közösség

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • Jelentős különbség a filogenetikai összetételekben a sertések három helye között
  • A vékonybél és a vakbél bélmikrobiomjának funkcionális kapacitásának összehasonlítása
  • A mikrobaközösség szerkezetének összehasonlítása a különböző bélhelyzetekben egyértelmű zsírtartalmú sertések között
  • A bélmikrobák összehasonlító funkcionális kapacitása a nagy és alacsony tömegű sertések között
  • vita
  • Anyagok és metódusok
  • Állatok és belsőségek luminális mintáinak összegyűjtése
  • A 16S rRNS gének luminalis DNS-extrakciója és szekvenciaelemzése
  • DNS fájlok és könyvtárak felépítése a metagenomikus szekvenáláshoz
  • Rövid leolvasások összeszerelése
  • Génjóslás és funkcionális osztályozás
  • Filogenetikai összetétel elemzés metagenomikus szekvenálási adatok alapján
  • A bélmikrobák funkcionális kapacitásának összehasonlítása
  • További részletek
  • További információ
  • Word dokumentumok
  • További információ
  • Hozzászólások

elemeket

absztrakt

Ebben a tanulmányban a 16S rRNS génszekvenálás és a nagy áteresztőképességű metagenomikus szekvenálás módszerére összpontosítottunk a jejunum, ileum és függelék mikrobiális közösségének felépítésének és potenciális funkcionális képességének tisztázására Laiwu kínai sertésekben, amelyek erős zsírtartalmú tárolási képesség. Összehasonlítottuk a mikrobák összetételét és a potenciális funkcionális kapacitását három bélhely között, és értékeltük a bél mikrobiota hatását a sertés tárolására.

az eredmény

Jelentős különbség a filogenetikai összetételekben a sertések három helye között

A bél különböző helyein található baktériumközösségek filogenetikai összetételének jellemzésére először elvégeztük a 16S rRNS gének szekvenciaelemzését, és összehasonlítottuk a jejunum, az ileum és a cecum közötti mikrobiota alfa-sokféleségét. A Cecumnak szignifikánsan magasabb Shannon-indexe volt (figyelembe véve a fajok számát és a fajok egyensúlyát), mint a jejunum és az ileum (P

Az elemzéseket a 16S rRNS V4 régió adatain végeztük. A mintaneveket fajta (Lw, Laiwu fajta), a mintavételi hely (Je, Jejunum; Il, Ileum; Ce, Cecum) és a zsírraktározási állapot (Ob, magas zsírtartalmú, Le, alacsony zsírtartalmú) szerint kódolják. Például az LwI10b egy minta a Laiwu nagy zsírtartalmú sertések ileumjából. Ugyanarról a sertésről gyűjtöttünk mintákat, amelyeknek a minta neve azonos arab számmal történt. A. Az alfa-diverzitás összehasonlítása a Shannon-diverzitás index alapján, a mintavételi hely és a zsírraktározási állapot szerint csoportosítva (átlag ± SEM). Az ileumhoz és a jejunumhoz képest a vakbél lényegesen nagyobb mikrobiális gazdagsággal rendelkezik. ( B ) Az UniFrac súlyozatlan fő koordinátanalízise bakteriális mikrobiot segítségével. A vékonybél (ileum és jejunum) és a függelék mintái egyértelmű elválasztást mutatnak ( C ) Bray-curtis fürtfa. Az azonos bél lokalizációs trendből származó mintákat összesítjük.

Teljes méretű kép

Ezután megvizsgáltuk a filogenetikai változatosság változását az összes tesztelt minta között. A vakbélmintákba egyesített LwIlLe.5 minta kivételével az összes többi minta egyértelmű aggregációt mutatott a vékonybél (jejunum és ileum) és a vakbél között a súlyozatlan főkoordinátanalízisben (PCoA) (1B. Ábra). Hasonlóképpen, bár a vakbélből származó LwCeOb.4 filogenetikai összetétele hasonló volt az ileum mintákéhoz, és az ileumból származó LwIlLe.5 minta hasonlóságot mutatott a vakbélmintákkal, a legtöbb minta a vékonybél és a vakbél között eltérő filogenetikai összetételt mutatott a Bray C-ben. 1C). A fenti két minta eltérő béta-sokféleségének a zsírállapotoknak kell lenniük (lásd alább). Azonban a jejunum és az ileum minták között nem figyeltünk meg egyértelmű összefonódást.

