szinergetikus

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • A metforminnal és liraglutiddal kombinált terápia hatékonyabb, mint az egyszeri kezelés a palmitinsav (PA) által kiváltott endotheliális diszfunkcióval szembeni védelemben.
  • A metforminnal és liraglutiddal kombinált terápia hatása a vaszkuláris endotheliális működésre ApoE -/- egerekben
  • A GLP-1 receptor (GLP-1R) szintjeinek és a protein-kináz A foszforilációjának (PKA) metforminnal indukált upregulációja hozzájárulhat a kombinált terápia szinergikus védőhatásaihoz.
  • A metformin az AMP-aktivált protein-kináz (AMPK) révén helyreállítja a PA-károsodott GLP-1R szintet és a PKA foszforilációját a HUVEC-ben.
  • vita
  • Anyagok és metódusok
  • reagensek
  • Tanulmányok in vitro
  • PA előállítása
  • Sejtkultúra és kezelés
  • RNS interferencia
  • Intracelluláris ROS kimutatása
  • NO felülúszó kimutatása
  • Western blot
  • Tanulmányok in vivo
  • vadállat
  • Aorta gyűrűk előkészítése és értágulat mérése
  • HE és immunokémiai festés
  • Statisztikai analízis
  • További részletek
  • További információ
  • PDF fájlok
  • További információ
  • Hozzászólások

elemeket

  • Diabéteszes szövődmények
  • Hormonreceptorok

absztrakt

Kohortos vizsgálatok és metaanalízisek azt sugallják, hogy a 2-es típusú cukorbetegség szorosan összefügg számos atherosclerotikus szív- és érrendszeri betegség megnövekedett kockázatával 1, 2. Noha a gyorsított érelmeszesedésért felelős pontos mechanizmusok nem teljesen ismertek, az endothel diszfunkció az egyik legkorábbi esemény az érelmeszesedés kialakulásában. Az endothel diszfunkciót a nitrogén-oxid (NO) szintézisének csökkenése és/vagy a biohasznosulás jellemzi a periendotheliális környezetben, ahol az NO felelős az érszövetek integritásának fenntartásáért 3 .

A metformin a leggyakrabban felírt gyógyszer a hiperglikémia kezelésére 2-es típusú cukorbetegségben. Klinikai vizsgálatok kimutatták a metformin 4, 5, 6 szív- és érrendszerre gyakorolt ​​jótékony hatását. Ezenkívül a metformin közvetlenül megvédheti az endothel sejteket a károsodástól, amely meghaladja a glükózcsökkentő hatásokat 7, 8. A glükagonszerű peptid-1 (GLP-1) szereket (beleértve a GLP-1 analógokat és a dipeptidil peptidáz 4 gátlókat) a közelmúltban új terápiás lehetőségként engedélyezték a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegek számára, annak bizonyítéka alapján, hogy a GLP-1 képes stimulálni az inzulinfüggő szekréció: hasnyálmirigy ß sejtek glükózjától. A GLP-1 a glükózcsökkentő hatása mellett egyéb hasnyálmirigyen kívüli hatásokkal is rendelkezik. A LEADER-tanulmány (Liraglutide-effektus és cukorbetegségben kifejtett hatás: kardiovaszkuláris eredmények értékelése) nemrégiben kimutatta, hogy a liraglutid-analóg és a GLP-1 analóg kezelése csökkenti a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegek kardiovaszkuláris eseményeit és halálát 9. Fontos, hogy az érrendszeri endothelium fontos szerepet játszik a szív- és érrendszeri funkció fenntartásában 10. Új bizonyítékok arra utalnak, hogy a GLP-1 és analógjai közvetlen védőhatással vannak a vaszkuláris endotheliumra 11 .

