elemeket
absztrakt
Az inak sűrű kötőszövetek, főként I. típusú kollagénből állnak, amelyek erőket továbbítanak az izom és a csont között, és amelyek a mozgásszervi szerkezethez szükségesek.
A II. Típusú diabetes mellitus (T2DM) olyan metabolikus betegség, amelyet hiperglikémia és csökkent inzulinérzékenység jellemez 1, és szorosan összefügg az elhízással 2. Bár nehéz elszakítani a II. Típusú cukorbetegség szisztémás hatásait az elhízástól, nyilvánvaló, hogy az elhízás/T2DM indukciója az anyagcsere-funkció súlyos megváltozásához vezet, amely különböző patológiás változásokhoz vezet az egész testben 3 .
Jelenleg nagyon keveset tudunk a diabéteszes tendinopathia hátterében álló sejtes és molekuláris mechanizmusokról, bár a kóros változások a T2DM 6 időtartamának függvényében növekednek. Ennek a tudásbeli hiányosságnak a kezeléséhez az étrend okozta elhízás és a II. Típusú cukorbetegség egérmodelljét 14 használtuk annak a hipotézisnek a tesztelésére, hogy az elhízott/diabéteszes egerekben a hajlító inak progresszívek lesznek, az ínízület működésének kóros változásai és a mechanikai tulajdonságok. Megvizsgáltuk a normális metabolikus funkció gyógyulásra gyakorolt hatását is, mint a diabéteszes tendinopathia megfordításának vagy leállításának lehetséges eszközét. Végül az elhízott/T2DM inakban megfigyelt inzulinérzékenység csökkenése miatt ínspecifikus inzulinreceptorokat (IR) állítottunk elő knockout egerekben, hogy meghatározzuk, elegendő-e az ín IR-deléciója a diabéteszes tendinopathia fenotípusának összegzéséhez.
az eredmény
A HFD elhízást és II. Típusú cukorbetegséget vált ki egerekben
A HFD egerek testtömege szignifikánsan növekedett az LFD-hez és a HFD-LFD-hez képest (24 hét - LFD: 33, 75 g ± 2, 27, HFD: 49, 05 g ± 2, 24; HFD-LFD: 28, 8 g ± 7,03, p 
A T2DM/elhízás megváltoztatja az inak működését és mechanikai tulajdonságait. ( A ) A metacarfalangealis (MTP) ízület ízületeinek hajlítási szögének mérése, ( B ) Csúszó ellenállás, ( C ) Maximális meghibásodási terhelés és ( D ) FDL ínmerevség az LFD, HFD és HFD-LFD inakban a diéta kezdete után 12 és 48 hét között. * Jelzi p
A T2DM/elhízás megváltoztatja a kollagénszálak átmérőjét. ( A ) Az FDL-ín TEM axiális képei LFD, HFD és HFD-LFD egerekből 40 héttel a diéta kezdete után. A HFD inakban található lipidlerakódásokat fekete nyilak jelzik. A skála 5 mikronot képvisel 3500x-os nagyítási képen és 0,5 mikron 40 000-szeres nagyítású képeken. ( B ) A hisztogramok kollagén fibril átmérővel mutatják a medián fibril átmérő csökkenését a HFD és HFD-LFD inakban az LFD-hez képest. ( C ) A kollagén fibril átmérőjének megoszlása olyan box plot fúziókkal, amelyek átfedik az adatokat az 5. és a 95. percentilis között. Az ezen a tartományon kívüli adatokat egyedi pontként ábrázoljuk. ( D ) A kollagén fibril sűrűsége. * P15-et jelöl. Megvizsgáltuk az inzulinreceptor (IR) aktiválásának változását primer tenocitákban, elhízott/T2DM és nem diabéteszes egér inakban. Az elsődleges tenociták az IR jelátvitel robusztus aktiválását mutatják, amit a vivőanyaggal kezelt tenocitákhoz képest megnövekedett β-Akt expresszió jelez (4A. Ábra). Az inzulinstimulációt követően az LFD egerek inai erőteljesen indukálták a β-Akt expressziót, jelezve az IR jelátvitel aktiválódását. Ezzel szemben a p-Akt indukciót tompították a HFD inak (4B. Ábra).