( A ) Mikrobiális összetétel törzs szinten. A mintákat a vízszintes tengely mentén mutatjuk be, a relatív bőséget pedig a függőleges tengely jelzi. ( B ) Hőtérkép, amely 18 nemzetséget mutat, a relatív ábrázolásban jelentős eltérések mutatkoznak a három bélhely között. A térkép térképe színkódolt a sorban levő z-pontszám alapján.

Teljes méretű kép

Metagenomikus szekvenálási adatokat használtak a jejunum, az ileum és a cecum közötti mikrobaközösségek szerkezetének összehasonlítására is. A Laiwu sertések három bélhelyéről összesen 6 luminalis DNS-állományt használtak fel a metagenomikus szekvenálásra szolgáló könyvtárak összeállításához. Mindegyik hely két DNS-készletet biztosított, köztük az egyiket magas zsírtartalmú sertésekből, a másikat alacsony zsírtartalmú sertésekből (módszerek). Minden DNS-csoportra átlagosan 11,43 Gb nyers adatot kaptunk, 9,22 Gb és 14,29 Gb között (1. táblázat). Az alacsony minőségű és a gazda szennyezettségének szűrése után 3,53–5,01 Gb nettó adatot kaptunk minden egyes mintára. Az összes rövid szekvencia adatait de novo módon állítottuk össze a SOAPden assembler (1.06-os verzió) segítségével 17. A hat DNS-minta folytonosságának száma 40 420 és 139 978 között mozgott, az érintkezés hossza> 500 bp (1. táblázat). A MetaGeneMark programot (MGM) használták az egyes kontigok nyitott olvasási keretének (ORF) előrejelzésére (lásd a módszereket). Hat minta összesen 1 056 020 ORF-et tartalmazott, amelyek 100 bp-nál hosszabbak voltak (1. táblázat).

Asztal teljes méretben

Ezután a három bélhely mikrobiális közösségének szerkezetét hasonlítottuk össze a metagenomikus szekvenálási adatok alapján. Mindhárom bél helyének mikrobiotikumában a baktérium királyság dominált, amely az összes elolvasott rövid szekvencia több mint 90% -át foglalta el. A mikrobiális összetétel meglehetősen hasonló volt a 16S rRNS génszekvencia-analízisben szereplő törzsszintű összetételhez (további S2. Ábra). A metagenomikus szekvencia elemzés javította a filotípusok felbontását a nemzetség szintjétől a faj szintjéig. Jelentős küszöbértéknél P 18, Faecalibacterium prausnitzii 19 és Butyrivibrio fibrisolvens 20 (3A. Ábra és az S2 kiegészítő táblázat).

( A ) A hőtérkép 21 olyan baktériumfaj relatív számát mutatja, amelyek jelentősen gazdagodtak a jejunumban, az ileumban és a vakbélben. ( B ) A CAZ funkcionális kifejezéseinek hőtérképe, amelyek szignifikánsan eltérő gazdagodást mutattak a jejunum, az ileum és a cecum között. GH: glikozid-hidroáz, GT: glikozil-transzferáz, PL: poliszacharid-liáz, CE: szénhidrogén-észterázok, CBM: szénhidrogén-kötő modul. ( C ) A KEGG alrendszerek termikus térképe jelentősen gazdagabb a jejunumban, az ileumban és a cecumban.

Teljes méretű kép

A vékonybél és a vakbél bélmikrobiomjának funkcionális kapacitásának összehasonlítása

A mikrobaközösség szerkezetének összehasonlítása a különböző bélhelyzetekben tiszta zsírtartalmú sertések között

A bélmikrobák összehasonlító funkcionális kapacitása a nagy és alacsony tömegű sertések között

( A - C ) mutatják a CAZy funkcionális kifejezéseinek relatív számának összehasonlítását a magas és alacsony zsírtartalmú sertések között a jejunumban, az ileumban és a függelékben. GH: glikozid-hidroáz, GT: glikozil-transzferáz, PL: poliszacharid-liáz, CE: szénhidrogén-észterázok, CBM: szénhidrogén-kötő modul. ( D - F ) jelzi a KEGG alrendszerek relatív számának összehasonlítását a magas és alacsony sertés sertések között a jejunumban, az ileumban és a függelékben.

