immunproteaszóma

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • Az LMP7-hiányos egerek ellenállnak a HFD által kiváltott elhízásnak
  • Az LMP7-hiányos egerek rezisztensek a HFD által kiváltott anyagcserezavarokra
  • Az LMP7 hiánya nincs hatással a táplálékfelvételre, a mozgásszervi aktivitásra és az energiafelhasználásra
  • Az LMP7 hiány csökkenti a lipid felszívódást
  • A csontvelő és a nem csontvelő sejtekben található LMP7 hozzájárul az elhízás kialakulásához
  • Az LMP7 hiánya enyhíti a zsírszövet gyulladásos reakcióit
  • vita
  • mód
  • vadállat
  • Mikro-CT elemzés
  • Biokémiai teszt
  • GTT és ITT
  • Szövettan és immunhisztokémia
  • Valós idejű RT-PCR elemzés
  • BMT kísérletek
  • A légzési gázok és a mozgásszervi rendszer elemzése
  • Széklet gyűjtése és széklet lipidjeinek kivonása
  • Áramlási citometriás elemzés
  • Kísérletek in vitro
  • Statisztikai analízis
  • További részletek
  • További információ
  • PDF fájlok
  • További információ
  • Hozzászólások

elemeket

  • Endokrin rendszer és anyagcsere-betegségek
  • Metabolikus szindróma
  • Elhízottság

absztrakt

Az elhízás az inzulinrezisztencia, a hiperglikémia, a diszlipidémia és a magas vérnyomás, az úgynevezett metabolikus szindróma egyik fő kockázati tényezője, és globális közegészségügyi problémává vált. Ezek az anyagcserezavarok növelik a szív- és érrendszeri betegségek és a 2-es típusú diabetes mellitus kockázatát, és hozzájárulnak a megnövekedett halálozáshoz és morbiditáshoz. Bár az elhízás patogenezise összetett és különféle tényezőket foglal magában, a legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a zsírszövet gyulladása kulcsfontosságú kórokozó 1, 2. Valójában az elhízás állatmodelljeiben, valamint metabolikus szindrómában szenvedő elhízott embereknél megfigyelhető a zsírszövetbe történő makrofág infiltráció. Ezek a sejtek a gyulladásos citokin/kemokin termelés egyik fő forrása, ideértve a tumor nekrózis faktor α (TNF-α), az interleukin (IL) -1β és a CC motívum kemokin ligandum 2 (CCL2), más néven monocita kemoattraktáns protein-1 [ MCP-1].), Amelyek viszont gyulladásos sejteket nyernek, és tovább elősegítik a zsírszövet gyulladását. Azonban még nem teljesen világos, hogy a gyulladás hogyan fordul elő, és melyeket szabályoz az elhízás patofiziológiája.

az eredmény

Az LMP7-hiányos egerek ellenállnak a HFD által kiváltott elhízásnak

Először megvizsgáltuk, hogy az LMP7 hiány befolyásolhatja-e az elhízás kialakulását a vad típusú (WT) egerekben és az LMP7 -/- egerekben, akiket normál étrenddel vagy HFD-vel tápláltak 8 héten keresztül. Bár a WT és az LMP7 -/- egerek között normális étrend mellett nem volt szignifikáns különbség a testtömeg-gyarapodásban, az LMP7 -/- egerek testtömeg-gyarapodása lényegesen kevesebb volt, mint a magas zsírtartalmú étrenden (HFD) szenvedő WT-egereknél (1A. Ábra) Az epididymális és a szubkután fehér zsírszövet (WAT) súlya drasztikusan csökkent az LMP7 -/- egerekben a WT egerek súlyához képest (1B. Ábra). Az egyes WAT-ok relatív súlya (szöveti tömeg/testtömeg) az LMP7 -/- egerekben alacsonyabb volt, mint a WT egerekben (1C. Ábra, máj: 15,9% -os csökkenés, epididymális: 44,7%, mesenterialis: 24,9%, perirenalis: 50,7 % és szubkután: 47,3%). A csökkenés szövettanilag az epididymális és a szubkután WAT csökkent adipocita méretének volt tulajdonítható (1D. Ábra, E). A számítógépes tomográfia (CT) elemzése alacsonyabb zsigeri és szubkután zsírtömeget mutatott az LMP7 -/- egerekben, mint a WT egerekben (1F. Ábra, G). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az LMP7 hiánya védett a HFD által kiváltott elhízás ellen.

