amur

  • elemeket
  • absztrakt
  • A fő
  • az eredmény
  • Genomgyűlés
  • Genom annotáció
  • Evolúciós elemzés
  • Potenciális nemmeghatározási mechanizmus
  • Az étkezési szokásokra való áttérés átírási elemzése
  • vita
  • mód
  • DNS-könyvtár előkészítése és szekvenálása.
  • Szekvencia összeállítás.
  • A géneket kódoló fehérjék előrejelzése.
  • Szekvenciák átírása.
  • A potenciális nemi kromoszómán elhelyezkedő férfi kontigkok azonosítása.
  • A minta előkészítése és a differenciálisan expresszált gének azonosítása FHT kísérletekben.
  • URL.
  • Hozzáférési kódok.
  • A változások története
  • növekményekkel
  • Elsődleges csatlakozások
  • Bioproject
  • Sorozatsor archívum
  • További információ
  • PDF fájlok
  • További szöveg és képek
  • Excel fájlok
  • 16. kiegészítő táblázat
  • 17. kiegészítő táblázat
  • 18. kiegészítő táblázat
  • Kiegészítő adatkészlet

elemeket

  • DNS szekvenálás
  • A cikk hibajavítását 2015. július 29-én tették közzé

Ez a cikk frissült

absztrakt

A amur fontos tenyésztett hal, amely a világ édesvízi akvakultúrájának ∼ 16% -át képviseli, és vegetáriánus étrendű. Itt bemutatjuk a nőgyógyászati ​​felnőtt nőstény 0,9 Gb-os, vadon élő felnőtt hím 1,07 Gb-os genomjának fogalmát. A genomi annotáció 27 263 génmodellt azonosított, amelyek a női genom fehérjéit kódolják. Összesen 114, 573 Mb-os állvány van rögzítve 24 kötőcsoportban. Becslések szerint az amur és a zebra közötti különbségek 49-54 millió évvel ezelőtt jelentkeztek. Meghatározzuk a ponty kromoszómafúzióját a zebra vonatkozásában, és rögzítjük az X és Y fű ponty kromoszómái közötti gyakori átmeneteket. Megállapítottuk, hogy a mevalonát útvonal transzkripciós aktiválása és a májban a szteroid bioszintézis összefüggésben van a amur húsevő és növényevő étrenddel történő adaptálásával. Úgy gondoljuk, hogy a pontyfű genomja kiinduló platform lehet a jobb minőségű halak genomi megközelítéssel történő tenyésztésére.

A fő

a ) Felnőtt ponty képe. b ) Frekvenciaelosztás 55 méter. A K -mer frekvencia eloszlását az olvasmányokban rövid betétmérettel (350 - 400 bp) rendelkező könyvtárakból származtattuk. A K-polimerek értékeit ábrázoljuk előfordulásuk gyakoriságával (y tengely) (x tengely). A legrosszabb csonka csúcs alacsony előfordulás esetén (1-2) elsősorban a kezdeti szekvenciák véletlenszerű alapvető hibáinak volt köszönhető. c ) 13 gerinces genom rekonstruált filogenitása. Az egyes ágak dN/dS arányát kék színnel jelöltük. A fekete számok megegyeznek a bootstrap támogatási értékeivel. A lámpát csoportként használják. Az elágazás hosszát a helyenként várható szubsztitúciókban mérjük. d ) Venn-diagram öt kiválasztott gerinces genom géncsoportjairól. Mindegyik szám az említett genomok által megosztott ortológiai géncsaládok számát jelenti.

Teljes méretű kép

  • Töltse le az Excel forrásadatait

az eredmény

Genomgyűlés

A gyepgenom 24 pár 18, 19 kromoszómából áll (2 n = 48). A teljes genomi sörétes szekvencia-szekvenálási stratégia elfogadása után körülbelül 132 Gb Illumina-szekvencia-szekvenciát hoztunk létre egy nőgyógyászati ​​felnőtt pontypázsit véréből izolált genomi DNS-en, és 136 Gb-ot olvasott le egy vad, vízzel befogott felnőtt hím (1. kiegészítő táblázat). és kiegészítő megjegyzés). A nőstény (0, 90-Gb) és a hím (1, 07-Gb) genomok végső készleteit egy módosított de novo Phusion-meta szerelőcső felhasználásával állítottuk össze, amint azt korábban leírtuk (20. kiegészítő ábra és 2. táblázat). A női tervezési genomot teljesen feljegyezték a genomi információimra (1. ábra), és az állvány rögzítésére használták a genetikai összekapcsolódási térképre, míg a férfi genomot használták fel a férfi és női genomok közötti szekvenciaváltozás kimutatására.