Teljes méretű kép

A KEGG annotációt alkalmazták a bél mikrobiom funkcionális kapacitásának további összehasonlítására az alacsony és a magas zsírtartalmú sertések között. A jejunumban a piruvát anyagcserével, a propanoát anyagcserével, valamint a cisztein és metionin anyagcserével kapcsolatos gének jelentősen gazdagodtak a magas zsírtartalmú sertés metagenomában (4D. Ábra). A pirimidin anyagcseréjéhez, a szekréciós rendszerhez és a folsav bioszintéziséhez kapcsolódó géneknél azonban több sertés volt kis súlyú sertéseknél. Az ileumban a glikán lebomlásával, a pirimidin metabolizmusával, a glikozaminoglikán lebomlásával és a glikoszfingolipid bioszintézissel kapcsolatos gének gyakoribbak voltak az alacsony zsírtartalmú sertésekben (4E. Ábra), míg az antigén feldolgozása és bemutatása, az A influenza jelátviteli útja, a MAPK és az endokrin magas zsírtartalom disznók. A vakbélben az adipocitokin jelátviteli út, a sejt antigén, valamint a fehérje emésztése és felszívódása az alacsony zsírtartalmú sertések nagyobb dúsulását mutatta. A kétkomponensű rendszer, a benzoát lebomlása és a bakteriális kemotaxis azonban jelentősen gazdagodott a magas zsírtartalmú sertés metagómákban (4F. Ábra).

vita

Számos vizsgálatot végeztek a sertések bélmikrobiális összetételével a 16S rRNS 26, 27, 28 gének szekvenálása alapján. Tudomásunk szerint a sertések metagenomikus szekvenálásának elemzéséről csak néhány jelentés található, amely képes értékelni a mikrobiális közösség szerkezetét faji szinten a bél különböző helyein. Ebben a tanulmányban három bélhelyen hasonlítottuk össze a mikrobaközösségek szerkezetét, jellemeztük a sertés mikrobiom funkcionális képességét elölről és hátulról, és nagy teljesítményű következő generációs szekvenálással vizsgáltuk a bél mikrobioma és a sertészsír közötti potenciális kapcsolatot. Tudomásunk szerint ez az első jelentés a jejunum sertések mikrobiális közösségszerkezetének átfogó elemzéséről és a sertészsírhoz kapcsolódó bélbaktériumfajok értékeléséről.

A KEGG elemzés során a foszfotranszferáz (PTS) rendszer jelentősen gazdagodott a vékonybélben. A PTS egy komplex csoport transzlokációs rendszer, amely számos baktériumban jelen van. Cukorokat (például mannózt, glükózt és mannitot) szállít a sejtbe, és a foszfotranszferáz révén foszforilálja a szubsztrátot a szállítás során. Ezzel az eredménnyel összhangban a CAZγ metagenómák funkcionális annotációi azt is feltárták, hogy a vékonybélben lévő mikrobiom hajlamos a kismolekulájú tápanyagok, például a monoszacharid metabolizálására. Zoetendal és mtsai. 32 azt is javasolta, hogy az egyszerű szénhidrátok (például glükóz és maltóz) gyors felvétele és fermentálása hozzájáruljon a vékonybél mikrobiotájának fenntartásához. A PTS útvonalhoz kapcsolódó gének nagy része a vékonybélben található Clostridiumból származott. Ez az eredmény összhangban állt azzal a ténnyel, hogy 12 Clostridium faj gazdagodott a jejunusban és az ileumban. Ismert, hogy sok Clostridia képes megemészteni a tejsavót és a cukrot, hogy butanolt, propionsavat, étert és glicerint képezzen. Valójában a butanoát- és zsírsavcsere-alrendszerek magasabbak voltak a jejunumban és az ileumban (3C. Ábra).

A magas zsírtartalmú sertéseknél a Prevotella spp. és a Bacteroides spp. az ileumban és a függelékben. Ivarsson és mtsai. 42 arról számolt be, hogy a növekvő sertésekben a Prevotella - Porphyry baktériumok mennyisége pozitívan korrelált a poliszacharidok rövid láncú zsírsavakkal (SCFA) való fermentációs képességével. Egy olyan egereken végzett vizsgálat, amely nem elhízott ikrektől ültette át az emberi széklet mikrobiotáját, kimutatta, hogy a bél SCFA bél mikrobioljának növekedése befolyásolta a gazda energiaegyensúlyát, gátolta a zsír felhalmozódását a zsírszövetben, és elősegítette a leptin szintjét 43. Ezenkívül a Bacteroides - Prevotella negatív összefüggést mutatott a zsírtömeg kialakulásával és a gyulladással az étrend okozta elhízott egerekben 44 .

