- elemeket
- absztrakt
- bevezetés
- az eredmény
- A szérum HDL-koleszterin és az adipokin szint társulása hasi elhízásban szenvedőknél
- A HDL a 3T3-L1 differenciálódott adipocitákban csillapítja a visphatin és az rezisztin ox-LDL által kiváltott szekrécióját.
- A HDL gátolja az ox-LDL indukálta szabad koleszterin felhalmozódását a teljes adipocitákban és az ER-ben dúsított membránokban
- A HDL elnyomja a visfatin és ox-LDL vagy TM által indukált rezisztin szekrécióját a 3T3-L1 adipocitákban
- A HDL enyhíti az ox-LDL vagy TM által indukált 3T3-L1 adipociták ER stresszválaszát
- A HDL növeli az I. típusú felvételi receptor (SR-BI) expresszióját és gátolja az ox-LDL által kiváltott FC felhalmozódást az SR-BI receptoron keresztül a 3T3-L1 adipocitákban.
- vita
- mód
- elemeket
- Szérumelemzés
- Sejtkultúra
- Az LDL izolálása és oxidációja
- Adipokinszint mérése a táptalajban
- ER membrán frakcionálása és a szabad koleszterin (FC) meghatározása
- Western Blots
- Kvantitatív valós idejű PCR
- Áramlási citometria
- Az interferáló RNS (siRNS) kicsi transzfekciója
- Az endotoxinok mérése
- Statisztikai analízis
- További részletek
- További információ
- Word dokumentumok
- További információ
- Hozzászólások
elemeket
absztrakt
Amióta megjelenik az adipocita, mint "metabolikusan aktív szerv", amely szekretálja a hormonokat, citokineket és kemokineket, egyre nagyobb az érdeklődés az elhízás és a fogyás funkcióinak megértése iránt 1. A zsírszövet számos bioaktív molekulát, úgynevezett adipokint választ ki, például α-TNF (a) TNF-a, interleukin-6 (IL-6) és monocita kemoattraktáns fehérjét (MCP-1) 2. A visfatin és a rezisztin a zsigeri zsírszövet 3, 4 új adipokinja. Az alacsony fokú krónikus gyulladást az elhízás fémjelzi az adipokin eredetű adipokintermelés diszregulációjában. Ezeket a szérumban és a zsírszövetben egyaránt kimutatják, és aktív tényezők, amelyek modulálják az elhízás és a kapcsolódó társbetegségek hatásait 5, 6 .
Az újonnan szintetizált membránhoz kapcsolódó szekretált fehérjéket a chaperonok megfelelően összeállítják és összeállítják az endoplazmatikus retikulumban (ER) 7. Az ER adaptív képességének kudarca az ER stressz aktiválódásához vezet, más néven fejlett fehérjeválasznak (UPR). Az ER stresszről ismert, hogy elhízott 8, 9 és elhízott emberek 10 májában és zsírszövetében fokozódik. Az ER stressz indukálása a zsírszövetben módosítja az adipokin szekréciót és gyulladást vált ki 11. A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy az oxidált kis sűrűségű lipoprotein (ox-LDL) elősegítheti a visfatin expresszióját és szekrécióját, és ellenállhat a homológ ER stressz-C/EBP (CHOP) fehérje útvonal aktiválásával, amely a koleszterinszint növekedésével járhat. míg a tauroursodeoxycholsav (TUDCA) megvédi az adipocitákat az ox-LDL által kiváltott adipokin szekréciótól az ERS 12 aktivációjának gátlásával. Így feltételezhető, hogy az ER stressz gátlása hatékony megközelítés lehet az adipokin szekréció modulálásában, a gyulladás elnyomásában, valamint az elhízás és szövődményeinek kockázatának csökkentésében.
