gátolja

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • Anyagok és metódusok
  • vadállat
  • Intra-VTA injekció
  • Táplálékbevitel
  • Mozgásszervi aktivitás
  • Működőképes
  • elektrofiziológia
  • A sejtek fluoreszcencia rendezése
  • Mennyiségi PCR
  • alapozók
  • Az FA telepítése a DA neuronokban
  • Statisztikai elemzések
  • az eredmény
  • Az intra-VTA oleate gátolja a táplálékfelvételt és serkenti a mozgásszervi aktivitást
  • Az Oleate In-VTA elnyomja az ételt
  • Az oleate modulálja a DA neuronális aktivitását
  • Fehérjék DA Neurons Express FA-Handling Proteins
  • Az FA-kat a DA Neurons veszi át
  • vita
  • következtetés
  • Finanszírozás és nyilvánosságra hozatal
  • További információ
  • PDF fájlok
  • További információ

elemeket

  • Sejtjelzés
  • Zsírsavak
  • Etetési magatartás
  • neurofiziológia
  • Jutalom

absztrakt

A hosszú láncú zsírsavak (FA) metabolikus jelek, amelyeket központilag detektálnak az energia homeosztázis szabályozására. A kezdeti munkában azt találták, hogy a hipotalamusz neuronjai megváltoztatják tüzelésük sebességét az FA hatására (Oomura és mtsai., 1975), míg a legújabb vizsgálatok kimutatták a központilag alkalmazott FA hatását a máj táplálásának és a glükóz termelésének elnyomására (Lam et al., 2005; Obici és mtsai, 2005; 2002; Schwinkendorf és mtsai, 2011). Beszámoltak arról, hogy az FA a táplálékfelvétel gátlására, valamint az autonóm funkció és a neurotranszmisszió modulálására a sejtek FA transzportjával és az intracelluláris anyagcserével kapcsolódik (Lam et al., 2005; Le Foll et al., 2013; Moulle et al., 2013; Obici és mtsai., 2003). Kimutatták, hogy az agyban a triacil-glicerin FA-hidrolízisének blokkolása növeli az étvágyat és a súlygyarapodást (Cansell et al., 2014; Picard et al., 2014b).

Van néhány bizonyíték arra, hogy az FA energiacserére gyakorolt ​​hatása az FA lánc kémiai szerkezetétől függ. Az egyszeresen telítetlen FA-oleát (OA) és a telített FA-palmitát (PA) a leggyakoribb hosszú láncú FA-k a keringésben, és különféle jelző és metabolikus hatásokat fejthetnek ki az agyban. Kimutatták, hogy az OA, a természetben legelterjedtebb FA, csökkenti az élelmiszer-fogyasztást, amikor akutan adják be a harmadik kamrának (Obici et al., 2002; Schwinkendorf et al., 2011), és gátolja vagy gerjeszti a hipotalamusz neuronjait (Jo et al., 2009; Le Foll és mtsai, 2009; Wang és mtsai, 2006). Ezenkívül kimutattuk, hogy az OA-nak az intracelluláris metabolikus sorsa az idegsejtekben a PA-hoz képest (Taib és mtsai, 2013).

Anyagok és metódusok

A kísérleteket jóváhagyta a CRCHUM Állatvédelmi Bizottsága, az Université de Montréal Állatetikai Bizottsága és a New Jersey-i Orvosi Iskola Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága. Az összes viselkedési tesztet patkányokon végezték a pontos VTA mikroinjekciók fenntartása érdekében, míg a fennmaradó kísérleteket egereken hajtották végre a transzgenikus vonalak és az elsődleges DA idegkultúrák számára kialakított módszerek miatt. Érkezéskor 250-280 g tömegű hím Wistar patkányokat (Charles River, Saint-Constant, Quebec) 8-10 nappal a műtét előtt a fordított ciklusú helyiségekben tartottunk (világítás 1000 órával). Hím C57B1/6 egereket (4-6 hetes korban) alkalmaztunk elektrofiziológiai felvételekhez. A tirozin-hidroxiláz (TH) promóter ellenőrzése alatt zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) expresszáló TH-eGFP transzgénikus egereket (C57B1/6 háttér) (Matsushita et al., 2002) használtunk fluoreszcenciával aktivált sejtek szortírozásához (FACS). Az elsődleges DA neuronkultúrákat postnatalis (P0 - P2) C57B1/6 egerekből származtatták (Fasano és mtsai, 2008).

