immun

  • elemeket
  • absztrakt
  • célok:
  • Tantárgyak és módszerek:
  • az eredmények:
  • következtetés:
  • bevezetés
  • Tantárgyak és módszerek
  • elemeket
  • Sejt- vagy zsírkultúra
  • RNS extrakció és kvantitatív valós idejű PCR (RTQ-PCR)
  • A táptalaj ApN-koncentrációjának meghatározása RIA-val
  • cAMP immunvizsgálat
  • Western blot
  • Az eredmények bemutatása és statisztikai elemzés
  • az eredmény
  • A CB1R blokád hatása az adipokin gén expressziójára tenyésztett explantánsokban
  • A CB1R blokád hatása az érett adipociták és az SVC adipokinekre
  • Az ApN ES szabályozásában résztvevő mechanizmusok
  • vita

elemeket

  • Génszabályozás
  • Elhízottság
  • Peptid hormonok

absztrakt

célok:

(1) Annak megvizsgálása, hogy az 1-es típusú kannabinoid receptor (CB1R) modulációja szabályozza-e közvetlenül az adiponektin (ApN) és más adipokinek termelését elhízott egyének omentális zsírszövetében (OAT) (2) annak meghatározása, hogy az OAT melyik frakciójában a blokádhatások a CB1R és (3) során jelentkeznek az alapvető mechanizmusok feltárására.

Tantárgyak és módszerek:

Az OAT-t 30 elhízott egyéntől kaptuk (testtömeg-index: 40, 6 ± 1, 3 kg m-2), akik hasi műtéten estek át. Explanánsok vagy frissen izolált adipociták vagy stromális vaszkuláris sejtek (SVC) elsődleges tenyészeteit használtuk.

az eredmények:

Az OAT magyarázataiban a CB1R blokkoló Rimonabant szabályozta az ApN génexpressziót. Az inzulin-szenzibilizáló tulajdonságokkal rendelkező omentin mRNS szintje szintén emelkedett. Ezzel szemben két gyulladásgátló citokin, a makrofág gyulladásos fehérje (MIP) -1β és az interleukin (IL) -7 mRNS-szintje csökkent. Tovább kutattuk, hogy ezek a hatások hol jelentkeztek az OAT-on belül. A CB1R expresszió mindkét sejtfrakcióban hasonló volt. Elszigetelt érett adipocitákban a CB1R blokád blokkolta az ApN mRNS növekedését és az IL-7 mRNS csökkenését, miközben az ApN szekréciójának növekedését indukálta a táptalajba. Az izolált SVC-ben az omentin gén expressziója, amely erre a frakcióra korlátozódik, növekedett, míg a MIP-1β expresszió csökkent. Végül megfejtettük azokat a mechanizmusokat, amelyek az ApN endokannabinoid rendszer (ES) általi szabályozásához vezetnek. Először azt tapasztaltuk, hogy az ApN-szabályozást valójában a CB1R közvetítette: az ApN-génexpressziót Rimonabant szabályozta, és a CB1R agonista arachidonil-2-klór-etilamid (ACEA) szabályozta. A cAMP termelés gátlása nem változtatta meg az ApN Rimonabant általi szabályozását. Az ApN ACEA általi csökkentését azonban teljesen megfordította a p38 mitogén-aktivált protein-kináz inhibitor (p38MAPK), és az ACEA fokozta a p38MAPK foszforilációját.

következtetés:

A CB1R blokád enyhíti a gyulladásos állapotot az OAT mindkét sejtfrakciójában az ApN és az omentin termelésének növelésével vagy a MIP-1β és IL-7 mRNS csökkentésével. Az ApN EK-szabályozása részben magában foglalja a p38MAPK-t.

Az elhízást lokálisan a zsírszövet gyulladása és az adipokintermelés diszregulációja okozza, a káros szabályozó peptidek túlzott szekréciójával és a védekező peptidek, például az adiponektin (ApN) hiposzekréciójával. 1, 2 Az ilyen diszreguláció egy alacsony fokú szisztémás gyulladásgátló állapot kialakulását váltja ki, amelyről úgy tekintenek, hogy közös teret épít az elhízás társbetegségei és a metabolikus szindróma kialakulásához. 1, 3, 4 Ennél a kedvezőtlen egészségügyi profilnál a központi zsír helyett a bőr alatti zsír preferenciális felhalmozódása tűnik erősebb kockázati tényezőnek. 1

Az endokannabinoid rendszer (ES), amely az 1-es típusú kannabinoid receptorokból (CB1R) és az endogén lipidekből származó ligandumokból áll, modulálja az energia homeosztázisát központi szerven vagy exigenikus hatásokon és perifériás metabolikus hatásokon keresztül számos szerven, beleértve a zsírszövetet is, ahol az energiatárolás fokozott. 5, 6 Az elhízott egyéneknél az endokannabinoidok szintje magasabb a zsigeri zsírban és a szérumban, mint a sovány kontrollokban 7, 8, és emellett az endokannabinoidok szintje a zsigeri zsírban magasabb, mint a szubkután zsírban. 9 Az EK erős aktiválása tehát a központi elhízáshoz vezető vagy ahhoz kapcsolódó mozgatórugónak tekinthető. 10.