( A - C ) A szérum TCHO, TG szintek ( A ), vércukorszint ( B ) és a szérum inzulin ( C ) WT és LMP7 -/- egerekben normál étrenden és HFD esetén (n = 8–12). ( D, E ) GTT eredmények ( D ) és az ITT ( E ) WT és LMP7 -/- egerekben normál étrenden és HFD esetén (n = 8 mindegyiknél). Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. * p -/- akár normál étrenden, akár HFD-n (3A. ábra), mindkét törzsben mértük a mozgásszervi aktivitást és az energiafelhasználást, hogy értékeljük a bazális anyagcsere arányának különbségeit. Nem találtunk szignifikáns különbséget a mozgásszervi aktivitásban, az oxigénfogyasztásban (VO 2), a légzési csere sebességben (RER), a szénhidrátfogyasztásban (CH) és a zsírfogyasztásban (FAT) a normál étrendben vagy HFD diétában lévő WT és LMP7 -/- egerek között. . (3B, C ábra). Ennek az eredménynek az alátámasztása érdekében, bár az Ucp1 (nem kötő fehérje 1 vagy termogenin) expressziója megnőtt a barna zsírszövetben HFD táplálással, a WT és az LMP7 -/- egerek között nem volt szignifikáns különbség az expresszióban (az adatokat nem mutatjuk be).

( A ) Ételbevitel WT és LMP7 -/- egerekben normál étrenden (n = 7–8) és HFD (n = 13–14). ( B ) Mozgásszervi aktivitás WT és LMP7 -/- egerekben normál étrenden és HFD esetén (n = 8 mindegyiknél). C. Az energiafelhasználásra vonatkozó adatok. VO 2, RER, CH és FAT WT és LMP7 -/- egerekben normál étrenden és HFD esetén (n = 8 mindegyiknél). Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki.

Teljes méretű kép

Az LMP7 hiány csökkenti a lipid felszívódást

Az LMP7 hiány WAT gyulladáscsökkentő hatásának vizsgálatához végül felmértük, hogy az adiponektin és a leptin részt vesz-e ebben a folyamatban. A szérum adiponektin szintje szignifikánsan magasabb volt a HMPD-vel táplált LMP7 -/- egerekben, mint a HFD-vel táplált WT egerekben (6G. Ábra). Ennek megfelelően az Adipoq expresszióját, amely az adiponektint kódolja, az LMP7 -/- egerek epididymális WAT-jában is szabályozták (S3. Kiegészítő ábra). A Pparg (peroxiszóma-proliferátor-aktivált receptor γ), a Cebpa (CCAAT/fokozót megkötő fehérje [C/EBP] -a) és a Cebpb (C/EBP-β) által kódolt transzkripciós faktorok ismerten indukálhatók az Adipoq 12 expressziójával, 13. Mindezen transzkripciós faktorok expressziója szignifikánsan megnőtt az LMP7 -/- egerekben a WT egerekhez képest (S3. Kiegészítő ábra). A szérum leptin szintje szignifikánsan megemelkedett a HFD-vel táplált WT egerekben, és ezek a szintek szignifikánsan csökkentek a HFD-vel táplált LMP7 -/- egerekben (6H ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az adiponektin és a leptin szerepet játszik a zsírszövet gyulladásának és anyagcserezavarainak enyhítésében LMP7 -/egerekben. - .