A női genom-összeállításnak olyan állványai voltak, amelyek N50-nél nagyobbak voltak, mint 6,4 Mb, és az együttesek 90% -a 301 állványból állt, amelyek mindegyike hosszabb, mint 179 kb (1. táblázat). A genom méretének becslése a K-mer frekvenciaeloszlás segítségével azt mutatta, hogy a női genom a fájlméretet tekintve körülbelül 891 Mb volt (1b ábra és Kiegészítő megjegyzés). A genomiális összeállítás pontosságát úgy értékeltük, hogy az állványokat 3027 publikált UniGene-hez igazítottuk az 5. és 11. BAC 21-et (2. és 3. kiegészítő ábra és 3. kiegészítő táblázat), jelezve, hogy az eredeti kontigák és állványok lefedettsége körülbelül 95% és 97 %, ill. A szekvenciahibák túlnyomórészt a rövid leolvasású összeállítás által bevezetett beillesztések vagy törlések következményei voltak (3a. Kiegészítő táblázat).

Asztal teljes méretben

Összesen 644 817 heterozigóta SNP-t és 66 101 rövid indelt (legfeljebb 10 nukleotid hosszúságú) azonosítottunk a női genomban. A férfi genomban 1 465 819 SNP-t és 166 867 rövid indolt azonosítottunk. A heterozigozitás becsült összfoka kb. 0, 9 és 2, 5 polimorfizmus volt kilobázisonként a női és férfi genomokban (4. kiegészítő táblázat). Nyilvánvaló, hogy a vad hím genom sokkal magasabb fokú heterozigozitással rendelkezett, ami bimodalitást okozott a K -mer frekvenciaeloszlásban (1b. Ábra) és rövidebb hosszúságot okozott az összeállított állványoknak.

Genom annotáció

Összesen 27 263 gént soroltunk fel, amely a női genom fehérjét kódolja. A génpredikció során felhasznált bizonyítékok között szerepelt 27 Gb RNS szekvenálási adat (RNS-szekvencia) 6 szövetből (embrió, máj, lép, agy, vese és fej vese), több mint 3000 ismert UniGene rekord, valamint a homológ zebrafish génekről szóló információ Ensembl) 67, 4. kiegészítő ábra, 5. kiegészítő táblázat és kiegészítő adatkészlet). A nem kódoló RNS gének (6. és 7. kiegészítő táblázat) és 467 783 egyedi szekvencia (kiegészítő táblázat) feljegyzésében 1538 tRNS-t, 24 rRNS-t, 207 kis mag-RNS-t (snoRNS-t), 136 kis mag-RNS-t (snRNS-t) és 444 mikroRNS. 8.) A de novo ismételt annotáció 38% -os teljes ismétlési tartalmat jelez, szemben a BAC 43% -ával (9. táblázat). Ez az arány kevesebb, mint a zebrafish 3-ban megfigyelt ismételt tartalom 52,2% -a. Ez a különbség a nyílt terekben és apró töredékeken elhelyezkedő ismétlődő szekvenciák kizárásának tudható be (3 .

A közzétett 4-es ponty 4 genetikai megkötési térkép felhasználásával 24 állítócsoportra rögzítettünk 114 állványt (2a. Ábra, 10. kiegészítő táblázat és kiegészítő megjegyzés), lefedve a női csoport 573 Mb (64%) 17,456-tal (64%). lokalizált annotált gének. A lehorgonyzott állványokon végzett génszintézis azt mutatta, hogy az amurkötő csoportok többségének kiterjedt kollinearitása volt a megfelelő zebrafish kromoszómákkal (2b. Ábra). A génillesztés magas szintézist mutatott az amur és a zebrafish esetében, és akár 24 018 amur gén (a teljes 27 263 gén 88% -a) helyezkedett el a szintetikus blokkokon (2c. Ábra). Bár ez az eredmény hasonló volt az előző 4 jelentéshez, két keresztkromoszóma elrendezést találtunk a 22. és 24. kötőcsoportok esetében. Figyelemre méltó, hogy a 24. kötőcsoport igazodik a 22. és 10. zebrafish kromoszómához, de más pontykötő csoporttal nem. Az amur kromoszómák FISH-elemzése azt mutatta, hogy a két amurjelző, amely a zebrafish 10. és 22. kromoszómájához igazodik, valóban egy 24. kötőcsoportba tartozik (2d. Ábra), ami megmagyarázza, miért van a 25. kromoszóma a zebrában, de a 24 a pontyban.