Intra-VTA injekció

A sztereotaxiás műtétet izoflurán altatásban végezték, és a patkányatlasz agy atlasz koordinátáival szabályozták őket (Paxinos és Watson, 1998). A patkányokat kétoldalas vezető kanüllel (26-os nyomtáv, Plastics One) ültették be, amely 2 mm-rel a VTA felett (5,8 mm-rel a bregma mögött, ± 0,6 mm-re a középvonaltól és -6 mm-rel a dura-tól) ért véget. Az OA-t és a PA-t (Na +; Sigma-Aldrich) hidroxi-propil-β-ciklodextrinnel (HPB, CTD Holdings, Alachua, FL, USA) komplexeltük, és mesterséges cerebrospinális folyadékban (aCSF, mM-ben oldottuk: 125 NaCl, 2,5, 5 KCl)., 0,3 KH2P04, 26 NaHCO3, 10 glükóz, 1,3 MgS04 és 2,4 CaCl2 (pH 7,4), oldalanként 6 nmol végső mennyiségig. A 6 nmol dózis az előző táplálkozási kiértékelési vizsgálatokban felhasznált dózis 1/5-ét jelenti a HPB-vel komplexált harmadik kamra OA és PA reakciójaként (30 nmol - Obici et al., 2002; Schwinkendorf et al., 2011). Mivel szignifikáns anorektikus választ találtunk 60 nmol-ra, de 30 nmol-ra nem, az oldalsó kamrába adott OA-infúziók (az adatokat nem mutatjuk be), 10: 1 kamrát használtunk a parenchyma hígításához, hogy 6 nmol intra-VTA dózist kapjunk. . A floretin (EMD Millipore) oldatát 15% etanolban oldjuk, majd aCSF-ben 100 μM-ra hígítjuk. Az anyagokat oldalanként 500 nl térfogatban, 100 nl/perc sebességgel szállítottuk egy kétoldalas belső kanül (Plastics One) segítségével, amely 2 mm-rel kinyúlt a vezető kanül mögé.

Táplálékbevitel

Két patkánycsoportot (összesen n = 41) alkalmaztunk az intra-VTA OA és PA táplálékfelvételre gyakorolt ​​hatásának értékelésére. A patkányok 4-7 napig hozzászoktak a porított étrendhez. Az ételt 3 órával az OA vagy a vivőanyag, vagy a PA vagy a vivőanyag injekciója előtt távolították el, ami közvetlenül a sötét ciklus kezdete előtt következett be. A por alakú élelemmel megtöltött ételtartályokat egy nagyobb tartályba szerelték, hogy megfogja a kifolyt anyagokat. Az élelmiszer-fogyasztást és a testtömeget az injekció beadása után 2, 6, 12 és 21 órával ellenőriztük.

Mozgásszervi aktivitás

Az ambuláns aktivitást metabolikus kamrákban (AccuScan Instruments, Columbus, OH, USA) értékeltük, amelyekben a patkányokat az FA injekció beadása előtt 24 órával szokták meg. Az injekciókat közvetlenül a sötét fázis kezdete előtt hajtották végre.

Működőképes

Egy másik, kétoldalú VTA-kanülökkel rendelkező patkánycsoportot (n = 10) 45 mg magas zsírtartalmú pelletre és magas szacharóz-szacharózra (TestDiet, Saint Louis, MO, USA) reagáltunk emelő karokkal rendelkező patkányok progresszív amplifikációs arányára. (Med Associates, St. Albans, VT, USA), a korábban leírtak szerint (Sharma et al., 2012). Miután a kezelés abbahagyására stabil válasz érkezett, értékelték a VTA-n belüli vivőanyagba történő injekció hatásait, majd a következő napon OA-injekciót. A megszakítást stabilizáló stabilizálódás után (a kapott hozamok száma 15% -nál többet nem változott) értékeltük a kezelő reakcióját ugyanazokban az állatokban a vivőanyagra adott válaszként, majd OA + floretin (100 μM 0,5% etanolban) együttinjekcióját ). A viselkedés tesztelése az injekció beadása után 1 órával, a sötét fázis kezdetén kezdődött. A kanül elhelyezkedését metilénkék injekcióival (oldalanként 500 nl) ellenőriztük a kísérlet befejezése után.

