- elemeket
- absztrakt
- bevezetés
- az eredmény
- Mikrobiom jellemzés Macaca fuscata
- Az étrend elsősorban a bél mikrobiomját strukturálja
- Az anya étrendje strukturálja a mikrobák utódait
- A HFD csökkenti az utódokat Campylobacter
- vita
- mód
- Kísérleti terv
- Mikrobiom szekvenálás
- Adatok elemzése 16S
- Mennyiségi PCR
- További részletek
- növekményekkel
- Bioproject
- További információ
- PDF fájlok
- További információ
- Hozzászólások
elemeket
- dysbiosis
- Anyagcserezavarok
- mikroflóra
- Táplálás
absztrakt
A bélmikrobiom egyedülálló ökoszisztéma, valamint az anyagcsere és az elhízás alapvető közvetítője az emlősökben. A táplálkozás korai életkorban a bél mikrobioma fejlődésére gyakorolt hatását vizsgáló tanulmányok azonban főleg a főemlősök modelljeiben hiányoznak. Itt arról számolunk be, hogy a Macaca fuscata (japán makákó) utódainak bélmikrobiomját strukturálja a magas zsírtartalmú anyai vagy posztnatális étrend, de nem maga az elhízás. A keletkező mikrobiális diszbiózist az elválasztás után csak részben korrigálják zsírszegény kontroll étrenddel. A magas zsírtartalmú étrend váratlan korai expozíciója csökkentette a nem patogén campylobacter mennyiségét a fiatalkori bélben, ami arra utal, hogy az étkezési zsírok potenciális szerepet játszhatnak a főemlősök kommenzális mikrobaközösségek kialakításában. Adataink megkérdőjelezik az elhízást okozó bélmikrobiom fogalmát, és inkább bizonyítékot szolgáltatnak az anyai táplálkozás hozzájárulásáról a mikrobiota létrejöttéhez, ami viszont befolyásolja az anyagcsere fenntartását a belekben.
A bél mikrobioma egy robusztus ökoszisztéma, amelyet csaknem 100 billió baktérium él. Ezek a kommenzális baktériumok enzimatikus útvonalakat kódolnak, amelyek lehetővé teszik a zsírsavak és az 1, 2 vitaminok metabolizmusát és szintézisét. Születéskor az anyától származó hüvelyi és ürülék mikrobiotikumok vélhetően beoltják az újszülött szájüregét, amely a bél mikrobiota alapja az utódokban 3, 4. A gyermek növekedésével és új élelmiszerek bevezetésével a mikrobiómák gazdagságában és sokféleségében kibővülnek, és az elválasztás után röviddel stabil állapotba kerülnek, tükrözve a felnőtt 5, 6 mikrobiotokat. A terhességi anyai táplálkozás, az adagolás módja és a laktáció hatása az infantilis és a juvenilis bélmikrobiómák filogenetikai szerkezetére még mindig nem vizsgálták kellőképpen a jól kontrollált 3, 4, 5, 7 modellekben .
Ebben a tanulmányban azt tapasztaltuk, hogy a Mucaca fuscata (japán makákó) reprezentatív modell az emberi mikrobiom vizsgálatához. Továbbá megvizsgálhatjuk az anyai táplálkozás terhesség és szoptatás során betöltött szerepét a fiatalkori mikrobiom létrejöttében. Megállapítottuk, hogy míg a mikrobioma elsősorban étrend alapján épül fel, az anyai táplálkozás alapján tartós változásokat tapasztalunk a fiatalkori mikrobiómában; ezek a tartós változások a fiatalkorú kohorszok együttélése ellenére történtek. Ezek a tanulmányok hozzájárulnak a munka bővüléséhez, és bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy az étrend nagymértékben alakítja mikrobiomunkat. Ezek a tanulmányok további betekintést nyújtanak abba, hogy a mikrobioma fejlődése miként befolyásolhatja az emberi étrend kialakulását a metabolikus betegség állapotának elősegítése érdekében.
