- elemeket
- absztrakt
- bevezetés
- az eredmény
- A vastagbél nyálkahártyájának változásai az étrend megváltoztatása után
- A vastagbél mikrobiális anyagcseréjének változásai az étrend megváltoztatása után
- Az anyagcsere globális változásai az étrend megváltozása után
- A mikrobák és metabolitok globális társulásai
- Alacsony rosttartalmú étrend és magas zsírtartalmú mérgező mikrobiális metabolitok
- vita
- mód
- Dizájnt tanulni
- Tantárgyak és toborzás
- kivetítés
- Tantárgyi alkalmasság
- Széklet, vastagbél és nyálkahártya mintavétel és kolonoszkópia
- Nyálkahártya biomarkerek mérése
- immunhisztokémia
- Az immunhisztokémiai festés mennyiségi meghatározása
- Ki67
- CD3
- CD68
- A széklet- és a vastagbélmikrobák és a különös érdeklődésű metabolitok célzott elemzése
- Plazma aminosavak
- Statisztikai analízis
- A mikrobiota összetételének és sokféleségének globális elemzése
- HITChip elemzés
- Mikrobiális együttes előfordulású hálózati elemzés
- A metabolom globális elemzése: minta előkészítése az NMR spektroszkópiai elemzéshez
- 1H-NMR-spektroszkópia
- Többváltozós statisztikai adatok elemzése
- Metabolikus reakcióhálózat létrehozása
- További információ
- PDF fájlok
- További információ
- Hozzászólások
elemeket
- Vastagbél rák
- járványtan
- Táplálás
- Kockázati tényezők
absztrakt
Két nemrégiben publikált, emberen végzett vizsgálat eredményeiből tudjuk, hogy az étrend rost- és zsírtartalmának módosítása több nap alatt is nagy hatással van a vastagbél mikrobiotájára 11, 12. Itt kritikus információkat nyújtunk a vastagbél nyálkahártyáján lévő mikrobiotában bekövetkező változások funkcionális jelentőségéről azáltal, hogy megváltoztatjuk az étkezési zsír/rost arányt két magas és alacsony kockázatú vastagbélrákunkban. Az 1. táblázatban felvázolt vizsgálati terv felhasználásával bemutattuk a szacharolitikus fermentáció és a butirogenezis várható növekedését és a másodlagos epesav szintézis szuppresszióját, amelyet az afroamerikaiak 2 héten át tartó magas rosttartalmú, alacsony zsírtartalmú étrendre való áttérése eredményez. a gyulladás és a bruttó proliferáció biomarkereinek jelentős csökkenése, a bélrák kockázata. Ezzel szemben a vidéki afrikaiak étrendjének megváltozása alacsony rosttartalmú és alacsony rosttartalmú étrendre reverzibilis változásokhoz vezetett ezekben a paraméterekben.
Asztal teljes méretben
az eredmény
A vastagbél nyálkahártyájának változásai az étrend megváltoztatása után
( a ) Jelentősen megváltozott nemzetségszerű baktériumcsoportok áttekintése (FDR 1 étkezés előtt és után, és legalább r |> 0, 5. A pozitív korrelációkat zöld vonalak jelzik, a negatív korrelációkat a piros vonalak. Az azonos színű csomópontok három hálózati modult jelölnek vagy több, egyidejűleg előforduló szürke csomópont kevesebb, mint három egyidejű csoport moduljait képviseli, vagy azokat, amelyeket a modul nem képvisel. A minta mérete 20 afroamerikai és 17 vidéki (őshonos) afrikai.
Teljes méretű kép
Az anyagcsere globális változásai az étrend megváltozása után
Teljes méretű kép
Teljes méretű kép
Asztal teljes méretben
A mikrobák és metabolitok globális társulásai
Ennek vizsgálatára részleges korrelációs elemzést végeztünk a nemzetségi szintű mikrobák, valamint a vizelet- és ürülék metabolitjai között (4b. Ábra), nemzetiséghez és étrendhez igazítva. Bár nem tudjuk biológiailag megmagyarázni az összes asszociációt (például a propionát korrelál az enterobaktériumokkal és a streptococcusokkal, amelyekről nem ismert, hogy propionátot termelnek), az egyik szembetűnő jellemző az volt, hogy a butirát-metabolit kizárólag olyan mikrobiális csoportokkal társult, amelyekről ismert, hogy propionátot tartalmaznak. Butirát-termelők. Ilyen például a R. zarnu és a rel., az E. rectale és a rel. és C. symbiosum és rel., amelyeket a 3. ábra együttes előfordulási hálózatai mutatnak be. 3b növekedni fog, amikor a lakosság mindkét rétege magas rosttartalmú étrendet fogyasztott.