Köztudott, hogy a nagy sűrűségű lipoprotein (HDL) jelentős gyulladáscsökkentő és antiaterogén tulajdonságokkal rendelkezik. Azt a mechanizmust, amellyel a HDL megakadályozza az aterogenezist, még nem sikerült teljesen tisztázni. A legújabb tanulmányok szoros összefüggésre utalnak a keringő plazma rezisztin és az érelmeszesedés között 13. A HDL tovább csökkentheti a lipidek felhalmozódását a 14 adipocitákban, ami valószínűleg felelős lehet a HDL adipokin szekrécióra gyakorolt jótékony hatásáért. Ezért feltételeztük, hogy az adipokin szekréció és az adipociták lipidfelhalmozódásának HDL általi szabályozása hozzájárulhat antiaterogén tulajdonságaihoz. Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk a HDL hatását az adipokin szekrécióra és a lipid felhalmozódásra, különös hangsúlyt fektetve annak szerepére az ER által közvetített gyulladás-CHOP szabályozásának csökkentésében in vitro és in vivo. .
az eredmény
A szérum HDL-koleszterin és az adipokin szint társulása hasi elhízásban szenvedő egyéneknél
Az alanyokra vonatkozó kiindulási demográfiai adatokat az 1. kiegészítő táblázat mutatja be. A vizsgálatba harmincnégy hasi elhízással rendelkező beteget vontak be, dohányzókat és ivókat nem vettek fel. Amint az 1A. Ábra mutatja, negatív összefüggést figyeltünk meg a szérum visfatin szintje és a szérum HDL-C szintje között. Ugyanezt a korrelációt találtuk a rezisztinnel rendelkező HDL-C és a TNF-α között (1B, C ábra).
A vizsgálatba 34 hasi elhízással küzdő alany vett részt. ( A ) A HDL-C (mmol/L) és a visfatin (ng/ml) szóródási diagramja lineáris regressziós analízissel. ( B ) A HDL-C (mmol/L) és az ellenállás (ng/ml) szóródási diagramja lineáris regresszióanalízissel. ( C ) HDL-C (mmol/L) és TNF-α (ng/ml) szóródási diagramja lineáris regresszióanalízissel.
Teljes méretű kép
A HDL gyengíti a visphatin és az rezisztin ox-LDL által kiváltott szekrécióját a 3T3-L1 differenciált adipocitákban
A HDL-C és a gyulladásgátló adipokinek negatív korrelációja alapján elhízott betegeknél in vitro ox-LDL-indukált gyulladásos adipocita modellt hoztak létre a HDL protektív funkciójának vizsgálatára. Amint az a 2. ábrán látható. A 2. ábrán az adipociták ox-LDL-rel történő inkubálása a visfatin és az rezisztin felszabadulásának szabályozásának jelentős növekedését eredményezte, míg a megnövekedett szabályozást jelentősen gyengítette a HDL dózisfüggő előkezelése (2A, B ábra) és az időfüggő (2C ábra), D).
( A, B ) Az adipocitákat különböző koncentrációjú HDL-ben DMEM-ben, 1% FBS-sel kezeltük 2 órán át, majd ox-LDL és 10 μg/ml Sandoz 58035 inkubációval 48 órán keresztül inkubáltuk, majd a sejtközegben a visfatin és a rezin szintjét meghatároztuk. ELISA. ( C, D ) Az adipocitákat ox-LDL-szel és sandoz58035-szel (10 μg/ml) inkubáltuk 48 órán át HDL-vel (100 μg/ml) kombinálva különböző időtartamokig, majd a sejtközegbe felszabaduló visfatin és rezisztin mennyiségét a ELISA assay. Az adatokat legalább hat független kísérlet átlagának ± SEM-nek adjuk meg. * P # P ## P
Az adipocitákat HDL-ben DMEM-ben 1% FBS-sel előkezeltük 2 órán át, majd ox-LDL és 10 μg/ml Sandoz 58035 inkubálást 48 órán át, majd ( A ) A teljes sejtek FC-tartalmát egy kereskedelemben kapható készlettel analizáltuk. ( B ) Az ER-dúsított adipocitákból származó membránokat szacharóz-gradiens centrifugálással frakcionáltuk, a "Módszerek" részben leírtak szerint, és a pelletfrakciót FC-tartalomra teszteltük. Az adatokat legalább négy független kísérlet átlagának ± SEM-nek adjuk meg. * P # P