az eredmény
A Macaca fuscata mikrobioma jellemzése
Az anyai és testtáplálkozás manipulációjának a főemlősök mikrobiogén képződéséhez való relatív hozzájárulásának vizsgálatához metagenomikai vizsgálatokat hajtottunk végre a jól kinőtt japán makákó (Macaca fuscata) 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32. Először határoztuk meg az M. fuscata összehasonlító relevanciáját emberben a test több helyén, egészséges, nem vemhes felnőtt főemlősök orális, hüvelyi és bélmintáinak összegyűjtésével és a 16S rRNS 454 piroszekvenálásával, a filogenetikai főkoordinátanalízissel (PCoA) együtt. ). A 2., 20., 33. emberhez hasonlóan, de csak az egereknél egyedülállóan figyeltük meg a szájüregi, hüvelyi és bélmikrobioterek diszkrét aggregálódását, ami azt jelenti, hogy ezek a testhelyek nagyrészt megtartják a populáció egyedi réseit, bár taxonok osztoznak néhány székletet demonstráló egyénnel. a hüvely (1a. ábra).
DNS-t izoláltak a bélből (végbélből, vastagbélből és székletből), a hüvelyből vagy a szájüregből nyert M. fuscata vagy H. sapiens tamponokból. A 16S rDNS szekvenálást 454 FLXtitanium rendszerrel végeztük, és a szekvenciákat QIIME szoftverrel elemeztük. a ) PCoA grafikonok, amelyek a bél (kék), hüvelyi (piros) vagy orális (narancs) tamponokból vett minták béta változatosságát mutatják. Az egyes testhelyeken használt állatok számát (n) zárójelben jelöli az ábra jelmagyarázata. b ) Az M. fuscata (ez a munka) vagy a H. sapiens bél-, hüvely- vagy szájüregéből izolált baktériumok száma (HMP segítségével, elérhető: //www.hmpdacc.org/). Az egyes törzseket a filogenetikai fák különböző színnel ábrázolják. Az összes anya és kölyök száma, amelyből a mikrobion-jellemzés származott, 50 volt, a minták a test több részéről érkeztek.
Teljes méretű kép
Ezenkívül összehasonlítottuk a test minden helyén található taxonokat a Humán Mikrobiom Projekt (HMP; hmpdacc.org) nyilvánosan elérhető adataival. A menekültügyi szinten a bél taxonjai hasonlóak voltak, és a Bacteroidetes és a Firmicutes uralta őket (1b. Ábra). A nemzetség szintjén azonban nyilvánvaló különbségek voltak a Bacteroidetesben. Különösen a baktériumok előfordulása az emberekben és a Prevotella a makákókban valószínűleg az étrendi különbségek tükröződik. A bakteroidok a telített zsírok és állati fehérjék emésztésére szolgáló enzimeket kódolják, amelyek gyakoribbak a nyugati étrendben 5, míg a Prevotelle-ben az anyagcsere-rekonstrukciókban a növényi xilán és a cellulóz emésztési útvonalai dominálnak, amelyek gyakoribbak a M. fuscata mindenevő táplálékában és Burkina Faso népessége 5. Az orális mikrobiota hasonlóan a törzs szintjén volt, kivéve a Fusobacteriumok nagyobb relatív bőségét emberben (1b. Ábra). Összességében az M fuscata bél- és szájüregi mikrobiális közösségei hasonlóak az emberiekéhez.
A M. fuscata hüvelyi mikroba kevesebb Lactobacillust tartalmazott, mint az embereknél, észrevehetően sokszínűbb volt, mint az ember, és taxonokat tartalmazott a bél mikrobiómájához leggyakrabban kapcsolódóan. Míg az emberi hüvelyi mikrobiomban a megnövekedett bakteriális sokféleség a 34., 35. bakteriális vaginosishoz kapcsolódik, más főemlősök (pl. Páviánok) hüvelyi mikrobiális sokféleséget hordoznak, hasonlóan ahhoz, amit egészséges, terhes makákóknál figyeltünk meg 36. Egyes hüvelyi és bélminták összevonása (1a. Ábra) arra utal, hogy ezek a makákó makonómiai bőségprofilok nagy valószínűséggel anatómiai és higiéniai különbségeknek köszönhetők, amelyek székletszennyezéshez vezetnek.