Az inzulin receptor expressziója és a jelátvitel megváltozik a diabéteszes inakban. ( A ) A nem diabéteszes egér inakból izolált primer tenociták a p-Akt erős expresszióját mutatják a vivőanyaggal kezelt tenocitákhoz képest, ami azt jelzi, hogy tenocitákban aktiválódik az IR jelátvitel. ( B ) A HFD és LFD egerek inait inzulinnal vagy vivőanyaggal (0,5% BSA PBS-ben) stimuláltuk. Az IR jelzés aktiválódását figyelték meg az LFD inakban a β-Akt fokozott expressziója miatt. Ezzel szemben az inzulinnal stimulált HFD inakban nem tapasztaltak növekedést a β-Akt expresszióban a vivőanyag-kezeléshez képest, ami a HFD inak zsibbadt inzulinérzékenységét jelzi. A blotokat megvizsgáltuk a β-Akt-ra, és a membrán leválasztása után ugyanazokat a blotokat vizsgáltuk a teljes Akt-ra. A teljes hosszúságú blokkokat az 1. kiegészítő ábra mutatja.
Teljes méretű kép
Az S100a4-Cre az inzulin receptor expressziójának csökkenését eredményezi az ínben
Az elhízott/T2DM egér inak inzulinérzékenységének csökkenése és az emberi T2DM inak IRp expressziójának növekedése miatt megvizsgáltuk az IRp deléciójának hatásait az inakban S100a4-Cre alkalmazásával. Annak bemutatása, hogy az S100a4-Cre hatékonyan megcélozza a rezidens tenocitákat, az S100a4-Cre +; Ai9 riporter egereket használtunk. Az A19 fluoreszcencia expresszióját szinte minden rezidens tenocitában megfigyelték (5A. Ábra). Ezenkívül a Western blot elemzések az IRp expresszió csökkenését mutatták az S100a4-Cre + -ban; IR F/F egerek (IRcKO S100a4), összehasonlítva a standard (WT) testvérekkel (5B. Ábra). A WT és az IRcKO S100a4 egerek között nem figyeltek meg változásokat a testzsír százalékban (5C. Ábra), a testtömegben (5D. Ábra) vagy az éhomi vércukorszintben (5E. Ábra). A glükóz tolerancia átmeneti növekedését figyelték meg az IRcKO S100a4 egerekben 30 perccel a glükóz bolus beadása után, de 15, 60 vagy 120 perc elteltével nem figyeltek meg különbséget a glükóz toleranciában (5. F ábra). A görbe alatti terület jelentős, 23% -os csökkenését figyelték meg az IRcKO S100a4 egerekben a glükóz tolerancia teszt során (5G. Ábra). Így az IRcKO S100a4 lehetővé teszi az IRP leütésének specifikus hatásainak vizsgálatát elhízástól független ín/T2DM esetén.
Az IRp törlése az S100a4 sejtekben nem okoz elhízást vagy T2DM-et. ( A ) Az inakban az S100a4-Cre rekombináció hatékonyságát az A19 riporter segítségével szemléltettük, és az inakban hatékony rekombinációt mutattunk ki. ( B Az IRcKO S100a4 csökkenti az IRp fehérje expresszióját az ínben, a WT-vel összehasonlítva. A teljes hosszúságú blokkokat a 2. kiegészítő ábra mutatja. ( C - E ) A WT és az IRcKO S100a4 egerek között nem tapasztaltak testtömeg-változást ( C ), D ) a testzsír vagy a vér százalékos aránya ( E ) éhomi vérben 48 hét után. Kor. ( F - G ) Az IRcKOS100a4 hatékonyabban helyreállította a vérszintet a glükóz tolerancia teszt során ( F ) és a görbe alatti terület számszerűsítésével számítva a glükóz tolerancia teszt alapján ( G ).
Teljes méretű kép
Az inzulinreceptor deléciója az S100a4-line sejtekben nem vált ki diabéteszes tendinopathiát
Az IRcKO S100a4 inaknál az MTP hajlítási szöge szignifikánsan megnőtt (49, 87 ° ± 1, 79, p = 0,02) 48 hét után a WT-hez (42, 37 ° ± 2, 16) képest (6A. Ábra). A csúszási ellenállás változását nem figyelték meg a WT és az IRcKO S100a4 között (WT: 19, 02 ± 2; 1; IRcKO S100a4: 17, 73 ± 1, 87, p> 0,05) (6B. Ábra). A maximális meghibásodás és merevség terhelés nem különbözött szignifikánsan az IRcKO S100a4 és a WT inak között (Max. Terhelés: WT: 5, 92 N ± 0, 74, IRcKO S100a4: 6, 9 N ± 0, 7, p = 0, 36) (6C. Ábra, D). Ezenkívül a TEM elemzések azt mutatják, hogy az S100a4 sejtekben az IRp veszteség nem változtatta meg a kollagén fibril átmérő eloszlását (medián WT: 188, 63; medián IRCKO S100a4: 193, 32, p = 0,21) (6E-G ábra) vagy sűrűségű fibrillákat (6H. Ábra) (p = 0, 82) 48 hetes korban.