Másrészt a mikrobiális anyagcserének és a tápanyagok érzékelésének (anyagcsere-reakció) a sertészsírral is összefüggésben kell lennie. A jejunumban a magas zsírtartalmú sertések számos anyagcserével kapcsolatos alrendszerhez dúsultak, pl. Cisztein és metionin anyagcsere. A vakbélben nagy zsírtartalmú sertésekben gazdagodtak a sejtek mozgékonyságához (flagellátus-összeállítás) és a membrántranszporthoz (kétkomponensű rendszer és transzporterek) kötődő KEGG-utak. Ezekről a KEGG-kategóriákról azt is beszámolták, hogy főként az elhízott egerek vastagbélének disztális mikrobiomjában gazdagodnak egerekben és emberekben 5, 8, 45, valamint az egerek által kiváltott magas zsírtartalmú étrendben 39. A kétkomponensű rendszer részt vesz a szignáltranszdukció és a 46, 47 baktériumok kemotaxisának mechanizmusában, és metabolikus reakcióközpontként használható, kombinálva a tápanyag érzékelést a monoszacharid metabolizmus dinamikus szabályozásával 48 .

Összegzésként megállapítottuk, hogy a vékonybél és a függelék között világos a mikrobaközösségek szerkezete, és több tucat baktériumfajt azonosítottunk, amelyek a bél egyes helyein szignifikáns különbségeket mutattak a relatív bőségben. Megtaláltuk a mikrobiom egyértelmű funkcionális kapacitását a vékonybél és a vakbél között. Javasoltuk, hogy a potenciális kórokozók (pl. Escherichia spp.), A gyulladásos folyamatok, a mikrobiális anyagcsere és a tápanyagok érzékelése vegyenek részt a sertések magas zsírtartalmában. Ezenkívül a magasabb baktériumszint és a Prevotelly gátolhatja a zsírfejlődést és a gyulladást az alacsony zsírtartalmú sertéseknél. Ezek az eredmények érdekes betekintést nyújthatnak a sertések gyomor-bélrendszeri mikrobiális közösségének összetettségébe, és segíthetnek jobban megérteni a bél mikrobiota hatásait a sertéstermelés jeleire.

Anyagok és metódusok

Állatok és belsőségek luminális mintáinak összegyűjtése

A 16S rRNS gének luminalis DNS-extrakciója és szekvenciaelemzése

DNS fájlok és könyvtárak felépítése a metagenomikus szekvenáláshoz

Két jejunum, ileum és cecum DNS-készletet készítettünk mindegyik állat azonos mennyiségű luminalis DNS-ével, és metagenomikus szekvenálást biztosítottunk, köztük egy 4 nagy zsírtartalmú sertésből származó DNS-készletet és egy 4 alacsony alacsony zsírtartalmú sertésből álló DNS-készletet kövér disznók. A metagenomikus szekvenálás DNS-könyvtárait a gyártó utasításai szerint készítettük (Illumina, USA). Mindegyik DNS-készletet párosított végek könyvtáraként állítottuk össze, amelyek inszert méretűek voltak

350 bázispár. Qin és munkatársai által leírt protokollt használtuk. 56 fürtgenerálás és szekvenálás elvégzése a Hiseq 2000 platformon (Illumina, USA). A metagenomikus szekvenálási adatokat az NCBI rövid olvasási archívumában tároltuk (hozzáférési számok az S6. Kiegészítő táblázatban).

Rövid leolvasások összeszerelése

Először a nyers adatokat dolgoztuk fel a gyenge minőségű és a szennyezett szekvenciák kiszűrésére egy belső eljárás alapján: I. Háromnál több ismeretlen bázist vagy folyamatosan alacsony minőségű bázist tartalmazó olvasási rekordokat eltávolítottunk; II. Az adapter szennyeződéseit és duplikációit csonkították; III. A sertések referencia genomi szekvenciájához feltérképezett leolvasásokat eltávolítottuk a további elemzésből. Ezután a kiváló minőségű rövid leolvasások de novo összeszerelését a SOAP de novo assembler (v1.06) 17 végezte el. Folytonos szekvenciákat, egyértelmű kereszteződésekkel tekintettünk folytatásnak.