vita

A vizsgálat fő megállapításai a következők: (1) Az LMP7 hiány csökkentette a HFD által kiváltott zsírfelhalmozódást és védett volt az elhízás ellen; (2) Az LMP7-hiány javította a glükóz intoleranciát és az inzulinérzékenységet, valamint javította a lipid- és glükóz-anyagcserét (3) a WT és az LMP7 -/- egerek között nem volt különbség a táplálékbevitel, a mozgásszervi aktivitás és az energiafelhasználás között; (4) Az LMP7 hiány csökkentette a lipid felszívódást; (5) BMT kísérletek azt mutatták, hogy az LMP7 mind a csontvelőből származó, mind a csontvelőből származó sejtekben hozzájárult a HFD által kiváltott elhízás kialakulásához; (6) Az LMP hiánya csökkentette a gyulladásos reakciókat, például a makrofág infiltrációt és a kemokin expressziót, miközben növelte az adiponekciós termelést. E tanulmány eredményei arra utalnak, hogy az LMP7 hozzájárul a makrofágok zsírszövetének gyulladásos reakcióihoz, valamint az elhízás és az anyagcserezavarok kialakulásához. Tudomásunk szerint ez a tanulmány az első bizonyíték arra, hogy az LMP7 fontos szerepet játszik az elhízás és az anyagcserezavarok kialakulásában.

Egyre több bizonyíték utal arra, hogy a gyulladás fontos szerepet játszik az elhízás és az anyagcserezavarok kialakulásában. 1, 2. Bár számos jelentés ismerteti a gyulladás szerepét a folyamatukban, nem teljesen világos, hogy a gyulladás hogyan fordul elő és hogyan szabályozott. Bár ismert, hogy az immunproteazóma alapvető szerepet játszik az MHC I. osztályú antigén bemutatásában, a legújabb kutatások kimutatták, hogy az LMP7 szükséges a gyulladásgátló citokinek, például a TNF-α és az IL-6 előállításához, valamint a kísérleti folyamatok előrehaladásához. ízületi gyulladás és vastagbélgyulladás 5, 6. Ebben a tanulmányban bebizonyítottuk, hogy az LMP7 hiány gátolja a zsírszövet gyulladását, az elhízást és az anyagcserezavarokat: ez arra utal, hogy az LMP7 gátlása megakadályozhatja és kezelheti az elhízást és az anyagcserezavarokat. Valójában számos kísérleti vizsgálat azt mutatja, hogy az ONX-0914 szelektív LMP7 inhibitor nagyon hatékony a kísérleti ízületi gyulladás és vastagbélgyulladás 5, 6 kezelésében. Ennek a LMP7-gátlónak az elhízásra és az anyagcserezavarokra gyakorolt ​​hatását ezért a jövőbeli vizsgálatok során meg kell vizsgálni.

Kimutattuk, hogy az LMP7 hiány csökkentette a hasnyálmirigy lipázainak expresszióját, megnövelte a széklet lipidtartalmát és gátolta a plazma TG szintjének emelkedését olaj vagy HFD orális beadása után. Másrészt az LMP7 -/- egerek szérum glükóz- és inzulinszintjét nem befolyásolta a normál étrend. Az LMP7 -/- egerek javították a glükóz intoleranciát és az inzulinérzékenységet. Így az LMP7 befolyásolja a hasnyálmirigy külső és belső szekréciós funkcióját, és részt vesz az emésztésben és a hormonális homeosztázisban, ami fontos lenne az egerek metabolikus állapotában.