Az IRp törlése az S100a4-lineáris sejtekben nem zavarja a csúszó ín működését, mechanikai tulajdonságait vagy a kollagén szerveződését. ( A ) MTP ROM, ( B ) Csúszásállóság, ( C ) Max. Hiba terhelés és ( D ) A merevséget 48 hetes korban értékelték a WT és IRcKO S100a4 inakban. * 48 hetes korban p S100a4-et jelez. ( F ) A WT és az IRcKO S100a4 inak között nem figyeltünk meg változásokat a kollagén fibril átmérőjében. ( G ) A kollagén fibril átmérőjének megoszlása az 5. és a 95. percentilis közötti adatokat tartalmazó box-diagram fúziókkal. Az ezen a tartományon kívüli adatokat egyedi pontként ábrázoljuk. ( H ) WT és IRcKO S100a4 egér inak TEM képeinek kollagén fibrill denzitása 48 hetes korban.
Teljes méretű kép
vita
Az ín és a ROM mechanikai tulajdonságai az ECM 20 kollagénszervezettől függenek. A HFD és HFD-LFD egerek inainak mechanikai tulajdonságainak csökkenése miatt megvizsgáltuk a kollagén szervezet és a fibril átmérő változását. A TEM szignifikáns változásokat mutatott a kollagén fibril átmérőjének megoszlásában a HFD és HFD-LFD inakban az LFD-vel összehasonlítva. A fibrill méretének ezek a megfigyelt változásai befolyásolhatják a sikló ín működését, és megváltozott kollagén fibril architektúrát sugallhatnak az ínfunkció károsodásának mechanizmusaként diabéteszes tendinopathiában. Ennek megfelelően klinikailag megfigyelhető az ín térfogatának növekedése a II. Típusú cukorbetegségben szenvedő betegeknél 21, ami arra utal, hogy a kollagén tömörségének elvesztése zavarhatja a normális csúszó funkciót, ami az ínfunkció és a mozgástartomány csökkenéséhez vezet.
Röviden: az elhízás/T2DM elegendő ahhoz, hogy visszafordíthatatlan kaszkádot indukáljon a hajlító ín kóros elváltozásaiban, beleértve az ECM szervezettségének megváltozását, ami végső soron csökkent mechanikai tulajdonságokhoz és az ín ROM-hoz vezet. Ezenkívül az IRp törlése az S100a4-line sejtekben nem változtatja meg az ECM ínszervezését vagy az ín funkcióját. Tekintettel arra, hogy az elhízott/T2DM inakban csökkent inzulinérzékenység figyelhető meg, fontos lesz az IRp szerepének további vizsgálata más sejtpopulációkban. Végül a metabolikus diszfunkció differenciálása nem volt elegendő az ínbetegség előrehaladásának megakadályozásához, ami arra utal, hogy az ínspecifikus sejtek megértése és az elhízásra/T2DM-re adott molekuláris válasz döntő fontosságú lesz a diabéteszes tendinopathia sikeres kezeléséhez és kezeléséhez.
mód
Állatetika
Ezt a vizsgálatot szigorúan az Országos Egészségügyi Intézet laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó kézikönyvének ajánlásaival összhangban végezték el. Az összes állatkísérletet a Rochesteri Egyetem Állatkutatási Egyetemi Bizottsága (UCAR) hagyta jóvá (UCAR-szám: 2014-004).
Az étrend okozta elhízás és a II. Típusú cukorbetegség
A hím C57B1/6J egereket (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) ötfős csoportokban tartottuk 12 órás világos/sötét cikluson. Négy hét elteltével az egereket legfeljebb 48 hétig alacsony zsírtartalmú étrendre (LFD; 10% Kcal, Research Diets # 12450 J) vagy magas zsírtartalmú étrendre (HFD; 60% Kcal, Research Diets # D12492) helyezték. Az egerek harmadik kohorszát (HFD-LFD) 12 hétig HFD-re helyeztük, majd az áldozatig LFD-re változtattuk (1A. Ábra). Az egereket a diéta kezdete után 12, 24, 40 és 48 héttel feláldoztuk szén-dioxid belégzésével és a méhnyak elmozdulásával.