Az étrend elsősorban a bél mikrobiomját strukturálja
Az elhízástól és az inzulinrezisztenciától függetlenül a HFDS (elhízott, inzulinrezisztencia) és HFDR (szegény, inzulinérzékeny) klaszterek csoportosultak és PCoA-val különböztek a CTD rekeszektől (P = 0,001 a permutációs többváltozós varianciaanalízis (PERMANOVA) szerint. 2a) . ). Ezt a megállapítást megerősítette az alfa változatosság és a fajgazdagság mértéke, amelyek nem mutattak ki szignifikáns különbséget a HFDS és a HFDR gátak között (1b., C. Ábra) Érdekes módon nincsenek nyilvánvaló különbségek a keringő plazma gyulladásos citokinek szintjeiben 37, amelyek megmagyaráznák az étrend alapján történő eltérő aggregációt. A teljes zsírsavak (telített, egyszeresen telített, többszörösen telítetlen és esszenciális) és az n-6 zsírsavak növekedéséről azonban beszámoltak a HFD 38-at fogyasztó gátak esetében, ami valószínű magyarázat arra, hogy miért nem találhatók szokások és inzulinrezisztencia a bél mikrobiómáiban .
Bélmintákat vettünk M. fuscata-ból, amelyet izokaretikus étrenden tartottak, amely 13% zsírt (kontroll étrend) vagy 36% zsírt (magas zsírtartalmú étrend) tartalmaz. A béltartalomból DNS-t izoláltunk és 16S rDNS-sel (454 FLXtitan) piroszekvenáltuk. A szekvenciákat QIIME szoftverrel elemeztük. a ) PCoA grafikon, amely a kontroll étrenddel (CTD, zöld), a rossz étrenddel (HFDR, sötétkék) vagy a magas zsírtartalmú étrenddel (HFDS, világoskék) rendelkező egyedek különböző csoportosulását mutatja be. Az egyének az étrend alapján szignifikánsan csoportosulnak (P = 0,001 a PERMANOV szerint). Az egyes kategóriákba tartozó állatok száma (n) a jelmagyarázat zárójelében található. b ) Grafikon, amely bemutatja a törzsdússág különbségeit a kontroll étrenden (CTD), az étrendben szegény étrendben (HFDR) és a magas zsírtartalmú elhízásban (HFDS) szenvedők között. A grafikon jobb oldalán található magyarázatok az egyes képviselt baktériumok színét mutatják.
Teljes méretű kép
Bélmintákat vettünk M. fuscata-ból, amelyet izokaretikus étrenden tartottak, amely 13% zsírt (kontroll étrend) vagy 36% zsírt (magas zsírtartalmú étrend) tartalmaz. A béltartalomból DNS-t izoláltunk és 16S rDNS-sel (454 FLXtitan) piroszekvenáltuk. A szekvenciákat QIIME szoftverrel elemeztük. a ) Az LEfSe 16S szekvenciák elemzéséből nyert kladogram. A zöld árnyékolt területek nagyobb arányú baktériumokat jeleznek a kontroll étrenddel etetett állatokban, míg a kék árnyékos területek a magasabb zsírtartalmú étrendet (HFD) fogyasztó állatoknál nagyobb gyakorisággal. b ) A kontroll étrendet (CTD, zöld oszlopok) vagy a magas zsírtartalmú étrendet (HFD, kék oszlopok) tartalmazó baktériumok nemzetségeinek relatív száma. A dobozdiagramok az adatok eloszlását mutatják, a mező közepén az átlagot képviselő vonallal. A medián bal oldala a harmadik kvartilt, a jobb oldala az első kvartilit jelöli. A mezőtől jobbra levő vonalak az 1,5-et jelzik az alsó kvartilis interkvartilis tartományában, a bal oldali vonalak pedig az 1,5-et jelzik a felső kvartilis interkvartilis tartományában. A pontok a kiemelkedőket képviselik.
