőség nyílna egy optikailag generált idegi áramkör számítási jellegének nem invazív, teljes optikai tesztelésére. Ezenkívül infravörös lézert használva az idegsejtek szenzibilizálására a 46 opszint kódoló gének transzfektálásával, valamint két foton optogenetikus 40 stimulációval és 40, 41 optikai képalkotással gyorsan el lehet érni az idegi áramkör kialakulásának és aktivitásának teljes optikai szabályozását. Bár ezt a taszító iránymutatást mindenféle neuron esetében (aranyhal ganglion sejtek, patkány kortikális neuron sejtek és dorsalis gyök ganglion sejtek) mindenütt megtalálhatónak találták, a bio és konform konform nanofoton technológiák integrálásával 47, új lehetőségek a specifikus neuronok genetikailag szenzibilizálására. amelyek adott lézer hullámhosszokra reagálnak, és így szelektíven vezetik őket in vivo .

következtetések

mód

Az ebben a kéziratban leírt kísérleti eljárásokat a Texasi Egyetem szerint hajtották végre az Arlingtoni Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság protokolljában.

A kortikális neuronok kultúrája

Valamennyi kísérleti eljárást az Állatgondozási és Felhasználási Intézményi Bizottság protokollja szerint hajtották végre. A kérgi idegsejteket 18 napig izolálták patkány embrionális embrióiból. A kortikális szöveteket leválasztottuk, megtisztítottuk (meningealis réteg), enzimatikusan disszociáltunk (0,15% tripszin L-15 táptalajban) 20 percig, 37 ° C-on. 0,01%, Sigma) előre bevont fedőüveg polidimetil-sziloxán gáttal (Sylgard 184, Dow corning) és szérummentes táptalajjal (neurobazális közeg). B-27-gyel kiegészítve BDNF-mel és NT-3-mal (10 ng/ml) 3 naponta megváltoztattuk.

Az axonális navigáció beállításai

Az axonális navigáció platformjának vázlata a 2. ábrán látható. 1a. A kikapcsolt állapotban működő hangolható közeli infravörös Ti: zafír sugár (MaiTai HP, Newport-SpectraPhysics) kibillentett tükrökkel meghosszabbodott és továbbított egy fordított mikroszkóp hátsó lézercsatlakozójába (Ti-U Eclipse, Nikon). ). Mechanikus redőnyt (Uniblitz) használtak a lézersugár pulzálására (20 ms BE és 20 ms OFF), hogy megakadályozzák a hőmérséklet folyamatos emelkedését vagy mechanikai kényszert. Dikro tükör segítségével a sugár 20x-os mikroszkóppal (Ph1, NA = 0,5, Nikon) vezetett be a tárgy hátsó nyílásába, amely látható fényt adott át a fáziskontraszt megjelenítéséhez. Az infravörös leválasztó szűrőt használtuk a képalkotási úton a visszavert lézersugár eltávolítására a CCD (Photometrics) elérése érdekében. A lézersugár hullámhosszát és teljesítményét szoftverrel állítottuk be, hogy elérjük a minta 80 mW nyaláb teljesítményét. A mintasíkban lévő lézer teljesítményt úgy számoltuk ki, hogy a céltovábbítási tényezőt megszoroztuk a mikroszkóp objektív hátsó rekeszén mért teljesítménnyel, standard fénymérővel (PM 100D, Thorlabs). Az optikai irányítás elérése érdekében a nyalábot az axonok filopódiáin kívülre helyezték, aszimmetrikusan a növekvő axonok útjába.

A növekedési kúp orientációjának mérése

A kezdeti axonális orientációt referenciaként tüntettük fel, és a következő elágazásokat mértük ehhez a kezdeti helyzethez képest. A növekedési kúpra ható erő alkalmazásával a növekedési kúp megakadályozza a lézerfoltot is. Ehhez kiderült, hogy a GC nemcsak elfordul a lézerponttól, hanem visszafordul. Ezt a forgási dinamikát úgy számszerűsítettük, hogy a növekedési kúp vetületének változását egy sík felületre rögzítettük Image J szoftver segítségével. Amikor a GC felemelkedik a felszínről, csak a vetített hosszakat látjuk X és Y irányban. Könnyen elérhetjük a szöget a forgás.

A tengelyirányú hajlítási sugár meghatározásához szükséges ekvivalens erő elméleti számítása

A mikrotubulusok olyan hosszú rostok, amelyek útvonalakként szolgálnak az intercelluláris motorfehérjék számára, és megkönnyítik az eukarióta sejtek szerkezeti funkcióit. Egy tipikus axonban úgy gondolják, hogy 10-100 ilyen mikrotubulus van jelen az axonális tengely bármely adott keresztmetszetében. Az axon növekedési kúp polimerizációs folyamatait aszimmetrikusan modulálja a közeli infravörös lézersugár által létrehozott fototermikus gradiens, ami kémiailag átadott "ekvivalens erőt" eredményez. Az axon csúcsán lévő erő (növekedési kúp) által okozott alakváltozás vagy hajlítás elemzéséhez az axont szabályos és egyenletes keresztmetszetű gerendaként modelleztük, lineáris elasztikus anyagból (mikrotubulusok, amelyeknek merevsége 48 hajlítás) ). ), amely homogén és izotróp az axonális terminálra koncentrált terheléssel. Az ezen eltérések számszerűsítésére használt módszertanok elvben analitikai vagy analitikai módszerekbe sorolhatók. Az analitikai módszer Euler-Bernoulli (EB) elméletén alapszik, amely eszközt nyújt az ilyen eltérések számszerűsítésére. Ezután a végeselemes eljárást alkalmazzuk az axonális tengely hajlítási görbületi sugarának állandó, a csúcsra kifejtett erőhatásának megoldására. A kiegészítő módszerekben leírt részletek.