Egy klinikai vizsgálatban a liraglutiddal és metforminnal kombinált terápia szignifikánsan nagyobb súlycsökkenést és alacsonyabb hipoglikémia előfordulást mutatott, mint a glimepirid és a metformin 12, 13 kombinált terápiája. Ezen túlmenően, a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegeknél, akiknek megfelelő glikémiás kontrolljuk van metformin monoterápiával, a liraglutid-kezeléssel a kardiovaszkuláris kockázat számos jelzője javult, ami arra utal, hogy a metforminnak és a liraglutidnak további vagy akár szinergetikus hatása lehet az érrendszerre 14. Az azonban, hogy ez a kombinációs terápia szinergetikusan hat-e az endotheliális funkciókra, még mindig nem világos a kapcsolódó kísérleti bizonyítékok hiánya miatt. Ebben a tanulmányban ezért arra összpontosítottunk, hogy megvizsgáljuk a metforminnal és liraglutiddal kombinált terápia hatását a lipotoxicitás által kiváltott endotheliális diszfunkcióra, valamint az alapul szolgáló mechanizmus vizsgálatára.

az eredmény

A metforminnal és liraglutiddal kombinált terápia hatékonyabb, mint az egyszeri terápia a palmitinsav (PA) által kiváltott endotheliális diszfunkció elleni védelemben.

A tenyésztett humán köldökvénás endothelsejtekben (HUVEC) a PA endotél diszfunkciót váltott ki, amelyet a reaktív oxigénfajok (ROS) megnövekedett termelése, az alacsony NO-szint és az intracelluláris foszforilált endotheliális NO-szintáz (p-eNOS) szintje jellemez egy koncentrációtól függő módon. módszer (1a. ábra). A PA által kiváltott endotheliális diszfunkciót (0,5 mmol/l) egyetlen metódus (0,5 és 1,0 mmol/l) vagy liraglutid (30 és 100 nmol/l) nagyobb dózisával gyengítették. A metformin (0,1 mmol/l) vagy a liraglutid (3 és 10 nmol/l) alacsonyabb dózisánál azonban nem jelentkezett ilyen védőhatás (1b, c ábra). Figyelemre méltó, hogy a metformin (0,1 mmol/l) és a liraglutid (3 nmol/l) alacsonyabb dózisával végzett kombinált kezelés jelentős védőhatással volt a PA által indukált ROS-termelés fokozott szabályozására, valamint csökkentette az NO és a p-eNOS fehérje szintjét (1. ábra. 1d., 1. kiegészítő ábra), jelezve, hogy a kombinált terápia hatékonyabb volt, mint egyetlen kezelés a PA által kiváltott endotheliális diszfunkcióval szemben.

( a ) A PA dózisfüggő hatása az endothel működésére a HUVEC-ben, beleértve az intracelluláris ROS termelést (felső panel), NO felülúszó szintet (középső panel) és a p-eNOS fehérje szintet (alsó panel). A HUVEC-ket különböző koncentrációkban metforminnal kezelték ( b ) és liraglutid ( c ) önmagában vagy mindkettővel kombinálva ( d ) 2 órán át, majd további 22 órán át PA-nak tesszük ki. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. n = 4. * P # P -/- egerek

a ) Károsodott GLP-1R és PKA foszforilációs szintek PA-val kezelt HUVEC-ekben. ( b ) A metformin dózisfüggő hatása a GLP-1R szintre és a PKA foszforilációjára a csökkent PA-val rendelkező HUVEC-ben. A GLP-1R vagy p-PKA fehérje szintet normalizáltuk a GAPDH vagy az összes PKA fehérje szintjére. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. n = 4. * P # P

A sejteket a GLP-1R antagonista exendinnel (9-39) inkubáltuk ( a ) vagy PKA H89 inhibitor ( b ) 30 percig, majd 2 órán át metforminnal és liraglutiddal kezeljük, majd további 21,5 órán át PA-nak tesszük ki. Megvizsgálták az endoteliális funkciót, beleértve a ROS termelést (felső panel), az NO szintet (középső panel) és a p-eNOS fehérje szintet (alsó panel). Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. n = 4. * P # P † P

A HUVEC-eket AICAR AMPK aktivátorral 2,5 órán át vagy AMPK C inhibitorral 30 percig előkezeltük, majd önmagában metforminnal (1,0 mmol/l) kezeltük ( a, b ) vagy metformin (0,1 mmol/l) és liraglutid (3 nmol/l) kombináció ( c, d ) 2 órán át, majd 21,5 órán át PA-nak való expozícióval. GLP-1R fehérje szintek ( a, c ) vagy p-PKA ( b, d ) normalizálták a GAPDH fehérjékre vagy a teljes PKA-ra. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. n = 4. * P # P † P 10. A szabad zsírsavak és az endothel diszfunkció közötti okozati összefüggést többféle módon bizonyították 16, 17, 18, 19. A PA az egyik olyan zsírsav, amelyet a nyugati étrendben leggyakrabban találnak. In vitro vizsgálatunkban a PA szignifikánsan károsította az endotheliális funkciókat, ami arra utal, hogy fokozott az intracelluláris ROS termelés és csökken az NO szint és az eNOS foszforilációja. Hasonlóképpen, in vivo vizsgálatunk kimutatta, hogy vazodilatáció-függő vazodilatáció-függő vazodilatáció ApoE -/- HFD-vel táplált egerekben.

