depresszióhoz

  • absztrakt
  • BEVEZETÉS
  • ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
  • elemeket
  • drogok
  • Kényszerű úszási teszt
  • Farokfelfüggesztési teszt
  • Nyílt terepi teszt
  • Világos-sötét feltáró teszt
  • Sürgősségi teszt
  • EPM
  • A stressz hormon mérése
  • Statisztikai analízis
  • AZ EREDMÉNYEK
  • Csökkent depressziószerű viselkedés a GAT1-hiányos egerekben
  • Csökkent szorongásszerű viselkedés a GAT1 knockout egerekben
  • A stressz hormon mérése
  • VITA

absztrakt

A depresszió és a szorongás emberek millióit érinti, minden korosztályból, fajból, vallásból és jövedelemből. Ezen rendellenességek kialakulásának molekuláris alapja azonban továbbra sem ismert. Egyre több bizonyíték arra utal, hogy a γ-amino-vajsav (GABA) rendszer fontos a pszichológiai betegségek, köztük a szorongás és a depresszió kialakulásában. Mágneses rezonancia spektroszkópiával végzett vizsgálatok arra utalnak, hogy az unipoláris depresszió a kortikális GABA szintjének csökkenésével jár. Úgy tűnik, hogy az antidepresszánsok és a hangulatot stabilizáló kezelések növelik a kérgi GABA szintet és javítják a hangulati rendellenességekben szenvedő betegek GABA hiányát (Krystal et al, 2002). A GABA receptorokat, beleértve a GABA A és a GABA B receptorokat, általában célpontnak tekintik a mentális betegségek kezelésében (Kalueff és Nutt, 1996). Az ilyen kezelésre használt gyógyszereknek azonban vannak mellékhatásai (Johnston, 1996; Tsang és Xue, 2004). A GABA felvételének gátlóival végzett állatkísérletek jelentős szorongásoldó hatásokat mutattak, amelyek arra utalnak, hogy a GABA felvételének modulálása potenciális célpont lehet a mentális rendellenességek kezelésében (Sayin és mtsai, 1992; Schmitt és Hiemke, 1999).

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

elemeket

drogok

Amitriptilint, imipramint, fluoxetint és buspiront a Sigma-Aldrich-től vásároltunk. A Tiagabine egy kedves ajándék volt a sanghaji Celstar Biotechnológiai Kutatóközponttól. A diazepamot a Shanghai Jiufu Pharmaceutical Co., Ltd.-től vásárolták. Ezeket a gyógyszereket beadás előtt sóoldatban oldottuk fel.

Kényszerű úszási teszt

Az egereket 25-26 ° C-os vízzel (10 cm magasság) töltött plexi hengerbe (10 cm belső átmérő, 50 cm magasság) helyeztük. Az állatok viselkedését manuálisan értékeltük, és a mozdulatlanság idejét a kísérlet 5 percében mértük. Az egeret akkor tekintették mozgásképtelennek, amikor lebegett a vízben, amihez csak a fej fölött a víz fölött tartásához szükséges mozgásokra van szükség (Bilkei-Gorzo et al., 2002; Porsolt et al., 1977a).

Farokfelfüggesztési teszt

Az állatokat intraperitoneálisan 10 ml/kg vivőanyag (fiziológiás sóoldat) vagy antidepresszáns injekcióval injektáltuk. Amitriptilint (10 mg/kg), imipramint (5 mg/kg) és fluoxetint (20 mg/kg) alkalmaztak antidepresszánsként. Negyven perccel később az egeret egy-egy farkánál fogva egy fémrúdra akasztották. A rudat 50 cm-rel az asztal puha ronggyal borított felülete fölé erősítették egy zaj ellen biztosított helyiségben. Az egér farka hegyét ragasztó skót szalaggal rögzítették a rúdhoz. A teszt időtartama 5 perc volt. A farokba akasztott egerek mozdulatlanságát a korábban leírtak szerint mértük (Bilkei-Gorzo és mtsai., 2002; Steru és mtsai., 1985).