Az elhízott betegek kezelése a szelektív CB1R blokkoló Rimonabant-nal elősegítette a testtömeg és a derékkörfogat jelentős csökkenését (a hasi zsírosság mutatója), valamint javította a kardiovaszkuláris és metabolikus kockázati tényezőket. 11 Ezek a javulások némelyikét a keringő ApN-szint növekedésének tulajdonítják. Ez a növekedés részben független volt a fogyástól, és a zsírszövet funkciójának specifikus javulását javasolta. 12.

Ennek a megfigyelésnek megfelelően a rimonabant fokozta az ApN expressziót az in vivo kezelt rágcsálók zsírszövetében, valamint az egér 3T3-F442A adipocita vonalában in vitro. Azonban a kannabinoidok perifériás hatásait kevéssé vizsgálták az emberi zsírszövetben. Számos jelentés vitatott adatokat szolgáltatott az emberi zsírsejtek adipokin felszabadulásáról. 14., 15., 16. Ezeket a kísérleteket in vitro megkülönböztetett stromális prekurzoroktól hajtották végre, amelyeket főként nem elhízott egyének szubkután zsírjából izoláltak, 15, 16, majd adipogén koktélok farmakológiai dózisainak vetették alá. Azonban az omentális, nem pedig a szubkután zsír, valamint az elhízás a metabolikus szindrómához és az abnormális endokannabinoid tónushoz kapcsolódik. Ezenkívül az adipocita differenciálódás az in vivo összefüggésben a konzervált sejt kölcsönhatásokkal együtt előfeltétele lehet az optimális adipokin gén expressziónak. 17.

Az ApN csökkentése mellett megmutattuk, másokhoz hasonlóan, hogy egyes adipokinek túlsúlyosak az elhízott egyének omentikus zsírszövetében (OAT), és hozzájárulhatnak anyagcsere és kardiovaszkuláris rendellenességekhez is. 18 Mind az adipociták, mind a stromalis érsejtek (SVC; azaz nem zsírsejtek) hozzájárulnak az adipokin deregulációjához az emberi elhízás során. 18 Az EK esetleges közvetlen szerepével azonban a KKK-ban még soha nem foglalkoztak. Az EK-adipokinek potenciális szabályozásának hátterében álló mechanizmusokat még vizsgálják.

A tanulmány célja (1) annak felmérése volt, hogy a CB1R moduláció szabályozza-e közvetlenül az ApN és más adipokinek termelését az OAT-ban elhízott egyéneknél, (2) annak meghatározása, hogy az OAT CB1R blokád mely sejtfrakciója következik be, és (3) kibontakozik az alapvető mechanizmusok.

Tantárgyak és módszerek

elemeket

Az OAT-t 30 elhízott egyéntől kaptuk, akik bariatriás műtéten (vertikális szalagos gasztroplasztika) estek át egy éjszakai böjt után (1. táblázat). A betegeket nem kezelték hormonokkal (pl. Glükokortikoidokkal; egyikük inzulinján kívül), nem szteroid gyulladáscsökkentőkkel vagy más olyan gyógyszerekkel, amelyekről ismert, hogy befolyásolják a zsír tömegét vagy anyagcseréjét (pl. Tiazolidindionok, szisztémás és nem specifikus modulátorok). adrenerg receptorok).

Asztal teljes méretben

A műtét előtt minden betegből vért vettek. Amint az 1. táblázat mutatja, ezek a betegek súlyosan elhízottak, magasabb volt a szisztolés vérnyomásuk, az éhomi vércukorszintjük, az alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterinszintje és a C-reaktív fehérje szintje, mint az ajánlott vagy normális, és a nőknél alacsonyabb volt a magas sűrűségű lipoprotein koleszterinszint . Nyolc beteget 2-es típusú cukorbetegként diagnosztizáltak, akiket diétával és/vagy orális antidiabetikummal vagy inzulinnal kezeltek. A betegek kétharmada megfelelt a metabolikus szindróma kritériumainak, amelyeket a közös tudományos nyilatkozat határoz meg. 19.

Minden tenyészethez csak egy alanyból származó explantátumokat vagy sejteket használtunk. A korlátozott szöveti hozzáférhetőség miatt nem minden adat nyerhető el minden betegtől.