Az inzulinreceptorok közvetítették az egerek delécióját
A nemesség IRp-veszteségének szabályozására az IRp phlox/flox-ot (# 6955, Jackson Laboratories) 29 kereszteztük S100a4-Cre egerekkel (# 12641, Jackson Laboratories), így IRcKO S100a4 egereket kaptunk. gyártott ko-; IRp flox/flox testvéreket használtunk vad típusú (WT) kontrollként. Az ín hatékony célzásának megerősítése érdekében az S100a4-Cre egereket kereszteztük Ai9 riporter egerekkel (# 7909, Jackson Laboratories) 30, ami tdTomato fluoreszcenciát eredményezett a Cre által közvetített rekombináció után. Az egereket 48 hetes korukban feláldoztuk.
Az éhomi glükóz mérése
A diéta kezdete után 12, 24, 40 és 48 héttel az egereket (étrendenként n = 6 idõpontonként) öt órán át éheztettük 31, lemértük, és az éhomi vércukorszintet OneTouch2 vércukorszintmérõvel mértük. (LifeScan Inc., Milpitas, Kalifornia). Az éhomi vércukorszintet 48 hetes korban mértük IRcKO S100a4 és WT egerekben (n = 6 genotípusonként).
Glükóz tolerancia teszt
A glükóz tolerancia meghatározásához 20 héttel a diéta kezdete után az LFD, HFD és HFD-LFD egerek (étrendenként n = 6) 10 óra/g bolusban 20% glükózt kaptak PBS-ben, gyorsan intraperitoneális injekcióval, öt óra elteltével. A vércukorszintet a glükóz bolus után 15, 30, 60 és 120 perccel mértük. A glükóz toleranciát 48 hetes korban értékeltük IRcKO S100a4 és WT egerekben.
Testzsír értékelése
A diéta kezdete után 12 és 48 héttel (48 hetes életkor IRcKO S100a4 és WT egereknél) a testzsír százalékát PIXImus kettős energiájú röntgenabszorberrel (DXA) mértük (GE Lunar PIXImus, GE Healthcare, WI ). ).
A vitorla működésének értékelése
Feláldozás után a hátsó végtagokat csúszáshoz és biomechanikai vizsgálatokhoz gyűjtöttük a diéta kezdete után 12, 24, 40 és 48 héttel (étrendenként és időpontonként n = 6-10). Az IRcKO S100a4 és a WT egereket 48 hetes korban gyűjtöttük (n = 8-10). Az FDL-inat a myotendinous csomópontból izoláltuk a tarsal herpesz alagútba, az ínt a számjegyeken keresztül érintetlenül hagyva. Az ina proximális végét két szalagdarab közé rögzítettük cianoakrilát alkalmazásával. A sípcsontot a saját fogása biztosította, és az FDL proximális végét inkrementálisan töltöttük 0 és 19 g között. Az egyes súlyok felvétele után képet készítettünk a metatarsophalangal (MTP) ízületének hajlításáról, és ImageJ (//imagej.net) segítségével megmértük. Ezen ábrák felhasználásával az MTP hajlítási szöget kiszámítjuk az MTP hajlítási szög különbségének a terheletlen (0 g) és 19 g között. A csúszási ellenállást úgy számoltuk, hogy az eltérítési adatokat egyfázisú exponenciális egyenletbe helyeztük. Nemlineáris regressziót alkalmaztunk a csúszási ellenállás meghatározására 32 .
Szakító biomechanikai vizsgálat
A csúszó funkció tesztelése után az FDL-t kiengedték a tarsal alagútból, és a sípcsontot eltávolították. Az FDL proximális végét és a számokat az Instron műszerben (Instron 8841 DynaMight axiális szervohidraulikus tesztrendszer, Instron Corporation, Norwood, MA) egymással ellentétes fogantyúkban tartottuk. Az ín feszültség alatt 30 mm/perc sebességgel elmozdult a meghibásodásig. A merevséget és a legnagyobb meghibásodási terhelést az erő elmozdulás görbéből számoltuk.