elektrofiziológia

A sejtek fluoreszcencia rendezése

A P0-P2 egereket krioanesztetizáltuk és lefejeztük a szövetgyűjtéshez. Amint azt korábban leírtuk (Fulton és mtsai., 2011; Mendez és mtsai., 2008), frissen disszociált sejteket készítettünk VTA-ból, és a GFP-pozitív idegsejteket FACS-val tisztítottuk, és közvetlenül gyűjtöttük Trizole-ban (Qiagen, Toronto, ON, Kanada).

Mennyiségi PCR

A VTA-ból származó teljes RNS-t és a ventromediális hipotalamusz (VMH) mikrodisszekciókat, valamint a FACS-szelektált sejteket Trizol-tal extraháltuk. Az RNS koncentrációját és tisztaságát szisztematikusan értékeltük. Az RNS-eket reverz átírással cDNS-be írtuk át Moloney egér leukémiavírus reverz transzkriptáz segítségével (M-MLV RT, Life Technologies, Burlington, ON, USA). A géneket Rotor-Gene SYBR Green PCR PCR készlet (Qiagen) segítségével amplifikáltuk megfelelő primerpárok jelenlétében. Az eredményeket β-aktinra vagy ciklofilinre normalizáltuk, és a standard görbe módszerrel elemeztük (Taib és mtsai, 2013).

alapozók

Az alapozókat a BLAST (US National Library of Medicine) felhasználásával tervezték, és az Integrated DNA Technologies szintetizálta a következő szekvenciák alapján: actb (β-aktin) előre: 5-′TTCTTGGGTATGGAATCCTGTGGCA-3 ', fordított: 5'-ACCAGACAGCACTGTGTTGGCATA-3'; cd36 előre: 5'-TGCATGAATTAGTTGAACCAGGCCA-3 ', tolatás: CCACAGTTCCGATCGCAGCC-3', ppia (ciklofilin) ​​előre: 5'-GCTTTTCGCCGCTTGCTGCA-3 ', hátramenet: TGCAAACCAGCTC fabp3 előre: 5'-GATGACCGGAAGGTCAAGTC-3 ', hátramenet: 5'-GCCATGAGTGAGAGTCAGGA-3'; fabp5 előre: 5'-AAACCGAGAGCACAGTGAAGA-3 ', hátramenet: 5'-AAGGTGCAGACCGTCTCAGT-3'; fabp7 előre: 5'-AGTACATGAAGGCTCTGGGCGTG-3 ', hátramenet: 5'-ATCACCACTTTGCCGCCTTCCT-3'; fatp1 előre: 5'-GCAGGTACTACCGCATTGCT-3 ', hátra: 5'-GAACTTCTTGCGCAGTACCA-3'; fatp4 előre: 5'-TGTGGTGCACAGCAGGTATT-3 ', hátra: 5'-TTTCCTGCTGAGTGGTAGAGG-3'; gad1 (GAD67) előre: 5'-ATATCATTGGTTTAGCTGGTGAATG-3 ', hátra: 5'-GTGACTGTGTTCTGAGGTGAAGAG-3'; előre: 5'-CGACCCGTGGCCGGTCTAC-3 ', hátramenet: 5'-GCAGTCTGGCTCGGGTGAGTG-3'.