Génjóslás és funkcionális osztályozás

A MetaGeneMark-ot (MGM, v2.10) használtuk az ORF-ek teljes tartományának előrejelzésére az egyes minták 57-ből. Cd-hit szoftvert (v4.6.1) használtunk a redundáns gének kizárására az összes feltételezett ORF-ből 58. Egy pár rendezett hosszúságú gént, amelyek a rövidebb gén több mint 90% -át és az identitás> 95% -át fedik le, csoportosítottuk. És akkor a csoportot megosztó gének összeolvadtak. Az egyesült csoportot a leghosszabb gén képviselte. A csoport többi tagját szabadon engedték. A redundancia eltávolításával egy nem redundáns génkészlet készült. Végül a nem redundáns géneket összehasonlítottuk a KEGG 22 (v59) és a CAZy 21 adatbázisok (szénhidrátokban aktív enzimek) fehérjeszekvenciáival a BLAST eszköz (v2.2.21) alkalmazásával, amelynek e-értéke ≤ 1 × 10 -5 és küszöbértéke ≥ 40%. Az annotált gének bekerültek a KEGG útvonalakba. A gének mikrobákra való visszavezetése érdekében a gének fehérjeszekvenciáit összehasonlítottuk a baktériumok referenciafehérjéinek kiadott adatbázisával a blastp eszközzel, amelynek e-értéke ≤ 1 x 10-40. A legmagasabb pontszámot a további elemzéshez megtartottuk.

Filogenetikai összetétel elemzés metagenomikus szekvenálási adatok alapján

Az ismert baktériumok, gombák, vírusok és archaebaktériumok letöltésével létrehozták a redundáns sertés referencia gének katalógusát. A SOAP kiegyenlítőt (v2.21) alkalmazták a kiváló minőségű leolvasási szekvenciák mikrobiális közösségekhez történő feltérképezéséhez a referencia gén 59 katalógus alapján. A központi határtétel szerint a tesztmintákban lévő mikrobiális relatív mennyiség átlagos értékei, amelyekből a mintákat a populációból vették, követik a normális eloszlást. ANOVA-t használtunk a filogenetikai összetétel összehasonlítására a három bélhely között. Fisher pontos tesztjét alkalmazták két nagy és alacsony tömegű sertés mintájának összehasonlítására. Mikrobák, amelyek relatív bőségaránya 60. Valamennyi tesztet STAMP 53 szoftverrel hajtottuk végre .

A bélmikrobák funkcionális kapacitásának összehasonlítása

A bélmikrobiomák funkcionális kapacitásának összehasonlítása érdekében az annotált gének bőségét a következőképpen normalizáltuk: (az egyes génekhez feltérképezett olvasások száma/a tiszta olvasások teljes száma) * 100000. A CAZy családok és a KEGG útvonalak egyes alosztályainak relatív bőségét úgy számoltuk, hogy összeadtuk ezen funkcionális alrendszerhez annotált gének bőségét. A funkcionális kapacitásprofilok összehasonlítását a magas és alacsony zsírtartalmú sertések között Fisher pontos tesztjével végeztük. ANOVA tesztet használtunk a mikrobiomák funkcionális kapacitásának összehasonlítására három bélhely között. A Z-pontszámokat kiszámítottuk a hőtérképek elkészítéséhez a KEGG és a CAZy alrendszerek relatív bőségének bemutatására az egyes mintákban. Tukey-Kramer post-hoc tesztet alkalmaztunk páronkénti összehasonlítás céljából. A Story FDR-jét több összehasonlítás helyesbítésére használták 60. Az összes tesztet a STAMP szoftver 53 alkalmazásával hajtottuk végre .

További részletek

Hogyan lehet idézni ezt a cikket: Yang, H. és mtsai. A mikrobiális közösség szerkezetének és a metagenomika összetételének feltárása a különféle zsírtartalmú sertések három bélhelyen. Sci. ismétlés. 6., 27427; doi: 10.1038/srep27427 (2016).

További információ

Word dokumentumok

További információ

Hozzászólások

Megjegyzés benyújtásával elfogadja az Általános Szerződési Feltételeinket és a közösségi irányelveket. Ha bármi sértőnek vagy összeegyeztethetetlennek tűnik a feltételeinkkel vagy irányelveinkkel, jelölje meg nem megfelelőként.