( A, B Az adipocitákat HDL-rel vagy PBA-val DMEM-ben 1% FBS-sel előkezeltük 2 órán át, majd ox-LDL és sandoz58035 (10 μg/ml) inkubálás 48 órán át. ( C, D ) Az adipocitákat HDL-rel vagy PBA-val DMEM-ben 1% FBS-sel előkezeltük 2 órán át, majd TM-vel és sandoz58035-szel (10 μg/ml) inkubáltuk 24 órán át. A sejtközegben a visfatin és a rezisztin szintjét ELISA vizsgálattal határoztuk meg. Az adatokat legalább 5 független kísérlet átlag ± SEM értékeként fejezzük ki. ** P # P
( A, B ) Az adipocitákat HDL-ben DMEM-ben, 1% FBS-sel előkezeltük 2 órán át, majd ox-LDL-vel és sandoz58035-szel (10 μg/ml) inkubáltuk 48 órán át, majd ( A ) Az SR-BI és a PDZK1 mRNS és fehérje szintjét valós idejű PCR-rel és Western-blottolással értékeltük, és B ) az SR-BI membrán expresszióját áramlási citometriával mértük. ( C - F ) Az adipocitákat 48 órán át siRNS-sel transzfektáltuk SR-BI vagy negatív kontroll siRNS ellen, majd a sejteket 2 órán át HDL-rel (100 μg/ml) előkezeltük, majd oxo-LDL-lel (100 μg/ml) és sandoz58035-vel (10) inkubáltuk. μg/ml) 48 órán át. Ezután az SR-BI elnémítását Western blot ( C ). FC-szint az adipocitákban ( D ) és ER-ben gazdag frakciók ( E ) egy kereskedelemben kapható készlet segítségével elemeztük. A CHOP fehérje szintjét tovább értékeltük ( F ), egy ER stressz marker, Western blot módszerrel. Az adatokat legalább négy független kísérlet átlag ± SEM értékeként fejezzük ki. * P # P ## P & P
A HDL elnyomhatja az ox-LDL által indukált FC felhalmozódást az adipocitákban az SR-BI upregulációja révén, és ezt követően megelőzheti az oxigén-LDL által indukált ER stressz-CHOP által közvetített adipocita gyulladást.
Teljes méretű kép
vita
A koleszterin homeosztázisának megszakadása a sejtekben vagy organizmusokban a gyulladásos válaszok fokozódásához vezethet. A krónikus gyulladás fontos kapcsolat az elhízás és annak kórélettani következményei között, ideértve az érelmeszesedést, az inzulinrezisztenciát vagy a rák kialakulását 16. A HDL részben megvédheti az érelmeszesedéses szívkoszorúér-betegség kialakulását azáltal, hogy elősegíti a koleszterin kiáramlását az artéria falának makrofágjaiból. Ezenkívül gyulladáscsökkentő funkciókat is elláthat az endothelsejtekben és a makrofágokban 17. Ebben a tanulmányban bebizonyítottuk, hogy a HDL az SR-BI upregulációján keresztül képes elnyomni az ox-LDL által indukált FC felhalmozódást az adipocitákban, és ezt követően megelőzheti az ox-LDL által kiváltott ER stressz-CHOP által közvetített adipocita gyulladást. Először igazoljuk a HDL adipocita gyulladásra gyakorolt védő hatását, amely fontos kapcsolatot biztosít az elhízás és szövődményei között. Megállapításunk valószínűleg arra is útmutatást nyújt, hogy a terápiás beavatkozások, például a termelés vagy az infúzió növelése vagy a HDL működésének javítása, megszakíthatják a koleszterin felhalmozódása és a zsírszövet gyulladása közötti kapcsolatot, és jótékony hatással lehetnek elhízásban és metabolikus szindrómában szenvedő betegeknél.,
Összegzésképpen: ez a tanulmány negatív kapcsolatot igazolt a szérum HDL-koleszterin és a proinflammatorikus adipokin szint között a hasi elhízásban szenvedő betegeknél. Kimutattuk, hogy az ox-LDL stimulálta a visfatin és az rezisztin expresszióját és szekrécióját a 3T3-L1 adipocitákban az ER stressz aktiválásával. A HDL elnyomhatja az ox-LDL által indukált FC felhalmozódást az adipocitákban az SR-BI felfelé történő szabályozása révén, és ezután megakadályozza az ox-LDL által indukált ox stressz-CHOP által közvetített adipocita gyulladást. Ez a megállapítás valószínűleg tovább gazdagítja az adipociták patofiziológiáját, és megmagyarázza a HDL jótékony hatását az elhízással kapcsolatos gyulladásos betegségekre, például a cukorbetegségre vagy az érelmeszesedésre.