Az AMPK és a PKA a sejtanyagcsere két kulcsszabályozója. Az AMPK és a PKA közötti interakciót számos 40, 41, 42 tanulmány jól dokumentálja. Az AMPK aktiválása növeli a PKA aktivitását, míg a PKA függetlenül vagy gátolja a Ser/Thr-specifikus fehérje-foszfatáz-2C aktivitást, ezáltal közvetetten módosítja az AMPK aktivitását a primer patkány simaizom érrendszeri sejtjeiben. Ebben a tanulmányban azt tapasztaltuk, hogy az AMPK aktiváció gyengítette a PA indukálta PKA foszforiláció csökkenését HUVEC-ben. Megállapításaink új megvilágításba helyezhetik az endothel sejtek jelző hálózatát. Ezenkívül a PKA gátlása gyengítette a metformin PA által kiváltott endotheliális diszfunkcióra gyakorolt ​​hatását, ami arra utal, hogy a PKA szerepet játszhat a metformin endothelsejtekre gyakorolt ​​védőhatásaiban. Mindazonáltal további vizsgálatokra van szükség az AMPK és a PKA útvonal közötti áthallás meghatározásához az endoteliális működés javítása érdekében.

Összefoglalva, a metforminnal és a GLP-1 analóg liraglutiddal kombinált terápia szinergikus hatást fejt ki a PA által kiváltott endotheliális diszfunkcióval szemben. A metformin funkciója a GLP-1R szintek és a PKA foszforilációjának az endotélsejtekben történő szabályozásában hozzájárulhat e kombinációs terápia szinergikus védőhatásához, amely új betekintést nyújt a metformin és a GLP-1 szerek közötti kölcsönhatásba (7. ábra). Lehetséges, hogy a metformin képes fokozni vagy fokozni a GLP-1 és analógjainak érvédő hatásait. Eredményeink fontos információkat nyújtanak a GLP-1 alapú terápiás stratégiák kialakításához a 2-es típusú cukorbetegség kezelésében.

A palmitinsav (PA) által kiváltott endoteliális diszfunkciót a megnövekedett ROS-termelés, az alacsony NO-szint és az eNOS-foszforiláció csökkenése jellemzi. A metforminnal vagy liraglutiddal önmagában végzett kezelés megakadályozhatja a PA endothelsejtek által kiváltott diszfunkciót. A metforminnal és liraglutiddal kombinált terápia szinergetikusan hat a PA által kiváltott endotheliális diszfunkcióra. Ezenkívül a metformin szabályozza a GLP-1R-t és annak downstream PKA-jelátvitelét, amely felelős lehet a liraglutiddal szinergikus védőhatásáért a PA-károsodott endoteliális sejtekben. A metformin a GLP-1R-től függetlenül is aktiválhatja a PKA jelátvitelt. A metformin fenti hatásait az AMPK útvonal közvetíti. A piros nyilak jelzik új eredményeinket ebben a vizsgálatban.

Teljes méretű kép

Anyagok és metódusok

reagensek

A liraglutidot a Novo Nordisk (Bagsvaerd, Dánia) biztosította. PA-t, AMPK-gátlót A C vegyületet és a GLP-1R antagonista exendint (9-39) a Sigma-tól (St. Louis, MO, USA) szereztük be. Az AMPK AICAR aktivátor a Beyotime Biotechnology cégtől (Sanghaj, Kína) származott. A HKA PKA inhibitort a Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) biztosította. Az egér anti-eNOS és anti-foszfo-Ser-1177-eNOS (p-eNOS) antitestek a BD Biosciences-től (San Joe, CA, USA) voltak. Az egér anti-GLP-1R monoklonális antitest a DSHB-től (Iowa, IA, USA) származik. Nyúl anti-PKAa, anti-foszfo-Thr197-PKA C (p-PKA), anti-AMPKa és anti-foszfo-Thr-172-AMPKa (p-AMPK) a Cell Signaling Technology cégtől nyertük. Egér anti-GAPDH antitest a Zhongshan Biotechnology cégtől (Peking, Kína).