Összegzésként egyértelműen kimutattuk, hogy az LMP7-hiány gátolja a makrofágok által kiváltott gyulladást a zsírszövetben, és javítja az elhízás és az anyagcsere-rendellenességek kialakulását a HFD-vel táplált egerekben. Megállapításaink alapján feltételezzük, hogy az LMP7 hiány gátolja a zsírszövet gyulladását azáltal, hogy gátolja a proinflammatorikus citokin indukciót a makrofágokban és az adipocyták által termelt adiponeculációt. Ezenkívül az LMP7 befolyásolja a hasnyálmirigy külső és belső szekréciós funkcióját. Ez a tanulmány nemcsak azt bizonyítja, hogy az LMP7 potenciális terápiás célpont lehet az elhízás és az anyagcserezavarok megelőzésében és kezelésében, hanem új betekintést nyújt e rendellenességek patofiziológiájának hátterében álló mechanizmusba is.

mód

Valamennyi állatkísérletet a Jichi Orvostudományi Egyetem Laboratóriumi Állatkézikönyv Kísérleti Állatok Felhasználási és Gondozási Bizottsága hagyta jóvá, és a Jichi Orvostudományi Egyetem irányelveinek megfelelően hajtották végre. A C57BL/6J WT egereket a Japan SLC, Inc. cégtől szereztük be. (Hamamatsu, Japán). Az LMP7 -/- egereket korábban leírták 4. A hím egereket (9-10 hetesek) 60 kcal% HFD-vel (Research Diets: D12492, Japan LSG, Tokió) vagy standard chow-val (CE-2; CLEA Japan Inc., Osaka) etettük. Minden egeret 2 hetente lemértünk. A végpontokban az egereket 6 órán át éheztettük, újra lemértük és elvéreztük a szérum megszerzéséhez. A perfúzió után a szöveteket gondosan kivágtuk és lemértük.

Mikro-CT elemzés

A mikro-CT elemzést LaTheta LCT-200 (Hitachi Aloka Medical, Tokió, Japán) alkalmazásával végeztük. Az izom, a zsigeri és a szubkután zsírtömeget LaTheta szoftverrel (Hitachi Aloka Medical) elemeztük.

Biokémiai teszt

6 órán át éheztetett egerek farokvénájából vért vettünk. A vércukorszintet Terumo MEDISAFE® glükométerrel (Terumo Co., Tokió, Japán) mértük. A szérum vagy plazma TCHO és TG szinteket FUJI DRI-CHEM rendszerrel (Fujifilm, Tokió, Japán) mértük. A szérum inzulin-, adiponektin- és leptinszinteket ELISA kitek segítségével mértük (Sibayagi, Gunma, Japán; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN; és BioVendor R&D, Brno, Csehország).

GTT és ITT

A GTT-t egereken, standard étrenden vagy HFD-n végeztük 8 héten keresztül. Az egereket 6 órával korábban böjtöltük, szabadon hozzáférve a vízhez. A vércukorszintet ezután közvetlenül az intraperitoneális glükózinjekció előtt (1 g/testtömeg-kg fiziológiás sóoldatban) és 15, 30, 60, 90 és 120 perccel a beadás után mértük. Az ITT-t hasonló módon hajtották végre inzulin (0,75 E/testtömeg-kg) injektálásával glükóz helyett.

Szövettan és immunhisztokémia

Az F4/80 és az LMP7 HE-festését és immunhisztokémiáját a 4, 23-ban korábban leírtak szerint hajtottuk végre .

Valós idejű RT-PCR elemzés

A teljes RNS-t a vesékből az ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd., Toyama, Japán) alkalmazásával állítottuk elő a gyártó utasításainak megfelelően. Valós idejű RT-PCR elemzést Takara TP960 PCR kocka termikus ciklus detektáló rendszer (Takara Bio Inc., Shiga, Japán) alkalmazásával végeztünk az mRNS expressziójának kimutatására a korábban leírtak szerint 23. A génexpressziót az Actb (β-aktin) expresszióval normalizáltuk a rendszerhez mellékelt szoftver segítségével. Az RT-PCR elemzéshez használt primereket az S1 kiegészítő táblázat tartalmazza.