Nyílt terepi teszt

A nyílt terepi tesztet a közzétett jelentéseknek megfelelően hajtották végre (Holmes és mtsai, 2003a, 2003b; Mathis és mtsai, 1994). A szabad tér négyzet alakú aréna volt (50 × 50 × 50 cm3) átlátszó falakkal és plexi padlóval, amelyet fluoreszkáló mennyezeti fény (1,5 μmol/m2/s) erősen megvilágított. Az egereket a doboz közepére helyeztük, és 10 percig szabadon vizsgálhattuk őket. Az egereket a padló fölé szerelt videokamerával rögzítettük, és videomegfigyelő rendszerrel elemeztük (Morris kóbor analizátor, V 1.1 BGB-vel). Az aréna meghatározott "széle" 8 cm széles a fal mentén, a "középső" mező pedig a nyílt mező 20 × 20 cm 2 átlagos területe, amely a teljes terület körülbelül 16% -a.

Világos-sötét feltáró teszt

A világos-sötét szűrést a korábban leírtak szerint végeztük (Crawley, 1981; Holmes és mtsai, 2003a, 2003b). A készülék egy polipropilén ketrecből (32 × 16 × 16 cm 3) állt, amelyet két rekeszre (sötét és világos) osztottak fel egy kis nyílású (8 × 5 cm 2) válaszfalakkal a padló szintjén, és infravörös érzékelővel látták el. az áthaladások számának és az egyes kamrákban eltöltött idő monitorozására szolgál. E kísérletek során a mennyezeti lámpákat lekapcsolták. Az ingadoboz könnyű fele nyitott volt, átlátszó és asztali lámpával (100 W) világította meg. Az egereket külön-külön a fényrekesz közepén, a septumtól eltekintve helyeztük el, és hagytuk, hogy 5 percig szabadon megvizsgálják a műszert. Feljegyeztük a két rekesz közötti világos-sötét átmenetek számát és a sötét rekeszben töltött teljes időt.

Sürgősségi teszt

A sürgősségi tesztet a korábban leírtak szerint hajtották végre (Holmes és mtsai, 2003b; Smith és mtsai, 1998; Takahashi és mtsai, 1989). A készülék egy átlátszatlan fekete plexi kockából (16 × 16 × 19 cm3) állt, amelynek egyik oldalán kimeneti nyílás (6 × 4 cm2) volt a padló szintjén. Ezt a "menedéket" egy nyílt mezőre (50 × 50 × 50 cm3) helyezték el, amelyet fényesen világított fluoreszkáló mennyezeti lámpa, és egy nyílással a nyílt mezőre nézett ki (a nyílt mező egyik falával párhuzamosan). Az egereket először egy menedékházban helyezték el egy 5 perces zárt kijárati szoktatás céljából. Ezután kinyitották a nyílást, hogy az egerek elhagyhassák a menhelyet, és 5 percig megvizsgálják a szabad terepet. Minden egér esetében rögzítették a menedékből való megjelenés késését, a menedékházon kívül töltött időt és a nyílt térre való átmeneteket.

Az EPM-et a korábban leírt módon hajtottuk végre (File, 2001; Holmes és mtsai, 2003a; Lister, 1987). A készülék két nyitott karból (25 × 8 cm2) és két zárt karból (25 × 8 × 12 cm3) állt, amelyek egy közös központi emeletről (8 × 8 cm2) nyúltak ki. A nyitott karok széle körül kis megemelt tollak (0,5 cm) megakadályozták az állatok megcsúszását. Az eszközt polipropilénből és plexiből (fehér padló, átlátszó falak) készítették, és a padló felett 50 cm magasra emelték. Az egereket a vizsgálat előtt 2 nappal a teszt szobába szoktattuk, és naponta kétszer gondosan előkezeltük az idegesség enyhítésére. A gyógyszeres kezelési kísérletekhez az egereket intraperitoneálisan 10 ml/kg vivőanyaggal (sóoldat) vagy gyógyszerekkel, buspironnal (1 mg/kg), diazepámmal (1 mg/kg) és tiagabinnal (8 mg/kg) injektáltuk 40 perccel a beadás előtt. teszt. EPM. Az egereket egyenként a nyitott kar felé néző középső négyzetre helyeztük, és hagytuk, hogy 10 percen keresztül egyenletesen megvilágítva (1,5 μmol/m 2/s) vizsgálják a műszert. Az egereket a labirintus fölé szerelt videokamerával rögzítettük, és videomegfigyelő rendszerrel (Morris kóbor analizátor. 1.1-ben BGB-vel) elemeztük. Nyitott és zárt karokat (mind a négy mancsot a vállban) tapasztalt megfigyelő jegyezte fel.