In vitro vizsgálatok

PA előállítása

A 256 mg PA-t feloldjuk 5 ml abszolút etanolban, majd titráljuk 0,1 ml/l 5 ml nátrium-hidroxid-oldattal 70 ° C-on. Végül 10 ml PA és 190 ml 10% -os BSA keverékét keverjük 55 ° C-on. Az alapoldatot szűréssel sterilizáltuk és -20 ° C-on tároltuk. Hasonlóképpen 5% etanolt és 9,5% BSA-t tartalmazó kontrolloldatot készítettünk.

Sejtkultúra és kezelés

A HUVEC-eket egészséges donoroktól gyűjtötték, írásos beleegyezéssel. A tanulmány protokollját a pekingi Harmadik Kórház Etikai Bizottsága hagyta jóvá. Minden elvégzett eljárás összhangban volt a vonatkozó irányelvekkel és előírásokkal. A HUVEC-eket a korábban leírtak szerint készítettük el és tenyésztettük 43. Valamennyi kísérletet a 6. passzázs sejtjeivel hajtottuk végre. PA-koncentrációk sorozatát (0, 125, 0, 25 és 0,5 mmol/l) alkalmaztuk 24 órán át tartó inkubáláshoz az endothel diszfunkciójának kiváltására. Vizsgálatunk nagy részében a sérült modellként 0,5 mmol/l PA HUVEC-expozíciót alkalmaztunk. A HUVEC-ek metforminnal (0, 1, 0, 5 és 1,0 mmol/l) vagy liraglutiddal (3, 10, 30 és 100 nmol/l) történő előkezelését 2 órával a PA-expozíció előtt és 22 órán keresztül végeztük. Kombinált kísérletben a sejteket metforminnal (0,1 mmol/l) és liraglutiddal (3 nmol/l) kezeltük. Az érintett jelátviteli utak tisztázása érdekében a sejteket AICAR-mal (0,5 mmol/l), C vegyülettel (10 μmol/l), Exendinnel (9-39) (200 nmol/l) vagy H89-vel (10 μmol/l) inkubáltuk. 30 percig. min. egyéb kezelések előtt.

A leütéses kísérletben a HUV-EC-C-t, egy HUVEC-sejtvonalat használtuk. Ez a sejtvonal a Sanghaji Élettudományi Kutatóintézet (Kína) Cell Resource Center-jéből származik, és 10% FBS-sel kiegészített DMEM-ben (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) tenyésztették.

RNS interferencia

A GLP-1R és PKA gének expressziójának elhallgattatásához a sejteket siRNS-sel transzfektáltuk lipofektamin RNAi MAX (Invitrogen) alkalmazásával. Az siRNS három formáját vezették be egy adott gén minden egyes leütéséért, és nem rokon kódolt siRNS-t alkalmaztak kontrollként az emberi genomiális szekvencia azonosítása nélkül. 48 órás transzfekció után a sejteket metforminnal (1,0 mmol/l) kezeltük 2 órán át, majd PA-expozícióval további 22 órán át.

Intracelluláris ROS kimutatása

A ROS-t 2 ', 7'-diklór-fluoreszcin-diacetát fluoreszcens szondával (DCFH-DA, Sigma) mértük, amelyet a sejtekben DCFH-vá hidrolizálhatunk. Ha a nem fluoreszcens DCFH-t ROS oxidálja, akkor az nagy fluoreszcens DCF-vé alakul. Röviden, a kezelés végén a sejteket DCFH-DA-val (20 μmol/l) inkubáltuk 30 percig 37 ° C-on, majd kétszer mostuk. A DCF fluoreszcencia intenzitását áramlási citométerrel (BD Biosciences) teszteltük. A kontrollokat 100% -os ROS-szintként állítottuk be.