Alacsony rosttartalmú étrend és magas zsírtartalmú mérgező mikrobiális metabolitok
vita
mód
Dizájnt tanulni
Tantárgyak és toborzás
Az életkorhoz és nemhez illeszkedő egészséges önkénteseket, 50–65 éves kor között, véletlenszerűen választottuk ki a pennsylvaniai Pittsburgh-i régió afro-amerikai lakosságából, valamint a vidéki dél-afrikaiakból a vidéki Kwazulu régióból. Együttműködtünk Dr. Stephen Thomasszal, a Pittsburghi Egyetem Közegészségügyi Iskolájának kisebbségi tanulmányainak igazgatójával egészséges afro-amerikai önkéntesek toborzásában a Pittsburgh-i régióból, és a tanulmányt az Intézményi Felülvizsgálati Testület jóváhagyásával hirdettük meg a nyilvános területeken is. Dél-Afrikában önkénteseket toboroztak nyilvános közösségi központokban, például postákon, városházákon, polgári központokban elhelyezett hirdetések, valamint az iZulu Közösségi Egészségügyi Központ segítségével. Megfelelő ellentételezést (a kisebbségi tanulmányok és az iZulu közösség tanácsa alapján, valamint a Pittsburghi és a KwaZulu-Natal Egyetem ratifikálva) az önkénteseknek a részvételért fizetett idő és tesztelésért.
kivetítés
Minden résztvevőtől megkapta a tájékozott aláírt hozzájárulást. Minden afrikai önkéntes értett angolul, de egy ápoló-fordító részt vett a beleegyezési folyamatban, hogy biztosítsa a kutatási eljárások részleteinek megfelelő megértését. A szűrést Pittsburgh-ben, a Klinikai Transzlációs Kutatóközpontban és Afrikában, a Ngwelezana Kórház ambulanciáján, Empangeni, KwaZulu-Natal, Dél-Afrika végezte. Először részletes kórtörténetet készítettek. A vidéki afrikaiaknál egy helyi kétnyelvű nővér tolmácsként működött. 20 ml-es vérmintát vettünk a teljes vérkép, az ESR, az elektrolitok és a karbamid, az albumin, az alkalikus foszfatáz, az AST és a bilirubin mérésére. Ha az eredmények normálisak voltak, és ha teljesítették az alkalmassági feltételeket, felkérték őket, hogy vegyenek részt a tanulmányban.
Tantárgyi alkalmasság
A részleteket az 1. kiegészítő megjegyzés tartalmazza. A felvételi kritériumok a következők voltak: egészséges önkéntesek GI szempontjából 40 és 65 év között (életkor, amikor a vastagbélrák szűrése/kolonoszkópia ajánlott ebben a populációban) és a testtömeg-index 18 és 35 kg m között. −2 (Kiegészítő vita). A kizárási kritériumok a következők voltak: a résztvevők a kolonoszkópiát megelőzően nem voltak jogosultak, ha a beiratkozást megelőző 5 éven belül családi adenomatózus polipózis, örökletes nem polipózisos vastagbélrák, gyulladásos bélbetegség vagy invazív rák volt (h/o adenomatózus polipok elfogadhatók). Ezenkívül a nem jogosult résztvevők egyének ismert vese-, máj- vagy vérzési rendellenességekkel voltak; korábbi bélműtét, amely bélműködés zavart eredményezett a bél elvesztése vagy megváltozott anatómia miatt, vagy krónikus GI betegség bármely formája, amely zavart bélműködést, hasmenést és felszívódási zavarokat eredményezett; és az elmúlt 12 hétben antibiotikumot használó személyek (kiegészítő vita), jelenleg szteroidokat használnak vagy cukorbetegek. A kolonoszkópia utáni kizárási kritériumok korábban fel nem ismert fekélyek (mélység és> 0,5 cm), szűkület, súlyos gyulladás és 1 cm átmérőjű polipok vagy rák kimutatása.
Széklet, vastagbél és nyálkahártya mintavétel és kolonoszkópia
Nyálkahártya biomarkerek mérése
Szövettan. A vastagbél nyálkahártya biopsziáit kolonoszkópiával állítottuk elő az étrendi váltás előtt és után három különböző helyről (növekvő, keresztirányú és csökkenő), és 10% pufferelt formalinban tároltuk. Később a biopsziás mintákat parafinba ágyazottuk, majd 5 mm-es metszeteket vágtunk, és vagy rutinszerű haematoxilinnal és eozinnal (H&E), vagy immunhisztokémiai foltokkal festettük (lásd alább). A H & E-vel festett metszetek szövettani eredményeit egy vak, tapasztalt gasztroenterológiai hisztopatológus (AK) értékelte. A mérések a gyulladásos sejtek és az eozinofilek számára összpontosítottak a lamina propriában és az intraepithelialis limfociták számára. A H & E-vel festett szakasz pontozása az 5a. Kiegészítő táblázat szerint történt. Minden kóros leletet, például parazita organizmusok jelenlétét feljegyeztek.