A stressz hormon mérése

A vérzés nélküli, lefejezett egerekből 10 perc fizikai visszatartás után (15 perc visszatartás 50 ml-es kúpos csőben) vagy otthoni ketrecben történő pihenés után (0900-1000) vért vettünk, és szérumgyűjtő csövön keresztül centrifugáltuk 1000 g-on. 15 percig. és -20 ° C-on tároltuk a felhasználásig A kortikoszteron méréseket a szérumon végeztük kortikoszteron immunvizsgálattal (R&D Systems) a gyártó utasításainak megfelelően.

Statisztikai analízis

Minden csoportra kiszámoltuk az átlagértékeket és az SE-t, és a csoportokat egyirányú ANOVA-val, majd t-teszttel hasonlítottuk össze. p +/+, n +/- és n -/- .

AZ EREDMÉNYEK

Csökkent depressziószerű viselkedés a GAT1-hiányos egerekben

Ebben a tanulmányban kényszerúszási tesztet (Porsolt et al., 1977a, 1977b) és farokfelfüggesztési tesztet (Bilkei-Gorzo és mtsai, 2002; Steru és mtsai, 1985) alkalmaztak a depressziós viselkedésre való hajlam értékelésére. genotípusosan különböző egércsoportok. Mindkét kísérleti séma azon a megfigyelésen alapul, hogy amikor a rágcsálók kénytelenek olyan averzív helyzetbe kerülni, ahonnan nem tudnak elmenekülni, abbahagyják a menekülési kísérletet és mozdulatlanná válnak. Az antidepresszánsok csökkentik az immobilitás idejét ezekben a vizsgálatokban (Porsolt, 2000; Steru és mtsai, 1987), ami arra utal, hogy ezek a módszerek alkalmazhatók a depresszióval kapcsolatos viselkedés tesztelésére egerekben. Az 1a. Ábrán bemutatott kényszerúszási teszt során a GAT1 -/- egerek mozdulatlansága szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a GAT1 +/- és GAT1 +/+ állatoké (F (2, 33) = 63, p -/- a GAT1 +/+ egerekhez képest (F (2, 16) = 16, p +/+ és GAT1 +/−, de a GAT1 -/- egereknél nem. Ugyanakkor hasonló válasz egy másik triciklusos abszorpciós inhibitorra, az imipraminra) Mindhárom csoportban megfigyeltük (1b. ábra). Ezek a megállapítások arra utalnak, hogy a GABAerg homeosztázis hosszú távú változásai befolyásolják az egerek depressziótól függő viselkedési hajlamát, a szerotonerg rendszer esetleges bevonásával.

A GAT1 -/- egerek depressziószerű viselkedését csökkentették az erőltetett úszás és a farokfelfüggesztés teszt során. a) Kényszerű úszáspróba (n = 12 csoportonként). A genotípusosan megkülönböztetett egerek viselkedését egy 5 perces kényszerúszó teszt során mérték. A vad, heterozigóta és homozigóta egerek mozdulatlansága 159,4 ± 8,7 s volt; 98,3 ± 7,6,6 s; 13, 6 ± 5, 1 s. *** p +/+ = 6, n +/− = 7, n -/- = 6) vagy 10 mg/kg amitriptilin (n +/+ = 7, n +/− = 6, n -/- = 8) vagy 5 mg/kg imipramin (n +/+ = 7, n +/− = 6, n -/- = 8) vagy 20 mg/kg fluoxetin (n +/+ = 5, n +/− = 5, n -/- = 5) az Anyagok és módszerek szerint. Az elmozdulási időt egy 5 perces farokszuszpenziós teszt során mértük. ## p ### p * p ** p *** p -/- több időt töltött a központi területen és több bemenetet hajtott végre (F (2, 51) = 3, 79, p = 0, 029), mint másik két genotípusos egér. Eközben a GAT1 -/- egerek hiperaktivitást és fokozott motilitást mutattak. Ez a fenotípus a váltási idő szignifikáns növekedésében nyilvánult meg (F (2, 51) = 26, 3, p -/-. A GAT1 -/- egerekben szintén szignifikánsan nagyobb volt a rendellenességek száma (F (2, 51) = 7, 63, p = 0,002).