NO felülúszó kimutatása

Az NO-t a nitrit-reduktáz módszerrel határoztuk meg a Beijing 4A Biotech Co., Ltd. (Kína) készletével. A kezelés végén minden csoportból sejtkultúra-felülúszókat gyűjtöttünk. A vizsgálat beállításához 0,1 ml desztillált vízzel, standard oldattal és kezelési mintákkal ellátott csöveket készítettünk, majd mindegyik csőhöz PBS-t és nitrát-reduktázt adtunk. Egy órán át 37 ° C-on végzett inkubálás után két munkaoldatot adunk további inkubáláshoz további 10 percig. Az abszorbanciát mindegyik csőben 450 nm-en mértük mikrotányér-leolvasóval. Az egyes csoportok NO-szintjét az összes fehérjéhez normalizáltuk.

Western blot

A fehérjéket 10% (w/v) SDS-PAGE-vel elválasztottuk és nitrocellulóz membránra vittük. A membránokat primer antitestekkel teszteltük (mindezt 1: 1 000 hígítással) egy éjszakán át 4 ° C-on, majd inkubáltuk IRDye 800CW-vel konjugált kecske anti-nyúl IgG-vel vagy kecske anti-egér IgG-vel (mindkettőt 1: 10 000 hígítással); LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) 1 órán át. A fehérjsávokat Odyssey infravörös képalkotó rendszerrel (LI-COR Biosciences) vizualizálták.

In vivo vizsgálatok

Az állatkísérleteket a Pekingi Egyetem állatgondozási és állat-egészségügyi bizottsága hagyta jóvá, és azokat a nemzeti és nemzetközi irányelveknek megfelelően hajtották végre. Nyolc hetes hím vad típusú és ApoE -/- egereket (Vital River Animal Center, Peking, Kína) specifikus kórokozóktól mentes körülmények között, 12 órás világos-sötét ciklusban helyeztünk el. A kísérleteket egy hét akklimatizáció után hajtottuk végre. A vad típusú egereket normál táplálékkal etették, míg az ApoE -/- egereket 0,15% koleszterint és 41% zsírt tartalmazó HFD-vel (MD12015, Medicine Ltd., Yangzhou, Jiangsu, Kína) 8 hétig táplálták. Az elmúlt négy hét során az ApoE -/- egereket négy csoportra osztották (csoportonként 6 egér), beleértve a kontrollt (PBS, ip, naponta kétszer), a metformint (napi 100 mg/kg, ivóvíz és PBS) ip, naponta kétszer), liraglutid (30 μg/kg naponta, ip, naponta kétszer) és a kombináció (metformin, 100 mg/kg naponta, ivóvízzel; és liraglutid, 30 μg/kg naponta, ip, kétszer) naponta ). A testtömeget megmértük a kezelés előtt, majd hetente feláldozásig.

Aorta gyűrűk előkészítése és értágulat mérése

A nátrium-pentobarbitális altatásban végzett középvonalbeli laparotómiát követően az aortát gyorsan kivágtuk az érrendszeri reaktivitás mérésére, a fentiek szerint 44. 30 percig Krebs-pufferben végzett stabilizálás után az aorta gyűrűket kálium-kloriddal (60 mmol/l) depolarizáltuk, hogy értékeljük maximális összehúzódásukat. Két mosás után az aorta gyűrűket fenilefrinnel (10-6 mol/l) stimulálva kivontuk. Amikor a kontraktilis válasz stabilizálódott (stabil állapotú fázis, 15 perc), megvizsgálták az ér megnövekedett reakcióit az Ach megnövekedett koncentrációjára. Az aorta gyűrűk nyugalmi feszültségét 1,0 g-ra állítottuk be. A vaszkuláris feszültség változását egy tollal író felvevő (ADInstruments, Bella Vista, Ausztrália) észlelte.

HE és immunokémiai festés

Az aorta szöveteket, köztük az aorta gyökereket és az emelkedő aortát, 7 μm vastag metszetek előállításához gyűjtöttük össze. A szöveti szakaszokat először HE-festéssel azonosítottuk. Az immunokémiai festéshez a metszeteket 3% -os hidrogén-peroxiddal kezeltük 10 percig az endogén peroxidáz aktivitás blokkolásához, és pufferolt normál lószérumban inkubáltuk, hogy megakadályozzuk az antitestek nem specifikus kötődését. Ezután a metszeteket p-eNOS (1:50; Sigma) vagy GLP-1R (1:10) elleni antitesttel inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on, és immunhisztokémiai elemzésnek vetettük alá.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. A csoportok közötti különbséget egyirányú ANOVA-val elemeztük, amelyet post-hoc Tukey-Kramer teszt követett. A P érték