Az FA telepítése a DA neuronokban

A kérgi glia rétegben növesztett középagy DA neuronokat vad típusú P0-P2 egerekből állítottuk elő a leírtak szerint (Fasano és mtsai, 2008). Az FA felvételét C1-BODIPY 500/510-C12 alkalmazásával értékeltük, az FA fluoreszcens analógja, amely hasonlít egy hosszú láncú FA kémiai szerkezetére fluorofor fejjel (20 μM 0,8% DMSO-ban; ThermoFisher). Az oltás után tíz nappal a sejteket BODIPY-vel, BODIPY + floretinnel (100 μM 0,5% etanolban) vagy önmagában vivőanyaggal kezeltük táptalajban (glutamax-tal kiegészített Neurobasal) 45 percig. Jéghideg PBS-sel végzett három mosás után a sejteket 10% -os formalinnal 10 percig fixáltuk. A TH immunfluoreszcenciát a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (Fulton és mtsai., 2011). Az ImageJ analitikai eszközt (//imagej.nih.gov/ij/) használtuk a BODIPY fluoreszcencia intenzitásának meghatározására. Mindegyik körülmény esetében az integrált sűrűséget feltételenként három egyedi fedőlemezből származtatott × 63 nagyított mezőben (n = 45) mértük.

Statisztikai elemzések

Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be, és elemezzük a GraphPad Prism segítségével (5.02-es verzió a Windows GraphPad Software számára, San Diego, CA, USA). A táplálékfelvételre és a mozgásszervi aktivitásra vonatkozó adatok elemzéséhez Bonferonni utótesztekkel végzett kétirányú varianciaanalízist (ANOVA) használtunk. Egyirányú ANOVA-t alkalmaztak az elektrofiziológiában és az immunfluoreszcenciában Bonferonni utóvizsgálatokkal. A kezelő által reagált adatokat és a kvantitatív PCR-t (qPCR) Student t-teszttel elemeztük. A statisztikai szignifikanciát p = 0,05 értékre állítottuk be.

az eredmény

Az intra-VTA oleate gátolja a táplálékfelvételt és serkenti a mozgásszervi aktivitást

Megvizsgáltuk az intra-VTA OA és PA akut hatásait a táplálékfelvételre. Amint az 1a. És b. Ábrán látható, az OA jelentősen gátolta a táplálékfelvételt 12 órával az injekció beadása után (vivőanyag: 23,9 ± 1,3 g, OA: 19,6 ± 1,6 g; csökkenés 18%; ismételt mérések kétirányú ANOVA; F 1, 21 = 4, 47, p 0,05) vagy mozgás (F1, 16 = 0,07, p> 0,05; 1c. és d. ábra). A VTA kanül kétoldalú koordinátáit rodamin mikrogömbök injekcióival erősítettük meg (S1A. Kiegészítő ábra). Az OA vagy PA anorektikus hatása nem társult helyi gyulladáshoz, mert az IL-1 és a TNFα mRNS szintje a VTA-ban nem változott az OA injekció után (OA: IL-1 p: t17 = 0,29; TNFα: t17 = 0,35 PA: IL - lp: t4 = 0,84, TNFα: t4 = 1,25, p> 0,05, további S1B és C kép).

Az intra-VTA oleate gátolja a táplálékfelvételt és serkenti a mozgásszervi aktivitást. a, b) Az OA kétoldali mikroinjekciója (6 nmol/oldal) csökkentette a táplálékfelvételt (a) és fokozta a mozgásszervi aktivitást (b). (c, d) A PA injekciója a VTA-ba egyenértékű koncentrációban nem volt hatással a táplálékfelvételre (c) és a mozgásra (d). n = 8–13/táplálékfelvétel értékelési csoport; n = 7–10/csoport a fizikai aktivitási kísérlethez. Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. Kétszer ismételt mérés ANOVA, * p 0, 05) vagy magas zsírtartalmú reaktív pelletek (S3. Kiegészítő ábra); t5 = 1,05, p> 0,05). Megakadályozta azonban az OA által kiváltott csillapított töréspont válaszát (t6 = 0,31, p> 0,05; 2b. Ábra). Nem figyeltek meg változásokat a helyes és a helytelen karlejtések arányában (OA: t7 = 0,27; OA + floretin: t6 = 0,66, p> 0,05; 2c. És d. Ábra). Az ezt követő szövettani értékelés azt mutatta, hogy mindkét patkányban kétoldalas kanülök kerültek a VTA-ba (2e. Ábra).