Asztal teljes méretben

Mivel a szabad terepi kísérletek eredményei azt sugallják, hogy a GAT1 kiütése a hasonló szorongás csökkent viselkedéséhez vezet, úgy döntöttünk, hogy ezeket a megfigyeléseket további tesztekkel erősítjük meg.

A világos-sötét felmérési paradigmát, amely a rágcsálók veleszületett ellenszenvén alapszik az erősen megvilágított területeken és az állatok spontán felfedező magatartásán alapul, elsősorban az szorongásos viselkedés detektálására használják (Hascoet és mtsai, 2001). A GAT1 -/- egerek lényegesen kevesebb időt töltöttek a sötét szobában, mint a vad típusú egerek (F (2, 43) = 8,38, p

A GAT1 -/- egerek csökkent szorongásszerű viselkedést mutattak a világos és sötét szűrővizsgálatokban és detektálási tesztekben. a) A világos-sötét tesztben (n +/+ = 17, n +/− = 15, n -/- = 14). A GAT1 -/- egerek több világos-sötét átmenetet hajtottak végre. b) A GAT1 -/- egerek kevesebb időt töltöttek a sötét rekeszben, mint a GAT1 +/+ egerek. c) A képződés tesztjében (n +/+ = 6, n +/− = 8, n -/- = 7). A GAT1 -/- egerek jobban védik a nyílt terepi átmeneteket. d) A GAT1 -/- egerek több időt töltöttek menedékhelyen kívül, mint a GAT1 +/+ egerek. e) Először hagyjuk el a GAT1 -/- egerek menedékhelyét, ez hosszabb, mint a GAT1 +/+ egereknél, de a különbség nem szignifikáns. ** p *** p +/- egerek.

Teljes méretű kép

A vészhelyzeti teszt eredményeit a 2c-e ábra mutatja. Jelentős genotípusos hatás volt a szabadtéren történő átmenetekre és a menedékhelyen kívül töltött idő százalékos arányára, a menedékhelyről eredetileg kilépő késésre azonban nem (F (2, 18) = 0,45, p = 0,65). Az egyirányú ANOVA elemzés azt mutatta, hogy a GAT1 -/- egerek több nyílt terepi átmenetet hajtottak végre (F (2, 18) = 6,52, p = 0,007), és több időt töltöttek a zárt térből (F (2, 18) = 10, 9 ), p -/- több időt töltött a nyitott karban (F (2, 35) = 42, de a p -/- egerek kevésbé voltak hatással viselkedésére a megnövekedett plusz labirintus tesztben (3. ábra).

Normális és stressz okozta kortikoszteronszint a GAT1 -/- egerek szérumában. A GAT1 +/+ és a GAT1 -/- egereket eltávolítottuk az otthoni ketrecből (naivak), vagy 10 percig fizikai korlátozó stressznek tettük ki őket. Az egerekből vért gyűjtöttek azonnali lefejezés nélküli vérzéssel (n +/+ = 5, n +/− = 5, n -/- = 5). Az oszlopok és oszlopok az átlag ± SEM értéket képviselik. ** p +/- egerek.

Teljes méretű kép

VITA

A GABA a legfontosabb gátló neurotranszmitter a központi idegrendszerben (CNS), és a GABAerg rendszerek fontos szerepet játszanak a depresszió és a szorongás patofiziológiájában. A mágneses rezonancia spektroszkópia kimutatta, hogy az unipoláris depresszió a kortikális GABA szintjének csökkenésével jár együtt a betegeknél (Krystal et al, 2002). Ezenkívül a tiagabint, a GAT1 gátlót alkalmazzák szorongásos rendellenességek kezelésére (Crane, 2003; Lydiard, 2003; Schaller és mtsai, 2004; Schmitt és Hiemke, 1999). Ezek a megfigyelések indokolják a hangulati viselkedés változásainak vizsgálatát a GAT1 -/egerekben. - .