mód
elemeket
Minden kísérleti eljárást a TaiShan Orvostudományi Egyetem Etikai Bizottságának utasításai szerint hagytak jóvá és hajtottak végre. Ez a keresztmetszeti vizsgálat 34 olyan személy kiválasztását tartalmazta, akiknek hasi elhízása volt olyan felnőtteknél, akik orvosi vizsgálatokon vettek részt egy anya és gyermek kórházban Daiyue körzetben. Valamennyi résztvevő írásos megalapozott beleegyezést adott a részvételhez a tanulmányba való felvétel előtt.
A hasi elhízás (magas trigliceridszint plusz a derék kerülete [HTGWC]) a trigliceridek ≥1,7 mmol/l, a derék kerülete ≥ 90 cm (férfiak) és ≥ 80 cm (nők). Kizártuk a szív- és érrendszeri betegségekben, cukorbetegségben vagy lipidcsökkentő szerekben szenvedő betegeket a vizsgálatba való beiratkozást megelőző 6 hónapon belül.
Szérumelemzés
Vérmintákat vettek reggel egy éjszakai böjt után. A szérum HDL-C-t, LDL-C-t, triglicerideket (TG) és a glükózt enzimatikus módszerekkel mértük kémiai autoanalizátoron (Hitachi Co 7600, Tokió, Japán). A visfatin, a rezisztin és a TNF-a szérumszintjét egy kereskedelemben kapható Elisa kit (Bluegene, Shanghai, Kína) segítségével mértük.
Sejtkultúra
Az American Type Culture Collection-től (ATCC) vásárolt 3T3-L1 preadipocitákat DMEM-ben (GIBCO) tartottuk, 10% (v/v) szarvasmarha-magzati szérummal (FBS, Gibco), 2 mM L-glutaminnal és antibiotikumokkal kiegészítve. Az adipocita differenciálódás kiváltása érdekében a sejteket 2 napig bazális táptalajon tenyésztettük, hagytuk összefolyásig növekedni, majd 10 μg/ml inzulint, 0,25 μM dexametazont és 500 μM IBMX (IDI táptalajt) tartalmazó differenciáló táptalajjal kezeltük 2 napig. majd inkubálás önmagában inzulinnal kiegészített bazális közegben 2 napig. A sejteket további 2 napig inkubáltuk bazális táptalajban. Ekkor a sejtek több mint 90% -a több lipidcseppet halmozott fel és az adipocita differenciálódást sikerült elérni, amelyet Olaj vörös O festéssel azonosítottak. A kísérlethez a sejteket 12 órán át 37 ° C-on DMEM + 0,2% BSA-val inkubáltuk. majd inkubálva töltöttük az FC-t teljes közeggel, amely 10 μg/ml 58035 ACAT-gátlót (sigma, USA) és ox-LDL-t tartalmazott. a megadott időkre.
Az LDL izolálása és oxidációja
A humán LDL-t a közelmúltban leírt módon izolálták és oxidálták 34. Röviden, LDL-t (sűrűség = 1,019 - 1063 g/ml) izoláltunk a normolipidémiás donorok plazmájából szekvenciális ultracentrifugálással, majd 10 mmol/l CuSO4-tal inkubáltuk 18 órán át 37 ° C-on. Inkubálás után 0,1 mmol-ot adtunk hozzá. 1 etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA) a további oxidáció megakadályozása érdekében, és az oxidált LDL-t 1 mg/ml-re koncentráljuk. Az LDL oxidáció mértékét a megnövekedett agaróz gél mobilitás alapján (a natív LDL-hez képest), valamint a mintában megnövekedett TBARS koncentráció alapján értékeltük. Az Ox-LDL készítmények TBARS-értéke> 30 μmol/g fehérje volt, az agaróz géleken a relatív mobilitási index 2,0-2,5 volt a natív LDL-hez képest. A lipoproteineket 4 ° C-on sötétben tároltuk, és kéthetente frissen készítettük.
Adipokinszint mérése a táptalajban
A sejtközegben a visfatin és a rezisztin szintjét Elisa tesztkészletekkel (Bluegene, Shanghai, Kína) detektáltuk a gyártók utasításainak megfelelően.