Teljes méretű kép
Az anya étrendje strukturálja a mikrobák utódait
6 hónapos vagy 1 éves korig, ami a hozzávetőleges fejlettségi egyenérték az emberekben a felnőtt mikrobiota jelenlétében 3, 46 .
Teljes méretű kép
Tekintettel az anya HFD-expozíciójának az utódok eredő bél taxonjaira gyakorolt hatására, arra törekedtünk, hogy meghatározzuk, hogy a nemzetség mely tagjai és a taxonómiai anyagcsere útvonalak vagy az átviteli minták vezettek e megállapításokhoz. A 16S-eredetű metagenomikus adatokból kiválasztva a Borutus-funkciót, kiderült, hogy a proteobaktériumok, elsősorban az Epsilonproteobacteria Campylobacter spp. és a Helicobacter spp., a Firmicutes Ruminococcus és Dialister dúsítással együtt (5a. ábra). Amikor tovább vizsgáltuk a 16S-eredetű metagenomikus adatokat a nemzetség szintjén, azt találtuk, hogy a Campylobacter spp csökkent az utódokban bármilyen HFD-expozíció után, akár terhesség/szoptatás, akár elválasztás után (5b. És 6. ábra). Mint az anyai kohorsz CTD-nkben (2b. És 3b. Ábra), az elválasztott CTD-n fenntartott serdülők hasonlóan emelkedett Treponemát hordoztak (5. és 6. ábra). A vastagbél bél taxonjainak elemzése a fajgazdagság (2b. Kiegészítő ábra) és a diverzitás (2c. Kiegészítő ábra) csökkenését mutatta az étrendi zsír expozíció bármely szintjén; ezt a megfigyelést a LEfSe is megerősítette (további 2d. ábra).
Hőtérkép a nemi szintű változásokat jelzi az M. fuscata között, amely kontroll vagy magas zsírtartalmú étrendet fogyasztott terhesség/szoptatás és/vagy elválasztás alatt. Az egyes nemzetek relatív mennyiségét színgradiens jelzi, a szürkétől (alacsony bőség) a pirosig (magas bőség). A manhattani távolság és a hierarchikus csoportosítás alapján létrehozott hőtérkép egy átlagos összeköttetésen alapul. A forró térkép feletti legenda az anya táplálékát és táplálkozását jelzi az egyes képviselt fiatalkorúak elválasztása után. A dendrogram alapján a kontroll/kontroll étrendet fogyasztó kölykökből származó mintacsoport figyelhető meg a Campylobacter nagyobb száma miatt. Az egyes kohorszok fiatalkorúinak számát (n) zárójelben adják meg az ábra jelmagyarázata.
Teljes méretű kép
Megfigyeléseink együttesen vitatják azt a felfogást, hogy létezik egy eredendően "elhízott" mikrobióm, és inkább támasztják alá az egerek és az emberek felmerülő adatait, amelyek arra utalnak, hogy az étrend és a mikrobiális közösség közötti átvihető és módosítható kölcsönhatás befolyásolja a gazda biológiáját (adipozitás) 9, 24. Adataink, amelyek az anyai táplálkozás, nem pedig az anyai elhízás önmagában betöltött szerepét mutatják be az utódok bélmikrobiomjának kialakulásában 1 éves korukban, összhangban állnak a magzati epigenómára gyakorolt hatására vonatkozó korábbi eredményeinkkel 27, 28, 30. Bár korábban láttuk, hogy elválasztás után az étrend megfordítása megmentheti a 27, 28 cirkadián útban részt vevő gének expresszióját, az elválasztás utáni megfordulás nem szabályozza a 30 magzati epigenom méhében bekövetkező összes változást. Itt leírjuk az utódok újabb, az anyai táplálkozás miatti tartós változását, a Campylobacter nemzetség csökkenésével az anyai táplálkozás miatt. A mikrobiota epigenetika megváltoztatásában betöltött szerepére gyakorolt következmények mellett vagy fordítva, a mikrobiómában ezek a tartós változások támogathatják a szorongási viselkedésben már leírt változásokat 32. Összességében ezek az adatok feltárják a biológiai rendszerek közötti áthallás lehetséges útjait.