a ) Az állványokat egy közzétett konszenzus térképen 4 rögzítették. A kék vonalak jelzik az egyes linkerek (LG) hosszát, amelyekhez a címkéket hozzárendelik. A jelölők közötti térképtávolságokat a KosMC cM skála mutatja. A narancssárga oszlopok a lehorgonyzott állványokat képviselik. A jelölőket és állványokat összekötő fekete vonalak jelzik a jelölők helyét az állványokon. Az egyes állványok hosszát egy 5 Mb méretű oszlophoz viszonyítva mutatjuk be. b ) Szintetikus kapcsolat a zebra kromoszómák és az amurkötő csoportok között. A 22. kötőcsoport a 2. és 15. zebrafish kromoszómához, a 24. kötőcsoport pedig a 10. és 22. zebrafish kromoszómához igazodik. c ) A gének kollinearitása a zebrák és a pontyfű között. A zebrafish kromoszómákat kék blokkok képviselik (pl. DR01). A ponty állványai (hossza> 50 kb) narancssárga tömbökben vannak feltüntetve. Az összehangolt géneket zöld vonalak kötik össze. A kromoszómák és az állványok hosszát egy 10 Mb méretű oszlophoz viszonyítva mutatjuk be. d ) FISH linker vizsgálat 24. A sárga CID1435 marker a zebrafish 10. kromoszómájával egy vonalban helyezkedik el, a vörös CID0538 marker pedig a zebrafish 22. kromoszómájához igazodik. Méret, 5 μm.

Teljes méretű kép

  • Töltse le az Excel forrásadatait

Evolúciós elemzés

Az amur evolúciójának tanulmányozásához amur génmodelleket csoportosítottunk további 12 gerinces genom génjeivel, és a filogenetikai fa rekonstrukciójához 202 egyetlen, a különböző genomokban különböző megfeleltetésű gének másolatát használtuk (1c. Ábra és kiegészítő). Jegyzet). A Cyprinidae család egyik fajaként az amur volt a legszorosabb kapcsolatban a zebrákkal. A TimeTree 22 adatbázis szerint a zebrák és amurok közötti eltérések idejét 49-54 millió év körülire becsülik (11. kiegészítő táblázat). A kiválasztott teleostei genomok többsége hasonló szelekciós nyomást mutatott a számított dN/dS értékek szerint (a nem szinonim szubsztitúció és a szinonim szubsztitúció arányának aránya).

Minden gén részt vett a GCSD-ben vagy a ZSD-ben. Az útvonalakat a KEGG úti adatbázis keresésével határoztuk meg. Az x tengely mutatja az egyes utakban részt vevő gének számát. A kékkel jelölt utak kiemelik az anyagcsere folyamatokat, amelyek potenciálisan fontosak az étrend fejlesztése vagy adaptálása szempontjából.

Teljes méretű kép

  • Töltse le az Excel forrásadatait

Potenciális nemmeghatározási mechanizmus

A hím ponty és nőstény fű készleteinek összehasonlításakor 206 folytatást azonosítottunk, amelyek teljes hossza 2,38 Mb volt, amelyet felnőtt hím, de nem nőgyógyászati ​​nőstény hordozott (11. kiegészítő ábra, valamint 16. és 17. kiegészítő táblázat). Mindegyik folytatást PCR-alapú szekvenálással igazoltuk. Ezeket a régiókat PCR-rel is amplifikáltuk egy 24 hím és 24 nő kiterjesztett csoportjában, azonosítva a ponty X és Y kromoszómáinak gyakori kromoszóma keresztezését (12. ábra). A ponty nemét nem a teljes kromoszóma, hanem több kritikus gén határozhatja meg. Nyilvánvalóan azonosítottunk egy hím genom-specifikus szondát, amely az egyik folytatáshoz leképeződött (184. szonda a 12. kiegészítő ábrán). Nem találtunk e régió szekvenciaillesztését egyetlen más gerinces genommal sem, ami arra utal, hogy a ponty egyedülálló eredetű.