A vizsgálati protokollt a Cliniques Universitaires Saint-Luc helyi etikai bizottsága hagyta jóvá.

Sejt- vagy zsírkultúra

Megalapozott protokollokat használtunk az adipokinek OAT-ból származó fragmensek vagy izolált sejtek általi termelésének tanulmányozására. 18, 20, 21 Ilyen kísérleti körülmények között sem a szövetek frakcionálása, sem a tenyészet önmagában nem változtatta meg az adipokin expresszió szintjét. 18.

RNS extrakció és kvantitatív valós idejű PCR (RTQ-PCR)

A sejtekből vagy szövetekből származó teljes RNS-t TriPure Isolation Reagent (Roche Diagnostics, Vilvoorde, Belgium) segítségével extraháltuk. Összességében 0,2-2 μg teljes RNS-t fordítottunk át a leírás szerint. Az RTQ-PCR primereket Primer Express szoftver (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA; lásd 2. táblázat) felhasználásával terveztük. Összesen 4–40 ng ekvivalens teljes RNS-t amplifikáltunk egy iQSyber Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Nazareth, Belgium) alkalmazásával, amely 200 nM minden egyes primert tartalmaz, iCycler iQ Real Time PCR detektáló rendszer (Bio-Rad Laboratories) alkalmazásával. . Röviden, a küszöbciklusokat (CT) két példányban mértük. Az ACT értékeket kiszámítottuk minden egyes érdeklődésre számot tartó gén esetében az alábbiak szerint: CT érdeklődésre számot tartó gén, −TT riporter gén, riporter génként TATA box kötő fehérje (TBP). Egy adott gén (ACT) expressziós szintjének relatív változásait a tesztcsoport ACt-ként számítottuk ki a referenciacsoport ACT-jével csökkentve, majd 2-AAT-ként mutattuk be (Delaigle és mtsai. 26).

Asztal teljes méretben

A táptalaj ApN-koncentrációjának meghatározása RIA-val

Az ApN-koncentrációkat tenyésztett adipocita-táptalajban mértük a kereskedelemben kapható RIA kit segítségével (Linco Research, Nuclilab, Hollandia). Ez a készlet nem tesz különbséget az ApN különböző formái között. A hígított tápközegből (1: 1) vett mintákat kétszer elemeztük.

cAMP immunvizsgálat

A sejtekben a CAMP-koncentrációt egy kompetitív ELISA kit (R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, Egyesült Királyság) alkalmazásával mértük a gyártó utasításainak megfelelően. A CAMP-szinteket a sejtek fehérjeszintjére normalizálták, a Bradford-módszerrel meghatározva.

Western blot

Az adipocitákat lízispufferben (Cell Signaling Technology, BIOKÉ, Leiden, Hollandia) homogenizáltuk, 1% proteáz inhibitor koktéllal kiegészítve (Roche Diagnostics). Összesen 20 μg fehérjét oldottunk fel Laemmli pufferben, SDS-PAGE-nak vetettük alá redukáló és denaturáló körülmények között, majd PVDF membránokba helyeztük. A következő antitesteket használtuk az immundetektáláshoz: anti-foszfo-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204), anti-foszfo-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) és anti-foszfo-p38MAPK (Thr180/Tyr182), Minden antitestet a gyártó utasításainak megfelelően használtunk fel (Cell Signaling Technology, BIOKÉ). A jeleket fokozott kemilumineszcenciával detektáltuk. A sáv intenzitását pásztázó denzitometriával (Gel-Doc2000, Bio-Rad Laboratories, Ltd., Hemel Hempstead, Egyesült Királyság) számszerűsítettük, a Quantum One-nal (Bio-Rad Laboratories Ltd.) elemeztük és az Actin sávra normalizáltuk (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgium). intenzitás.

Az eredmények bemutatása és statisztikai elemzés

Az eredményeket átlag ± ± sem értékként adjuk meg a feltüntetett betegszám esetén. Az ugyanazon csoporton belüli különböző állapotok összehasonlítását kétfarkú Student-féle t-teszttel (két feltétel) vagy ismételt varianciaanalízissel (több feltétel), majd Dunnett vagy Newman-Keuls teszttel végeztük. A különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük P 27-nél, és azt is szabályozták (kb. + 78%; 1. ábra). Tovább vizsgáltuk a Rimonabant hatását számos más adipokinre, amelyeket korábban az OAT túltermelőjeként azonosítottak az emberi elhízásban 18: három kemokin (növekedéssel összefüggő onkogén faktor, amelyet a normál expresszált és szekretált T-sejtek aktiválása után szabályoznak, makrofág gyulladásos fehérje (MIP)). -1p), egy interleukin (IL-7), egy szöveti metalloproteináz inhibitor (TIMP-1) és egy hematopoietikus növekedési faktor (trombopoietin). A MIP-1β és az IL-7 génexpressziót a Rimonabant szabályozta (kb. -26% és -32%; P