ER membrán frakcionálása és a szabad koleszterin (FC) meghatározása
Western Blots
Sejt- vagy magkivonatokat készítettünk a korábban leírt módon 36. Ezután Western blot analízisnek vetették alá PDO (Santa Cruz), bip (Abcam), foszforilezett PERK (Santa Cruz), foszforilezett eIF2a (Santa Cruz), ATF6 (Santa Cruz), H3 hiszton (Abcam), SR-BI ( Novus Biologicals), PDZK1 (Abcam) és β-aktin (Sigma) antitestek. A fehérjéket vizualizáltuk és kvantifikáltuk egy fokozott kemilumineszcencia módszerrel (Pierce), és kemilumineszcencia képalkotó rendszerrel (Bioshine Chemi Q 4800mini, Shanghai, Kína) számszerűsítettük.
Kvantitatív valós idejű PCR
Az összes sejtes RNS-t TRIZOL reagens (Invitrogen) alkalmazásával izoláltuk. A CDNA szintézist MuLV reverz transzkriptáz (Applied Biosystems) alkalmazásával hajtottuk végre. A valós idejű PCR-t a SYBR green PCR master mix kit (TianGen Biotech) segítségével végeztük. A valós idejű PCR-hez használt primerek a következők voltak: SR-BI Forward ATCTGGTGGACAAATGGAA; SR-BI fordított GAAGCGATACGTGGGAAT; PDZK1 Előre TGACGGTGTGGTGGAAATG; PDZK1 hátramenet TGGCAGTAAAGAAGTGGAGAG; GAPDH előre TGACGTGCCGCCTGGAGA AA; GAPDH Revision AGTGTAGCCCAAGATGCCCTTCAG. Az adatokat Rotor-gene Q szoftver (Qiagen) segítségével elemeztük. A relatív mRNS-szinteket 2-DDCt módszerrel számoltuk .
Áramlási citometria
A sejteket 1 μg/ml SR-BI antitesttel festettük 60 percig. Háromszor PBS-ben végzett mosás után a sejteket FITC-jelölt nyúlellenes antitestben szuszpendáltuk. 30 percig tartó inkubálás után a sejteket háromszor jéghideg PBS-sel mostuk, majd áramlási citométeren (BD FACS Calibur) elemeztük.
Az interferáló RNS (siRNS) kicsi transzfekciója
A sejteket specifikus siRNS-oligomerekkel (80 nM, Sigma, USA) transzfektáltuk SR-BI ellen, Lipofectamine 2000 transzfekciós reagens (Invitrogen) felhasználásával, a gyártó utasításainak megfelelően. Vegyes siRNS-oligomereket használtunk negatív kontrollként. 48 órás transzfekció után a sejteket ox-LDL-nek tettük ki. A megcélzott gének elnémulását western blot igazolta.
Az endotoxinok mérése
Az izolált HDL-ben jelen lévő endotoxin-tartalmat dinamikus turbidimetriás módszerekkel mértük bakteriális endotoxin autoanalizátoron (TDTF, BET-24A, Tianjin, Kína).
Statisztikai analízis
A statisztikai elemzést egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA), valamint egy- és többváltozós logisztikus regresszió-analízissel végeztük a GraphPad Prism 4.0 verzióval. A csoportok közötti összehasonlítást Tukey módszerével végeztük el. Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. A 0,05 alatti P értékeket szignifikánsnak tekintettük.
További részletek
Hogyan lehet idézni ezt a cikket: Song, G. és mtsai. A nagy sűrűségű lipoprotein az SR-BI expressziójának fokozott szabályozásával és az ER stressz útjának elnyomásával gátolja az ox-LDL által kiváltott adipokin szekréciót. Sci. ismétlés. 6., 30889; doi: 10, 1038/srep30889 (2016).
További információ
Word dokumentumok
További információ
Hozzászólások
Megjegyzés benyújtásával elfogadja az Általános Szerződési Feltételeinket és a közösségi irányelveket. Ha bármi sértőnek vagy összeegyeztethetetlennek tűnik a feltételeinkkel vagy irányelveinkkel, jelölje meg nem megfelelőként.