Az oleate eltompítja a magas zsír- és cukortartalmú ételek jótékony hatásait. a) Az OA VTA-n belüli injekciója csökkentette azt a töréspontot, amely a magas zsírtartalmú/szacharóz-pelletekre reagált egy progresszív arányú műtéti feladat során. b) A theloretin blokkoló transzporter blokkolójának együttes injekciója megakadályozta az OA hatását. (c, d) Egyik kezelés sem befolyásolta a helyes karválaszok százalékos arányát. e) az injekciós kanül elhelyezése; minden szimbólum egy másik patkányt jelent (n = 7). Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. * p 0, 05).

Az oleate modulálja a dopamin neuronaktivitását. a) A VTA DA neuronok spontán elektromos aktivitásának feljegyzései a sejtáram termináljairól. Az OA csökkentette a legtöbb rögzített DA neuron akciós potenciál frekvenciáját (APF). A floretin egyidejű alkalmazása megakadályozta az OA által kiváltott APF gátlást. n = 6. b) Reprezentatív nyilvántartás. A helyiség membránpotenciálját vízszintes szaggatott vonal jelzi, és a bal oldalon látható. (c, d) Feszültség-szorító rekordok azt mutatják, hogy az OA csökkentette a miniatűr gerjesztő posztszinaptikus áramok amplitúdóját (I mEPSC, c) és frekvenciáját (d) az OA-gátolt neuronokban, ami megakadályozza a floretint. n = 7. e) Reprezentatív nyomok. A lefelé irányuló lehajlások az mEPSC-ket képviselik. Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. Egyirányú szabvány (a) vagy ismételt mérések (c, d) ANOVA. * p # p ### o

A zsírsavakat manipuláló fehérjék génexpressziós profilja a dopaminneuronokban és a VTA-ban. A DA idegsejteket (GFP +) és a nem DA sejteket (GFP-) a TH-eGFP egerek FACS-rendszerével rendeztük. A GFP + idegsejtek dopaminergek voltak, amit a TH mRNS magas szintje és a GAD67 mRNS hiánya bizonyít. A ciklofilin szolgált referencia génként, és az összes eredményt (a TH és a GAD67 kivételével) a VMH szövetből kapott értékekre normalizáltuk. FABP, zsírsavat kötő fehérje; FATP, zsírsav transzportfehérje; GAD67, glutamát-dekarboxiláz; TH, tirozin-hidroxiláz.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

Az FA-kat a DA Neurons veszi át

Az intracelluláris FA transzportot a BODIPY, az FA hosszú láncú fluoreszcens analógjának alkalmazásával értékeltük. A BODIPY alkalmazása az elsődleges DA idegsejteken foltjelzést eredményezett a TH (TH +) immunpozitív idegsejtekben, valamint a nem TH sejtekben történő jelölést (5e ábra, 5 órával kinagyítva). Az optikai Z-képalkotás és az ortogonális rekonstrukció feltárta a lipidcseppekre emlékeztető gömb alakú sejt sejtjelzését a TH + sejtekben és folyamatokban (5e. És f. Ábra). A BODIPY beépülés méretét csökkentették floretin hozzáadásával az inkubációs közegbe (5f. És g. Ábra). A BODIPY alkalmazása szignifikánsan megnövelte a sejtek fluoreszcenciájának intenzitását (integrált sűrűségértékben kifejezve) a vivőanyag státuszhoz képest, míg a floretin együttes alkalmazása gyengítette a fluoreszcencia jelölés intenzitását a TH + neuronokban (F 2, 44 = 502, 0, p = 0, 0001; 5j).,

Zsírsavbevitel az elsődleges dopamin neuronokban. A hosszú láncú FA BODIPY analóg alkalmazása a táptalajon intracelluláris elválasztást (zöld) eredményezett a citoplazmában, valamint a TH immunfluoreszcenciával (piros) azonosított idegsejtek DA-folyamatait. (a, d, g) A jármű használata. b, e, h) a BODIPY alkalmazása (20 μM). (c, f, i) A BODIPY (20 μM) + floretin (100 μM) alkalmazása. j) BODIPY fluoreszcencia intenzitás értékek kezelési körülmények között. Három fedőlap egy feltételhez. Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. Egyirányú ANOVA. *** p ### p