immunhisztokémia
A CD3 és Ki67 festés tárgylemezeit 2 órán át 60 ° C-on paraffinoztuk. Az endogén peroxidáz gátlásához a tárgylemezeket 3% hidrogén-peroxid/metanol alkalmazásával szobahőmérsékleten (RT) 10 percig előkezeltük, majd 0,2% pepszinoldattal (P7012, Sigma, 3050 Spruce St, St Louis, MO) antigén visszanyerést végeztünk. (USA) 37 ° C-on 10 percig. Szérummentes fehérjeblokkot (X0909, Dako, 6392 Via Real, Carpinteria, CA 93013, USA) szobahőmérsékleten 10 percig használtunk. A tárgylemezeket leeresztettük és inkubáltuk primer CD3 és Ki67 antitestekkel (A0452, 1: 100, nyúl poliklonális, Dako; MIB-1, 1: 100, egér monoklonális, Dako), szobahőmérsékleten, 1 órán át. A másodlagos detektálást Immpress univerzális antitest polimer detektáló készlettel (MP-7500, Vector Labs, 30 Ingold Road, Burlingame, CA 94010, USA) 30 percig szobahőmérsékleten végeztük. A tárgylemezeket DAB szubsztrátkészlettel (SK-4100, Vector Labs) festettük 10 percig, és ellenfestést használtunk Shandon Hematoxylin (6765015, Thermo Scientific, 81 Wyman St, Waltham, MA 02451, USA) alkalmazásával.
A CD68 tárgylemez festését Ventana Benchmark Ultra tárgylemez festékkel végeztük. A deparafinizált tárgylemezeket az ultra CC1 (950-224, Ventana, 1910 Innovation Park Dr, Tucson, AZ 85755, USA) alkalmazásával előkezeltük 24 percig az antigén visszakereséséhez. A tárgylemezeket a primer CD68 antitesttel (M087601, 1: 100, egér monoklonális, PG-M1 klón, Dako) inkubáltuk 32 percig RT. Az Optivew DAB kitet (760-700, Ventana) alkalmaztuk a másodlagos detektáláshoz.
Az immunhisztokémiai festés mennyiségi meghatározása
A pozitív festősejtek arányainak számítását fénymikroszkóppal × 400-as nagyítással egyetlen kutató (KM) végezte vakos körülmények között. A megfigyelők közötti variabilitás értékeléséhez 40 diát választottunk ki véletlenszerűen, és egy második idősebb patológus (AK) újraszámolt, bemutatva a Ki67 + esetében 88% -os és a CD68 + sűrűség esetén a 80% -os egyezést.
A Ki67-pozitív festő sejtek arányát jól orientált kriptákban számoltuk (átlag/8. dia, 4–14 tartomány). A Ki67 proliferációs sebességet úgy határoztuk meg, hogy a Ki67 + sejtek számát elosztottuk a kriptasejtek teljes számával, és százalékban fejeztük ki. A különbségeket azonosnak találták a teljes kriptában és a felső kriptában; ennélfogva itt csak a teljes kriptarész arányról számolunk be.
Csak a CD3 + -ot festő intraepithelialis limfocitákat számoltuk meg legalább 300 hámsejt reprezentatív területén. Az intraepithelialis limfociták sűrűségét a CD3-pozitív limfociták 100 hámsejtenként számának indexeként fejeztük ki.
A lamina proprián belüli CD68-pozitív sejtek (makrofágok) számát 1-től 3-ig terjedő skálán számláltuk és osztályoztuk: 1. fokozat (nincs/ritka), 2. fokozat (szórt felületes gyűjtések) és 3. fokozat (erős, diffúz vagy sávos) -szerű infiltrátum a felületes lamina propriában), amint az a. 1c.
A széklet- és a vastagbélmikrobák és a különös érdeklődésű metabolitok célzott elemzése
Plazma aminosavak
Az éhomi vérkoncentrációkat az extrahált plazmában fordított fázisú C-18 előoszlopos derivatizációs HPLC-vel (AccQ · Tag Ultra derivatization, Waters, Milford, MA) mértük az előzőekben leírtak szerint. .
Statisztikai analízis
A folyamatos változók csoportbeli különbségeinek statisztikai elemzését az SPSS 16.0 (SPSS Inc.) alkalmazásával végeztük. A csoportkülönbségek jelentőségét a normálisan elosztott adatok esetében párosítatlan és párosított Student t-tesztekkel értékeltük. A nem parametrikus adatokat Mann - Whitney U -teszt vagy Kruskal - Wallis egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük a párosítatlan adatok rangsorai alapján, és a párosított adatok Wilcoxon aláírt rangú tesztjeivel. Az asszociáció jelentőségét Spearman rangkorrelációs tesztjével értékeltük. P 59, 60, 61, 62 szint, mivel lehetővé teszi a filotípusok mélyprofilozását nagy felbontásban, akár 98% -ig) 59 és jelentősen alacsonyabb költségekkel.
HITChip elemzés
Mikrobiális együttes előfordulású hálózati elemzés
A metabolom globális elemzése: minta előkészítése az NMR spektroszkópiai elemzéshez
Az összes vizeletmintát szobahőmérsékleten felolvasztottuk és 10 másodpercig vortexeltük. Összesen 400 μl vizeletmintát alaposan összekevertünk 250 μl 0,2 M nátrium-foszfát-pufferrel, amely 20% D 2 O-t tartalmaz, pH 7,4, 0,01% 3- (trimetil-szilil) - [2, 2, 3, 3-2H 4] propionsav-nátriumsó és 3 mM nátrium-azid (NaN3). Az elegyet először 10 000 g-vel 10 percig centrifugáltuk, és a felülúszó 600 μl-ét 5 mm külső átmérőjű NMR-csőbe helyeztük. Körülbelül 200 mg nedves székletmintát összekevertünk 600 μl H20-val (HPLC minőségű) 1,5 ml-es Eppendorf-csőben. Ezután egy 30 másodperces vortexelési ciklust, 5 perces ultrahangos kezelést 4 ° C-on és 30 másodperces vortexelést hajtottunk végre, majd 10 000 g-vel 10 percig centrifugáltuk. Összesen 400 μl felülúszót adunk egy 1,5 ml-es Eppendorf-csőbe, amely 250 μl fent említett nátrium-foszfát-puffert tartalmaz, vortexeljük és 10 000 g-on centrifugáljuk 10 percig. 600 μl felülúszót helyeztünk egy NMR-csőbe.
1H-NMR-spektroszkópia
A vizelet- és ürülékvíz-extraktum minták 1H-NMR-spektrumait Bruker 600 MHz-es spektrométerrel (Bruker, Rheinstetten, Németország) kaptuk, az 1 H frekvencián 600,13 MHz-en, 300 K hőmérsékleten. 90 ° - t 1 - 90 ° - tm - 90 ° - felvétel) és standard paramétereket alkalmaztunk standard egydimenziós 1H NMR spektrális adatok előállításához, Beckonert és mtsai. 67
Többváltozós statisztikai adatok elemzése
Metabolikus reakcióhálózat létrehozása
A szabadon hozzáférhető MetaboNetworks szoftver segítségével 19 olyan reakciót azonosítottak, amelyek spontán vagy emberi és/vagy baktériumok genomjához kapcsolódó enzimek révén fordulnak elő. Az adatbázis létrehozásakor a KEGG-ben felsorolt összes teljes genomszekvenciát, amely társítható volt a HITChip-en képviselt baktériumcsoportokhoz, bekerült az adatbázis létrehozásába, aminek eredményeként összesen 817 baktériumgenom került be az adatbázisba. Ezután a szoftvert arra használták, hogy a legrövidebb útvonalú metabolikus reakcióhálózatot felépítsék az összes (széklet és vizelet) metabolit között, amelyek a különböző étrendi összehasonlítások bármelyikében jelentősen eltérnek. Ebből a „globális hálózatból” két algráfot készítettek a két étrendi kapcsoló mindegyikéhez, szignifikánsan társított széklet metabolitok felhasználásával. A specifikus útvonalakhoz kapcsolódó metabolitok differenciális expressziójának kiemelésére a grafikonokhoz háttér-árnyékolást adtak, hogy jelezzék a különböző összekapcsolódó útvonalakat (5a - c. Ábra). Ezeknek a metabolitoknak a rövidítése és teljes neve megtalálható a 11. kiegészítő táblázatban.
További információ
PDF fájlok
További információ
Kiegészítő 1-6. Ábrák, Kiegészítő 1-11. Táblázatok, Kiegészítő vita, Kiegészítő módszerek és kiegészítő hivatkozások
Hozzászólások
Megjegyzés benyújtásával elfogadja az Általános Szerződési Feltételeinket és a közösségi irányelveket. Ha bármi sértőnek vagy összeegyeztethetetlennek tűnik a feltételeinkkel vagy irányelveinkkel, jelölje meg nem megfelelőként.