A kényszerű úszási tesztek és a farokszuszpenziók a leggyakrabban alkalmazott állatmodellek az antidepresszánsok szűrésére. A mozdulatlanság, a viselkedési kétségbeesés állapotát tükröző attitűd, amelyben az állatok már nem szöknek meg, depresszióval társul, az antidepresszánsok pedig lerövidítik az állatok mozgásképtelenségének idejét (Bilkei-Gorzo et al., 2002; Borsini et al. et al., 1988; Porsolt és mtsai, 1977a). Jelen vizsgálatunkban mindkét vizsgálatban szignifikánsan csökkent mozgásképtelenségi időt találtunk a GAT1 -/- egereknél. Ezek a viselkedési hatások hasonlóak azokhoz, amelyeket mi és más kutatók észleltek antidepresszánsokkal, például amitriptilinnel, imipraminnal és fluoxetinnel kezelt vad típusú állatoknál (1b. Ábra) (Bilkei-Gorzo et al., 2002; Borsini et al., 1988) . Porsolt et al., 1977a).

A GAT1 szorongásos viselkedésben betöltött szerepének további vizsgálatához három szorongásoldó gyógyszert választottunk ki: buspiront, diazepamot, tiagabinot, amelyek molekuláris célpontja eltérő, hogy tanulmányozzuk a GAT1-mutált egerekre gyakorolt ​​hatásukat az EPM viselkedési modell segítségével. A diazepam és a tiagabin a GABAerg rendszerre hat. A diazepám a BDZ helyeken agonista a GABA A C1 áramának növelésére, és CNS-csökkentő tulajdonságokkal rendelkező benzodiazepin (Banfi és mtsai, 1982; Atack, 2005). A tiagabin-hidroklorid, a GABA újrafelvételének szelektív inhibitora, a GAT1 blokád révén növeli a GABA tónust (Nielsen és mtsai., 1991; Rekling és mtsai., 1990). A buspiron, a szerotonin 1A receptor részleges agonistája, szintén antagonista hatást fejt ki a D (2) -dopamin és az α2-adrenerg receptorokra (Gobert és mtsai, 1999). A vad típusú kezelés ezekkel a gyógyszerekkel jelentősen megnövelte az aktivitást az EPM assay szabad karjaiban. A GAT1 -/- nélküli egerek azonban nem voltak érzékenyek e gyógyszerek viselkedési hatásaira.

Sok súlyos depressziós epizódban szenvedő beteg deregulálta a kortizol cirkadián szabályozását, szignifikánsan magasabb vérszinttel, mint egészséges egyéneknél (Strickland et al., 2002; Urani et al., 2005). A depressziós betegeknél a megnövekedett kortizolszint általában normalizálódik a sikeres antidepresszáns kezelés után (Wolkowitz és mtsai, 1993, 1999). Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a klasszikus benzodiazepinek csökkentik a HPA kéreg kérgének aktivitását (Mikkelsen és mtsai., 2005), és az alacsony szérum kortikoszteronszint a szorongás csökkenésével járhat (Ferguson és mtsai., 2004; Smith és mtsai, 1998). . Megvizsgáltuk a HPA tengely működését GAT1 -/- egerekben a kortikoszteron szintjének mérésével fizikai visszatartó stressz és normál aktivitás alatt. A kortikoszteronszint alacsonyabb volt a GAT1 -/- egerekben, mint a vad típusú egerekben normál aktivitás alatt. A stresszes genotípusok között azonban nem volt különbség. Ez arra utal, hogy a HPA tengely funkciója a GAT1 -/- egerekben normál körülmények között megváltozott, de a stresszérzékenysége nem változhat.

Végül eredményeink alátámasztják azt a hipotézist, miszerint a GAT1 működésének szabályozása befolyásolja a szorongásszerű viselkedést és a depressziót. A GAT1 -/- és a GAT1 +/− egerekben végzett, a GAT-1 hiányával és alacsony expressziójával végzett megfigyeléseink alapján adataink információkat szolgáltatnak a GAT1 expresszió hozzájárulásáról ezen mentális rendellenességek megnyilvánulásában. Ezért azok a gyógyszerek, amelyek a GAB1 funkcióját vagy expresszióját a GABAerg rendszer későbbi modulálásával képesek szabályozni, terápiás értékkel bírhatnak ezen mentális betegségek kezelésében. A GAT1 -/- egerek hasznos eszközként szolgálhatnak az antidepresszánsok és szorongásoldók farmakológiai hatásainak, valamint a depresszió és szorongás farmakogenetikájának további meghatározásához.