Az étkezési szokásokra való áttérés átírási elemzése

A pontyfű általában növényevő, ez a tulajdonság népszerűvé teszi őket. Hogy a amur hatékonyan felszívja a tápanyagokat a növényekből, hogy támogassa gyors növekedésüket, megválaszolatlan kutatási kérdés 37. Az amur akkor fejezi be a húsevő és a növényevő étrend közötti átmenetet, amikor a kikelés után körülbelül 1,5 hónappal eléri a 3–5,5 cm testhosszat. Elemeztük az RNS-szekvenciát. A belekből, a májból és az agyból származik a gén expressziójának változásainak jellemzésére a változás előtt és után (4a. Ábra és online módszerek). A differenciális expressziójú gének jelentősen gazdagodtak a bél cirkadián ritmusával összefüggő utakban, szteroid bioszintézissel, a terpenoid gerinc bioszintézissel és a máj glicerofoszfolipid anyagcseréjével (DAVID Bioinformatics Resources 38; P

a ) FHT kísérletek tervezése. A kikelés után 46 nappal azokból a halakból vettünk mintát, amelyek nem szenvedtek FHT-t (kironomid lárvákkal táplálva) "46 d" -t. A kikelés után 46 és 116 nap között a halakat két csoportra osztották - az egyiket kopoltyúval etették, a másikat továbbra is kironomid lárvákkal etették -, amelyeket a kikelés után 116 napnál "116 d - FHT" és "116 d" mintaként gyűjtöttek össze. ". ( b ) A mevalonát útvonal aktiválása és a szteroid bioszintézis. A kék és narancssárga nyilak különböző módon jelzik a reakció lépéseit. Az egyes téglalapokban lévő szám jelzi az enzimet, amely katalizálja az átvitelt. A vörös kódok jelentősen megnövekedett expressziójú enzimgéneket jeleznek, miután az FHT (q 45) szerepel a hisztogramokon. A vegyületek neve a megfelelő körök mellett látható.

Teljes méretű kép

  • Töltse le az Excel forrásadatait

Az étrend megváltoztatása után elengedhetetlen, hogy az amurok folyamatos táplálkozási ritmust tartsanak fenn, hogy elegendő tápanyaghoz jussanak étrendjükből. A máj RNS-seq adatainak elemzése a szteroid-mevalonát bioszintézis útjának jelentős aktiválódását azonosította a gerinc terpenoid bioszintézisében, ami az étrend változásának előtti 32-szer magasabb átlagos expressziós szintben tükröződik (q érték 39 40, 41) . hogy a bolhabogarakkal táplált amurok testhossza, bélhossza, testtömege és bélhossza/testhossza sebessége szempontjából lényegesen nagyobb növekedésű, mint a kironomid lárvákkal táplált káposzta (áthaladás előtti halak és áthaladás nélküli halak) (adatok nem látható) Ezen utak metabolikus adaptációja nyilvánvalóan elősegíti a növényi eredetű tápanyagok hatékony felhasználását a pontyokban.

Ezenkívül egy korábbi jelentés szerint a növényi eredetű étrenddel táplált amurok több időt töltenek az etetéssel 37. Megfigyeltük azt is, hogy a növényi táplálékot kapott amur szinte folyamatosan táplálkozott a 24 órás periódus alatt. A transzkriptómadatok elemzése azt mutatta, hogy a cirkadián ritmus útjában részt vevő gének aktiválódtak az ételtovábbítás (FHT) után, amely magában foglalta az óra heterodimert - bmal1, valamint a ror és az óra géneket (kiegészítő 15a. Ábra). A rokon gének nagy hasonlóságot mutatnak a zebrafish génekkel (például a rorca 42 és a clocka 43 génekkel), kivéve a különböző elemeket hordozó gének néhány promoter régióját (15b. Kiegészítő ábra). Bár a cirkadián ritmusban szerepet játszó gének és a folyamatos táplálkozás közötti kapcsolat nem egyértelmű, ez a megállapítás arra utalhat, hogy az etetés gyakoriságát a ponty étrendjének változásakor kell megvizsgálni.

Megvizsgáltuk a potenciális bél mikrobiotikumok nem amur pontyolvasásait az összes RNS-szekvenciájú bélolvasás eltávolításával, amellyel összehangolva (kiegészítő 20. és 21. táblázat és kiegészítő megjegyzés). Ez az elemzés nem azonosított egyetlen olyan gént sem, amely a bélben lévő cellulóz emésztését feltételező enzimeket kódolja, ami arra utal, hogy az amur bél nem emésztheti meg és nem tudja felszívni a cellulózt, megerősítve azt a gondolatot, hogy a cellulóz vizes adalékanyagként fejlődhet az amur növekedésének elősegítésére. 44. Valószínű azonban, hogy a bél-bióta szekvenálása erősebb lesz annak megértésében, hogy az amur emészti-e meg a növényi anyagokat.