BMT kísérletek

BMT egereket a korábban leírt módon állítottunk elő 24. Zöld fluoreszcens fehérje (GFP) egereket használtunk donorként a csontvelő helyreállításának ellenőrzésére a transzplantáció után ezzel a protokollal. Az áramlási citometriás elemzés azt mutatta, hogy a BMT után 8 héttel a perifériás vérsejtek több mint 90% -ban GFP-pozitív sejteket tartalmaztak 24. Ezzel a protokollal 3 típusú BMT egeret generáltunk: WT → WT, LMP7 -/- → WT, WT → LMP7 -/- egerek).

A légzési gázok és a mozgásszervi rendszer elemzése

Az egereket egyenként egy anyagcsere-kamrába helyeztük 48 órán keresztül, hogy lehetővé tegyék számukra a környezethez való alkalmazkodást és az állandó légzési csere (RER) elérését. A légzőgáz (O 2 és CO 2) elemzését nyílt áramkörű metabolikus gázelemző rendszerrel végeztük, amely közvetlenül egy tömegspektrométerhez volt csatlakoztatva (Arco2000; ArcoSystem, Chiba, Japán). Minden ketrecben (egy egér) 5 percenként mértük az oxigén (VO 2) és a széndioxid (VCO 2) termelést. A RER-t a VCO2/V02 arányként számoltuk. A teljes szénhidrogénfogyasztást (CH) és a zsírfogyasztást (FAT) a Frayn-féle sztöchiometrikus egyenletek felhasználásával a következőképpen számítottuk: CH = 4,51 × VCO 2 - 3, 18 × V02 [mg/perc] és FAT = 1,67 × (V02 - VCO) 2) [mg/perc]. A mozgásszervi aktivitást minden kamrában (egy egér) 5 percenként határoztuk meg az X és Y irányban megtört infravörös sugarak száma alapján, aktivitásmonitorozó rendszer (ACTIMO-100; Shinfactory, Fukuoka, Japán) és egyes metabolikus kamrák kombinációja alapján.

Széklet gyűjtése és széklet lipidjeinek kivonása

A HFD-vel táplált egerek egyedi székletét 24 órán át gyűjtöttük, és vákuumcentrifugálással szárítottuk. A kiszáradt ürüléket lemérték és mozsárban összetörték. Az őrölt ürüléket üvegcsőbe helyezték, és újra lemérték. A lipideket kloroform: metanol (2: 1) eleggyel kétszer extraháltuk a Folch 25. módszer szerint, és lemértük. A lipidtartalmat az őrölt széklet tömeg% -ában számítottuk.

Áramlási citometriás elemzés

Az epididimalis WAT-ban beszűrődő leukocitákat áramlási citometriával elemeztük a korábban leírtak szerint 11. Az áramlási citometriás adatokat egy FACSVerse (BD Biosciences, San Jose, CA) alkalmazásával kaptuk, és a FlowJo szoftverrel (Treestar, Inc., San Carlos, CA) elemeztük. Az áramlási citometriás elemzéshez használt reagenseket az S2 kiegészítő táblázat sorolja fel.

In vitro kísérletek

Az egér peritonealis makrofágjait RPMI1640-ben (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) tenyésztettük, 10% magzati szarvasmarha-szérummal (FBS) és 1% antibiotikum-antimikotikummal (Invitrogen, Carlsbad, CA) kiegészítve 24-lyukú lemezeken. 48 óra elteltével a sejteket 24 órán át 400 μM palmitáttal (10% BSA) 26 stimuláltuk. A felülúszók IL-1β, IL-6 és TNF-α szintjét ELISA kitek (R&D Systems Inc.) segítségével határoztuk meg.

Statisztikai analízis

A normál eloszlású eredményeket paraméteres párosítatlan t-teszttel elemeztük. A normális eloszlás nélküli eredményeket Mann - Whitney teszttel, Kruskal - Wallis teszttel vagy longitudinális analízissel elemeztük. Az összes elemzést a Stata szoftver 13-as kiadásával (Stata Corp., College Station, TX) végeztük. A p értéke: