integrált

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • Az első válasz genom asszociációs elemzése
  • Az egész genomban reakciót tartó asszociáció elemzése
  • A meccs rohamok gyakoriságának genom társulási elemzése
  • Genom asszociációs elemzés a megküzdés teljes késleltetéséről, időtartamáról, gyakoriságáról és típusáról
  • Replikáció a második hibridállományban
  • eQTL azonosítás
  • vita
  • mód
  • Etikai megállapítás
  • Állatok, mintavétel és tulajdonságok mérése
  • A kortizol mérése
  • SNP genotipizálás
  • A viselkedéskezelés genomszintű kombinációja
  • Replikáció keresztezett malacok második állományában
  • Mennyiségi PCR
  • eQTL detektálás
  • További részletek
  • További információ
  • Excel fájlok
  • 1. kiegészítő táblázat
  • 2. kiegészítő táblázat
  • 3. kiegészítő táblázat
  • 4. kiegészítő táblázat
  • 5. kiegészítő táblázat
  • 6. kiegészítő táblázat
  • Hozzászólások

elemeket

  • A génexpresszió profilálása
  • Szabályozó hálózatok

absztrakt

Számos genomiális régióról és stresszválaszhoz, agresszióhoz és depresszióhoz kapcsolódó génvariánsról számoltak be emberekben, valamint a 24., 25., 26. állatmodellben. A sertések számos fiziológiai és genomiális hasonlóságot mutatnak az emberekkel, ezért nyomon követhető modellt nyújtanak a viselkedési, fiziológiai és metabolikus tulajdonságok genetikai meghatározásának tanulmányozásához 27. Valójában a lokuszok (QTL) viselkedési kvantitatív tulajdonságait feltérképezték a stressz 10, a táplálkozási viselkedés 28, az anyai viselkedés 29, valamint az egészséges és a betegség viselkedési mutatói 30 sertésmodellekben.

az eredmény

Összesen 294 német madárka malacot genotipizálunk az Illumina PorcineSNP60 BeadChip segítségével, amely 62 163 lókuszból áll. Szűrés után 48 909 SNP-t használtunk a további elemzéshez. Az asszociációs vizsgálathoz a legfrissebb paramétereket (látencia, időtartam, négy időpontban vívott harcok gyakorisága) és a terhelés kezelésének típusát (magas reaktivitású (HR), nem egyértelmű (IR), alacsony reaktivitású (LR)) használtuk (1. táblázat). . 465 SNP-hez szignifikánsan társultak legalább az egyik leghátsó tulajdonság. Mértük a kortizol szintjét és a vezetői magatartás korrelációs együtthatóit, és a kortizol szintek | 0, 11–0, 20 | és szignifikáns összefüggést jelzett (p

A negatív log10 (NegLog10) 5-nél lévő fekete vonalak megfelelnek az FDR-nek

A negatív log10 (NegLog10) 5-nél lévő fekete vonalak megfelelnek az FDR 10-6-nak. Ez az SNP szignifikánsan összefüggött a 12. és 19. napon a birkózó rohamok gyakoriságával is. A 12. napon a harci rohamok gyakorisága szignifikánsan összefüggésben állt az SSC12-en 52 és 56 Mb közötti SNP-kkel. Az SSC10-en lévő ALGA0056876 az erõsebben társult (p 10-6) az Fd12-hez. Az Fd19-hez társított címkéket az SSC12-re (53 - 56 Mb), az SSC6-ra (25 Mb) és az SSC17-re (50 - 56 Mb) helyezték el. Az SSC12-n található SNP-k (ASGA0055092, ALGA0066975, ALGA0121951) a PER1-en belül voltak. Azt is megállapítottuk, hogy az Fd26 szignifikánsan társult az SSC17 (37 és 64 Mb), az SSC1 (22 Mb) és az SSC12 (53-56 Mb) SNP-khez.

A negatív log10 (NegLog10) 5 fekete vonalai megfelelnek az FDR 10-5 és az FDR értékeknek

A negatív log10 (NegLog10) 5-nél lévő fekete vonalak megfelelnek az FDR-nek

A szín jelzi a lokuszok közötti kapcsolat egyensúlyhiányát, amint azt a kulcs mutatja. Az LD 4 blokk volt a legnagyobb blokk, amely 55 és 56 Mb között volt.

Teljes méretű kép

Az FDR 10-7) tíz SNP-t társítottak a menedzsment típusához. A másik öt átirat (RANGRF, PER1, PDZRN3, SH2D4B és LONP2) transz eQTL-t tartalmazott (átlag p = 1,2 x 10-6). A cis és transz eQTL-ek ábrázolása a 6. ábrán látható. Összességében a 46 legkorábbi 13 tulajdonsággal szignifikánsan társított 465 SNP-ből 38 szintén szignifikánsan társult a CTC1, UBOX5, RAD51B, IL19, CPAMD, ASGR1 és FBXO39 transzkriptumszintekkel . Érdekes módon mindegyikük cis eQTL volt.

A mind a 13 visszatesztelő karakterhez társított hat jelző: ASGA0055092, ASGA0105202, H3GA0034753, ALGA0066975, ALGA0121951 és MARC0073387, amelyek az SSC12-n (55–56 Mb) találhatók a CTC1, PER1 és LOC100739126 (nukleáris eloszlási fehérje nudE), azaz hasonló g ) cis eQTL, transz-eQTL vagy valószínű függvényekkel.

Valójában ezek az SNP-k cisz eQTL-ként a hipotalamuszban a CTC1 transzkripciós szintjeihez is társultak. A CTC1 (CTS telomer karbantartó komplexum 1. komponens) a CST komplexum egy olyan részét kódolja, amely megvédi a telomereket a lebomlástól. A CTC1 polimorfizmusai agyi mikroangiopathiát okoznak 39. A CTC1 viselkedésében betöltött lehetséges szerepe továbbra sem tisztázott, bár a központi és perifériás neuronokra gyakorolt ​​hatásra utaló jelek vannak. Megállapítottuk, hogy a CTC1 ASGA0105202 A allélje szignifikánsan magasabb LR-ben, mint HR-ben; az allél a CTC1 magasabb expressziójához kapcsolódik, és a CTC1 magasabb LR-ben, mint HR-ben. A génpolimorfizmus, a fenotípus variáció és a génexpressziónak ez a következetes háromszögű kapcsolata demonstrálja a CTC1-t mint olyan gént, amely hozzájárul a megküzdési viselkedés genetikai változásához.

Valójában az EQTL a legfontosabb jellemzőkkel egészíti ki a GWAS-t nemcsak azáltal, hogy azonos genomi régiókra mutat, hanem ezeken a magas LD-értékkel rendelkező régiók specifikus génjeire is. Az ExpressionQTL, különösen a cis eQTL, további bizonyítékokat szolgáltat a gén asszociációra vonatkozóan, mivel ezek a gének olyan SNP-ket tartalmaznak, amelyek a leghátsó tulajdonságokkal és saját expressziós szintjükhöz kapcsolódnak, ami viszont a legtöbb hátsó tulajdonsággal társul. A tulajdonsághoz kapcsolódó SNP-k nagyobb valószínűséggel eQTL-ek, összhangban a szabályozó SNP-k szerepével a fenotípusos variációkban. Ennek eredményeként az eQTL információk alkalmazása javíthatja az SNP-k felfedezését, amelyek a 38, 40 összetett fenotípusok sajátosságához kapcsolódnak. .

A vissza-teszt tulajdonságokkal társított gének neurogenezissel és neuronaktivitással társulnak. Például az E mageloszlási faktorhoz hasonló gén szabályozza a 45, 46 kortikális neuronok fejlődési neurogenezisét és elhelyezkedését. A genetikai elemzések összefüggést tártak fel az E nukleáris eloszlási faktor (NDE1 vagy NudE) és az NDE-szerű 1 (NDEL1 vagy Nudel) ortológus között mentális zavarokkal 47, 48 .

A WRAP53 az SSC12-n (55–56 Mb) található, amely a leghátsó tulajdonságokkal társult régió, és fontos szerepet játszik a 49, 50 sejtciklust érintő telomer funkciókban. A WRAP53 (amely WD ismétléseket tartalmaz, antiszensz a TP53-ra) hatással van a motoros neuronok túlélésére 51. A telomeráz-holoenzim-komplex esszenciális összetevőjét kódolja, részt vesz a Cajal-testek felépítésében és fenntartásában, az RNS-módosításokat közvetítő szuborganizmusokban.

A hiperpolarizációval aktivált csatornákat és a ciklikus nukleotid-irányított csatornákat (HCN) négy gén kódolja (HCN1-4), és széles körben expresszálódnak a szívben és a központi idegrendszerben. A HCN1 a domináns izoform, amelyről ismert, hogy az hippocampusban, a neocortexben és az 52 kéregben expresszálódik. A HCN csatornák részt vesznek az idegsejtek gerjesztésében és szinaptikus aktivitásában az egyes idegsejtekben és idegi hálózatokban 53. A HCN1 csatornák beszámolók szerint korlátozzák a tanulást és a memóriát, és számos betegségben érintettek, mint például az epilepszia, az Alzheimer-kór és a perifériás neuralgia 54, 55, 56. Hasonlóképpen, a Liprin-α fehérjék a szinapszisok fő fehérjekomponensei, és hozzájárulnak a szinaptikus transzmisszióhoz az agy különböző régióiban 57, 58. A Liprin-leütésről beszámoltak, hogy az preszinaptikus fejlődés és funkció hibájához vezet 59. Mind a HCN, mind a Liprin SNN-k a vezetési stílushoz kapcsolódtak ebben a vizsgálatban, de nem a transzkripciós szintjükhöz.

Más cisz eQTL-t hordozó gének, mint például az UBOX5 és az FBXO39, kódolják az U box és az F box fehérjéket, és ubiquitin protein ligázként működnek 60, 61. A RAD51 család tagjai mind a mitotikus, mind a meiotikus homológ rekombinációban és a DNS-helyreállításban működnek. Kimutatták, hogy a RAD51B mellrákkal és Werner-szindrómával jár, amelyet a progresszív 62, 63 neurodegeneráció jellemez. Az ebben a 3 génben található SNP-k a viselkedés menedzsmentjéhez kapcsolódnak, valamint az átírások szintjéhez, mint cis eQTL-hez.

Egy másik érdekes terület az SSC3 (139, 8–139, 9 Mb) volt, 3 SNP-vel (ALGA0107834/ASGR1, ALGA0066945 és ALGA0066946) társítva a 8–13 legkorábbi karaktert. Az ASGR1 transzkriptum szintjeihez társultak az ALGA0066945 és az ALGA0066946. Az ASGR1 az asialoglikoprotein receptor alegységét kódolja, és közvetíti a galaktóz (Gal) és az N-acetilgalaktozamin (GalNAc) terminális glikoproteinek felvételét és endocitózisát. Az ASGR1 magasan expresszálódik a 64 hepatocitákban és sokkal gyengébb más szövetekben, beleértve a pajzsmirigyet 65 és a perifériás vér monocitáit 66. Az asialoglikoprotein receptorok részt vesznek a tiroglobulin transzportjában, és viselkedési következményekkel kapcsolódnak a pajzsmirigyhormonokhoz 67. Megállapítottuk, hogy az ASGR1 expresszálódik a hipotalamuszban, és bebizonyítottuk, hogy transzkriptumszintjei SNP markerekhez kapcsolódnak, amelyek szintén társulnak a sertéskezelési stílushoz.

Nemrégiben felvetették, hogy az immunrendszer egyensúlyhiánya fontos szerepet játszik a mentális stresszben és a viselkedésben 37, 68. A CPAMD8 és IL9 génekben talált SNP-k, amelyek összefüggenek az immunfunkcióval, ebben a vizsgálatban összefüggésben voltak a transzkripció kezelésével és szintjével (cis eQTL). A CPAMD8 a 3/alfa (2) -makroglobulin (C3/alfa (2) M) komplement családba tartozik, és veleszületett immunfunkcióival rendelkezik 69. Kimutatták, hogy a pszichológiai stressz fokozza az immunszuppresszív citokinek, köztük az IL19 termelését a béta-adrenoreceptorok aktiválása révén, ami befolyásolhatja a stresszel kapcsolatos betegségfolyamatokat 68. Nemrégiben kimutatták, hogy az IL19 gén feltételezett cisz hatású haplotípusa összefügg a skizofréniával 70. Megállapították, hogy a CPAMD8 és IL9 génekben talált SNP-k összefüggenek a menedzsment stílusával, ami összefüggést sugall az immunrendszer és a viselkedés között.

Eredményeink jelentik az első SNP genom alapú asszociációs elemzést a megküzdés típusához kapcsolódó viselkedési tulajdonságokról. A QTL régiókban hipotalamusz géneket azonosítottak, amelyek jelentős egyensúlyhiányt mutatnak az eQTL kötődésében. A legtöbb társított régió a cis eQTL jeleket (CTC1 és FBXO39) és a transz eQTL jeleket (PER1 és RANGRF) hordozó SSC12 volt (53–56 Mb). Egyéb cis eQTL jelek között szerepelt az ASGR1 az SSC3-on, az IL19 és a CPAMD8 az SSC2-n és az UBOX5-n, valamint az LOC10051179 az SSC17-n. A HCN1-en (SSC16) és a Liprin-α-n (SSC2) elhelyezkedő SNP-k, amelyek neuropatológiai rendellenességekkel társultak, nem mutattak cis vagy transz eQTL jeleket. Az ebben a vizsgálatban azonosított génekről ismert, hogy részt vesznek a telomer működésének, az immunfunkciónak, az ubiquitin-rendszernek, valamint a cirkadián ritmus útjának és a neurotranszmitter receptorainak, vagyis viselkedési idegi kérdéseknek, amelyek kilátást nyújtanak a tenyésztési előrejelzés markereinek levezetésére. Különösen a központi idegrendszerben ismert fiziológiai következményekkel járó CTC1 és PER1 esetében a viselkedésükben betöltött szerepüket a cis-eQTL bizonyította, és független populációban megerősítették az asszociációt.

mód

Etikai megállapítás

Valamennyi kísérletet a vonatkozó előírásoknak és irányelveknek megfelelően hajtottuk végre. Az állatokat a Leibniz Farm Animal Biology Institute-ban (FBN) láttuk el. Az állatgondozási és szövetgyűjtési eljárásokat a német állatjóléti törvény szabályozta, a kísérleti protokollt pedig a leibnizi állattenyésztési biológiai intézet és a mecklenburgi-nyugat-pomerániai állatvédelmi bizottság hagyta jóvá (MVensamitt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit L FALL; TSD/7221, 3-2, 1-020/09). A kísérleti protokollt a leibnizi intézmények jó tudományos gyakorlatának biztosításához elfogadott irányelvek szerint hajtották végre.

Állatok, mintavétel és tulajdonságok mérése

A német Landrace (DL) malacokat (R = 294) előzetes tesztnek vetettük alá, a korábban leírtak szerint 33. Röviden, ismételten elvégeztünk egy 1 perces retrospektív vizsgálatot a házi malacokról 5, 12, 19 és 26 napos korban. Az állatokat egy speciális, V alakú eszközzel a hátukra helyeztük. A teszt pontosan 60 másodpercig tartott, és közvetlenül azután kezdődött, hogy a malac még a hátán feküdt. Feljegyeztük a birkózó támadások késleltetését (L, az első meccsig eltelt idő), időtartamát (D, kumulatív meccsidő 1 perc tesztidőszakon belül) és gyakoriságát (F). Az egyes paraméterek eredményeit minden vizsgált életkorban kiszámítottuk, hogy tükrözzük az egyes malacok teljes látenciáját (tL), teljes időtartamát (tD) és teljes gyakoriságát (tF). A malacokat magas (HR), nem világos (IR) vagy alacsony (LR) reaktivitásba sorolták a következő kritériumok szerint: a HR várakozási ideje ≤ 5 s és LR ≥ 35 s, a HR időtartama ≥ 25 s, LR ≤ 5 s, és a HR gyakorisága ≥4 volt, LR pedig ≤ 71 .

A kortizol mérése

A teljes kortizol-szekréciót reggel mértük úgy, hogy kb. 180 napos vérzéskor minden sertésből 50 ml szárvért vettünk. A vért 1 ml 0,5 M EDTA-t tartalmazó műanyag csőbe gyűjtöttük, jégen tároltuk a plazma izolálásáig, majd hosszú ideig -80 ° C-on tároltuk. A teljes plazma kortizolszintjét enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (DRG, Marburg) határoztuk meg, Németország) két példányban a gyártó protokollja szerint. A tesztek közötti variációs változatok ≤ 7,0%, illetve 9,8% voltak. Kiszámították Spearman korrelációs együtthatóját (Spearman rho, rs), valamint a kortizolszint és a viselkedésmenedzsment kapcsolatát.

SNP genotipizálás

A genotipizálást PorcineSNP60 BeadChip (Illumina Inc., San Diego, Kalifornia, USA) segítségével végeztük a gyártó SNP Infinium HD protokolljának megfelelően. Röviden: 200 ng DNS-t amplifikáltunk, fragmentáltunk és hibridizáltunk egy PorcineSNP60 BeadChip-hez, amely 62, 163 lokusz-specifikus 50-mért tartalmazott. Az intenzitási adatokat megmértük, és a minőségi pontszámokat és a genotípusokat a GenomeStudio szoftver (Illumina Inc.) segítségével származtattuk. Miery hovorov (72, 73.). Emellett rögzített hatásként a genotípust és a nemet használták, a születés napját véletlenszerű hatásként, a malac súlyát kovariátorként. Genotípus tesztet is végeztek az SNP allélek társulására. többszörös tesztelésre helyes, 5% -os hamis felfedezési arányt (FDR) használtak.

Replikáció keresztezett malacok második állományában

Összesen 794 keresztezett tenyésztett állatot használtak, német Landrace (DL) és Large White (DE) fajtákból. Az adatokat a Kieli Egyetem Állattenyésztési és Háztartási Intézetének kutatógazdaságából gyűjtöttük. Az 1 perces háttérteszteket 12 és 19 napos korban ismételten elvégezték. A PER1 (ASGA0055092) és a CTC1 (ASGA0105202) legjelentősebb SNP-jeit használtuk genotipizálásra piroszekvenálással. Az asszociációs elemzéshez általánosított lineáris vegyes modelleket (Proc Glimmix; JMP Genomics (SAS Intézet, Cary, NC, USA)) alkalmaztunk a véletlenszerű hatásnak, a genotípusnak és a nemnek fix hatásként tekintett egyének kedves mátrixával. A többszörös tesztelés javításához hamis felfedezési arányt (FDR) használtak.

Mennyiségi PCR

eQTL detektálás

184 egyén hipotalamuszából származó 37 transzkriptum expressziós szintjét, amelyek a háttesztekhez használtak részhalmazát képviselik, vegyes modellű varianciaanalízisnek vetették alá a JMP Genomics alkalmazásával (Proc Mixed; SAS Institute, Rockville, MD). A backtest tulajdonságok GWAS-jához hasonlóan az egyének közötti IBD-mátrixot alkalmazták véletlenszerű hatásként, és a legfontosabb fő komponenseket kovariátorként korrigálták a populáció rétegzettsége szempontjából. Ezenkívül a genotípust, a nemet és az RT-PCR tételét használták fix hatásként, kovariátként pedig a vágáskor mért súlyt és a háztartási gén CT-értékeinek átlagát. A többszörös tesztelés kijavításához hamis felfedezési arányt (FDR) használtak 5% -nál. Az eQTL-t cis-ként definiáltuk, ha egy társított SNP a géntől 1 Mb-nél kevesebb területen található. Az összes többi eQTL-t „transz” -nak tekintették.

További részletek

Hogyan lehet idézni ezt a cikket: Ponsuksili, S. és mtsai. Az egész genom egészére kiterjedő asszociáció és a hipotalamusz eQTL vizsgálata összefüggést mutat a cirkadián ritmussal összefüggő PER1 gén és a megküzdési magatartás között. Sci. ismétlés. 5., 16264; doi: 10.1038/srep16264 (2015).