mód
Kísérleti terv
Mikrobiom szekvenálás
Mintákat vettünk a gyomor-bél traktusból (széklet, emelkedő vastagbél, végbél), a hüvelyből vagy a szájüregből, és a DNS-t Powersoil DNS izoláló készlet segítségével (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA) izoláltuk. Bélmintákat vettünk az utolsó székletből, a felemelkedő vastagbél luminális oldalának tartalmából, és egy boncolás után egy vattapálcával a végbélbe. A test tépésével szóbeli és hüvelyi mintákat vettünk. A DNS kivonása után a baktériumok 16S rDNS-ét amplifikálták, és a minták azonosításához V3V5 primerekkel ellátott vonalkódokat használtunk a 454 szekvenálása előtt; a kapott szekvenciákat kvantitatív betekintéssel elemeztük a mikrobiális ökológiai szoftverbe (QIIME) 56. A V3V5 alapozó sorrendje a kisbetûs vonalkódokkal a következõ:.
Adatok elemzése 16S
Az előkezelés magában foglalta az olvasás eltávolítását vonalkód vagy primer szekvenálás nélkül, majd a leolvasás eltávolítását kevesebb, mint 200 nukleotid hosszúsággal, és a leolvasást minimum 20-nál alacsonyabb átlagos minőséggel. távolítsa el a kiméra szekvenciákat. Először kiszámolták az áramlási távolságot és hierarchikusan csoportosították a teljes kapcsolatot. Ezután egy elvárás-maximalizáló algoritmust használtak a pirokvencia zajának eltávolítására, és az olvasmányokat tovább csökkentették 400 bázispárra. A PCR hibát kiszámítottuk a szekvenciák között, és klaszterbe vettük, hogy bemenetet nyújtsunk a SeqNoise-hoz. Ezután a SeqNoise lépésben eltávolítottuk a PCR hibákat. A primereket és a vonalkódokat kivágtuk a dehumált szekvenciákból. Végül a dehumált szekvenciákat tovább csoportosítottuk a kapcsolatok teljes csoportosításával operatív taxonómiai egységekre (OTU) 97% -os hasonlósági szinten az AmpliconNoise segítségével. Az OTU 58-ban jelent meg. Az egyes szekvenciák taxonómiai hozzárendelését a legspecifikusabb taxonómiai szinten csonkolták, legalább 85% -os megbízhatósági pontszámmal.
Mennyiségi PCR
Ezenkívül az M. fusata-ból izolált DNS-t PCR-amplifikációnak vetették alá a Campylobacter nemzetséghez és az univerzális 16S rDNS-hez is, amint azt korábban 47, 65 leírtuk. A Campylobacter-specifikus PCR-hez használt primerek a C412F 5'-GGATGACACTTTTCGGAGC-3 'és a C1288R 5'-GGATGACACTTTTCGGAGC-3' voltak. Ezek a primerek 812 bp-os terméket állítottak elő 28 PCR-amplifikációs ciklus alkalmazásával 94 ° C-on 1 percig, 55 ° C-on 1 percig és 72 ° C-on 1 percig. Az univerzális 16S rDNS-t a fent leírt primerek (16SuniversalFor és 16SuniversalRev) felhasználásával amplifikáltuk, és 462 bp-os terméket termeltünk 30 amplifikációs ciklus után 95 ° C-on 1 percig, 60 ° C-on 1 percig és 72 ° C-on 1 percig. A PCR-termékeket etidium-bromidot tartalmazó 3% -os agarózgélen futtattuk. A gélt VisionWorks LS elemző szoftver (Upland, Kalifornia) 66 segítségével vizualizáltuk és mennyiségileg meghatároztuk .
További részletek
Belépési kódok: A metagenomikus adatokat a BioProject adatbázisban PRJNA231152 csatlakozási kód alatt tároltuk.
Hogyan idézhetem ezt a cikket: Ma, J. és mtsai. A terhesség alatti magas zsírtartalmú anya-étrend a főemlős modellben folyamatosan megváltoztatja az utódok mikrobiómáit. Nat. Commun. 5: 3889 doi: 10, 1038/ncomms4889 (2014).