Az adipokinek génexpressziója a Rimonabanttal kezelt emberi OAT explantánsaiban. Az elhízott OAT egyedektől származó sejteket tenyésztettük 10-100 nM Rimonabanttal (Rim) vagy anélkül 24 órán át. Az adipokin mRNS szintjét RTQ-PCR-rel számszerűsítettük, TBP szintekre normalizáltuk (riporter génként használtuk), és relatív expresszióként mutatjuk be a kontroll (kezeletlen) explantánsokhoz viszonyítva. Az eredmények átlag ± sem 8-12 elhízott személy esetében. * P 27, növekedett, mint a TIMP-1-ben, míg a MIP-1β mRNS csökkent (2c. Ábra).

Adipokintermelés Rimonabanttal kezelt humán adipocitákban és SVC-kben. OAT elhízott egyénekből izolált érett adipocitákat és SVC-ket tenyésztettünk 100 nM Rimonabanttal (Rim) vagy anélkül 24 órán át. Adipokine mRNS szintje ( a, c ) RTQ-PCR-rel számszerűsítettük, TBP-szintre normalizáltuk és relatív expresszióként mutattuk be a kontroll sejtekhez képest. ApN koncentráció a táptalajban ( b ) RIA-val mértük és ng ml -1-ben fejeztük ki. Az eredmények 12-15 (mRNS) vagy 18 (fehérjeválasztás) elhízott egyének átlagértékei ± sem. * P

Az ApN szabályozása CB1R modulációval ( a ) független a cAMP-szintektől ( b, c ). ( a ) Az ApN gén expressziójának CB1R modulációja adipocitákban. Az adipocitákat 100 nM Rimonabanttal (Rim) vagy 1 μM ACEA-val tenyésztettük 24 órán át. Az ApN mRNS-szinteket relatív expresszióként mutatjuk be a kontroll adipocitákhoz képest. ( b ) A cAMP termelésének gátlása a rimonabant-stimulált ApN génexpresszióban adipocitákban. Az adipocitákat MDL-12330A (20 μM) nélkül vagy anélkül tenyésztettük 25 órán át, míg az Rim (100 nM) adagolást az elmúlt 24 órában végeztük. Az ApN mRNS-szinteket relatív expresszióként mutatjuk be a kontroll adipocitákhoz képest. ( c ) A cAMP termelésének növelése Róma által és az MDL megelőzése. A cAMP méréséhez az adipocitákat szérummentes táptalajban (2% BSA) tenyésztettük 100 nM Rim-tal vagy anélkül 10 percig. 1 perccel az élkezelés előtt összesen 20 μM MDL-12330A-t adtunk hozzá. A CAMP-szinteket ELISA-val mértük és az adipocita fehérjetartalomra normalizáltuk. Az eredmények hét átlag ± ± sem értékei ( a ), nyolc ( b ) és öt ( c ) elhízott egyének. * P 28.

Így azt vizsgáltuk, hogy az ApN gén Rimonabant-tal történő stimulálása a megnövekedett cAMP-szintek következménye-e. Az ApN mRNS Rimonabant általi szabályozása nem változott az MDL-12330A adenilát-cikláz inhibitor alkalmazásával (3b. Ábra). Ez az inhibitor ennek ellenére hatékony volt, mert megakadályozta a rimonabant okozta cAMP-szint növekedését az adipocitákban (3b. Ábra). Összességében ezek az adatok arra utalnak, hogy a cAMP nem vehet részt az ApN EK-szabályozásában. Továbbá blokkoltuk a MAP kináz szignálkomponenseket specifikus p38MAPK (SB203580), ERK1/2 (PD98059) és JNK (SP60025) inhibitorokkal. Ezeket az inhibitorokat a CB1R jelátvitel stimulálása során teszteltük. Ezt a stratégiát azért választották, mert a MAPK komponensek bazális foszforilációja viszonylag alacsony volt, ezért könnyebbnek tűnt a foszforilációs szint növekedését (nem pedig csökkenését) észlelni. Az önmagában alkalmazott inhibitorok egyike sem változtatta meg az ApN gén expresszióját (nem látható). Az ApN expresszió ACEA általi csökkenését a p38MAPK szelektív inhibitor teljesen megfordította (P

Röviden: az ES közvetlenül szabályozza az OAT immunháztartását az emberi elhízásban. Különösen a CB1R blokád enyhíti a gyulladásos állapotot mind az adipocitákban, mind az SVC-ben, akár az ApN és az omentin termelésének növelésével, akár a MIP-1β és az IL-7 csökkentésével. Az ApN EK-szabályozása részben magában foglalja a p38MAPK-t.