vita

Két amurgenom-készletet hoztunk létre, hím és teljesen jegyzetelt nőstény. Nagyszámú génmodell összehasonlítása és szintéziselemzés azt mutatta, hogy a zebrafish és amur hasonló genomelőzményekkel rendelkezik. Azonban a kromoszóma-fúzió, amely a 24. kötőcsoportot és a GCSD előfordulását eredményezi, felelős lehet az amur és a zebrák fejlettségében (pl. Testmérete) és egyéb jellemzőiben (pl. Nemi meghatározása). Az étrendi változásokkal kapcsolatos átírások jellemzése új genomikai információkat szolgáltatott a ponty metabolikus adaptációjáról a vegetáriánus étrendre való áttérés során annak élete során. Ezek a genomi szekvenciák az amurok szaporodását is előidézik a genomi fázisban.

mód

DNS-könyvtár előkészítése és szekvenálása.

Genomikus DNS-t izoláltak a nőgyógyászati ​​felnőtt kifejlett pontyok és a vadon élő, fogságban élő felnőtt pontyfű vérsejtjeiből a DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) segítségével. A amplifikáció nélküli 46. megközelítést alkalmaztuk szekvencia könyvtárak előállítására, rövid, 350-450 bp beépítéssel, a párosított leolvasásokhoz az Illumina gyártói protokollja szerint. A Mate-Pair Library v2 minta-előkészítési kézikönyv (Illumina) és a párosított végződés protokolljaival 1, 3, 5 és 8-10 kb méretű betéteket tartalmazó könyvtárakat állíthatunk össze párosított olvasmányokhoz (16. ábra). A könyvtár előkészítési kézikönyvet (Roche) egyesítettük. A nyers adatokat az Illumina HiSeq 2000 szekvenszer és az Illumina Genome Analyzer IIx szekvenszer készítette.

Szekvencia összeállítás.

A rövid értékek összeállításához egy de novo összeszerelő csővezetéket fejlesztettek ki (1. kiegészítő ábra), amely a Phusion-meta módszer módosított változata volt, amint azt korábban említettük 20. Röviden, amikor párosított végeket olvastunk a tíz vagy több egyedi K-polimert tartalmazó gyenge olvasmányok kiküszöbölésére, ezeket több ezer csoportba csoportosítottuk a Phusion2 alkalmazásával, a K -mer 51 bp-ra állítva. Az egyes klaszterekbe csoportosított leolvasásokat párhuzamosan, az ABYSS 47, a fermi 48 és a SOAPdenovo 49 kontigumokba rendeztük. Ezeket a folytatásokat összevonták, hogy létrehozzanak egy kezdeti tervtervet. Konszenzusos eredményeket kaptunk úgy, hogy az összes olvasatot visszahangoltuk a tervezethez, a GAP5 összeállítás-kezelő eszközzel (50. hivatkozás). Ezután az olvasott pár párokat hierarchikusan és iteratív módon összekötöttük a folytonosságokkal, hogy előzetes SOAPden állványokat építsenek (K -mer 61 bp-ra állítva). A végső állványozást a Spinner segítségével hajtottuk végre.

A géneket kódoló fehérjék előrejelzése.

Szekvenciák átírása.

Hat szövetet (embrió, máj, lép, agy, vese és fej) gyűjtöttünk felnőtt férfiaktól, és az így kapott adatokat felhasználtuk a gének modellezésére. Ezeket a mintákat, valamint az FHT kísérletekből származó mintákat RNS izolálásnak vetettük alá SV TRIzol reagens (Invitrogen) alkalmazásával. A poli (A) + mRNS-t DynaBeads mRNS tisztító készlet segítségével (Life Technologies) tisztítottuk. A párosított cDNS könyvtárakat a Seq NGS RNS RNS teljes könyvtár könyvtár előkészítő készlet (Gnomegen) felhasználásával készítettük. A kapott párosított cDNS könyvtárakat Illumina HiSeq 2000 rendszer segítségével szekvenáltuk.

A potenciális nemi kromoszómán elhelyezkedő férfi kontigkok azonosítása.

A hím folytatásokat (hossza> 500 bp) egyeztettük a női folytatásokkal (hossz> 500 bp) egy alapértelmezett paraméterekkel rendelkező MUMmer 53 alignerrel. Ezután az egyes hím contig nőkkel való lefedettségét 95% -nál nagyobb azonossági küszöbérték alkalmazásával becsültük meg, és a megkülönböztetett expresszió digitális megméréséhez annotált lókuszokon 54-et igényeltünk, ha az igazított régióban az egyenlőtlen rések hosszúak. Amikor a gén expressziója a 116 d - FHT májban több mint kétszeresére nőtt vagy csökkent (q értéke 39