Transzmissziós elektronmikroszkópia
Az FDL-inakat izoláltuk (n = 3 diétánként vagy genotípusonként) és glutáraldehid-nátrium-kakodilát-fixálóval rögzítettük. Egy mikronos tengelymetszetet kivágtunk és toluidinkékkel festettünk. Ezután egy mikronos metszetet 70 nm-re vágtunk, és uranil-acetáttal és ólom-citráttal festettük. A metszeteket egy Hitachi 7650 Analytical TEM képalkotó rácsokra helyezték. Nyolc-tizenkét nem átfedő képet készítettünk az egyes inak középső anyagából 15 000x és 40 000x nagyítással. A szálak átmérőjének méréséhez minden képen meghatároztunk egy érdekes területet (ROI), így minimum 80 fibrillát lehetett mérni. Az átlagokat az y tengely mentén mértük. A kollagén sűrűséget 2340 x 1860 pixel területen mértük. A kollagén fibril sűrűségének és átmérőjének mérését ImageJ alkalmazásával végeztük.
Az inzulin receptor expressziója és jelátvitele
Az elsődleges tenocitákat C57B1/6 J egerekből izoláltuk, és a 3. passzázsig használtuk. A teljes FT-ket izoláltuk a HFD és LFD táplált egerekből 48 héttel a diéta kezdete után (n = 3 csoportonként). A tenocitákat és az inakat vagy vivőanyaggal (0,5% BSA PBS-ben), vagy 1 nM inzulinnal stimuláltuk 15 percig, majd protein izolálást végeztünk a Western blot elemzésekhez. Blotokat vizsgáltunk a foszfo-AKT Ser473 (1: 1000, Cell Signaling, # 4060) és az összes AKT (1: 1000, Cell Signaling, # 9272 S) 33 esetében, és SuperSignal West Pico vagy Femto kemilumineszcens szubsztráttal fejlesztettük ki, és a GelDocXR-en jelenítettük meg. (BioRad, Hercules, Kalifornia). Az IRp expresszió változásainak értékeléséhez IRcKO S100a4 egerekben a teljes fehérjét WT és IRcKO S100a4 inakból extraháltuk (n = 3 genotípusonként) a Western blot elemzésekhez. A blotokat IRp-vel (1: 300, Santa Cruz, # sc-20739) 34 és β-aktinnal (1: 2500, Sigma Aldrich, # A2228) 35 vizsgáltuk, és SuperSignal West Pico vagy Femto kemilumineszcens szubsztráttal fejlesztettük ki, és a GelDocXR-en ( BioRad, Hercules, Kalifornia).
Statisztikai elemzések
Elhízás/T2DM vizsgálatokban a testsúlyt, a vércukorszintet, a biomechanikai és csúszó adatokat kétirányú varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük, majd Bonferroni-féle többszörös összehasonlítást végeztünk a = 0,05-ös szignifikanciával. egyirányú ANOVA Bonferronival post-hoc többszörös összehasonlításokkal. A WT és az IRcKO S100a4 közötti statisztikai különbségeket párosítatlan t-tesztek segítségével határoztuk meg. Az összes adatot a Prism GraphPad 7.0 statisztikai szoftverrel elemeztük. Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be.
Az adatok elérhetősége
Ez a cikk a tanulmány során keletkezett vagy elemzett összes adatot tartalmazza.
köszönöm
Ezúton szeretnénk köszönetet mondani a mag szövettani, biokémiai és molekuláris képalkotásának (HBMI), valamint a mag biomechanikájának, biomaterialjainak és a sejt multimodális szöveti képalkotásának (BBMTI) a Musculoskeletal Research Center, a Multiphoton Imaging Core és az Electron Microscopy Core at University of University Rochester Medical. Műszaki segítségnyújtási központ. Ezt a munkát az NIH/NIAMS K01AR068386 (AEL), P30 AR061307 Pilot (AEL), R01 AR073169 (AEL), R01 AR070765 (MRB) és a Rochesteri Egyetemi Kutatási Díj (AEL & MRB) támogatásával támogatta. A KM-et a 3T32 AR053459-10S1 támogatta. A szövettani, biokémiai és molekuláris képalkotás (HBMI) magját és a biomechanikai, biomateriális és multimodális szöveti képalkotó (BBMTI) magot részben a P30 AR069655 támogatja. A tartalom kizárólag a szerzők felelőssége, és nem feltétlenül képviseli a Nemzeti Egészségügyi Intézet hivatalos nézeteit.
Elektronikus kiegészítő anyag
További információ
Hozzászólások
Megjegyzés beküldésével vállalja, hogy betartja Általános Szerződési Feltételeinket és közösségi irányelveinket. Ha ezt sértő cselekedetnek találja, amely nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.