elemeket

absztrakt

A Microglia racionális, de kihívást jelentő célokat képvisel a fehéranyag integritásának javítása érdekében, dualista védő és mérgező feladataik miatt. Jelen tanulmány az omega-3 többszörösen telítetlen zsírsavak (n-3 PUFA) hatását vizsgálja a mielin patológiájára adott mikroglia válaszokra az elsődleges kultúrákban és a sclerosis multiplex (MS), egy pusztító demyelinizáló betegség modelljében. A dokozahexaénsav (DHA) és az eikozapentaénsav (EPA), amelyek az agyban az n-3 PUFA két fő formája, gátolták a nitrogén-oxid és a tumor nekrózis faktor-α felszabadulását az elsődleges mikrogliából az IFN-y és mielinnel történő stimuláció hatására. A DHA és az EPA in vitro fokozta a mielin fagocitózisát is. Ezért az n-3 PUFA-k gátolhatják a gyulladást, miközben elősegítik a hasznos immunválaszokat, például a mikroglia fagocitózisát. In vivo vizsgálatok kimutatták, hogy az n-3 PUFA-kiegészítés csökkenti a foltok által kiváltott demyelinizációt és javítja a motoros és kognitív funkciókat. Az n-3 PUFA pozitív hatásai a mikroglia polarizációjának elmozdulásával jártak együtt az előnyös M2 fenotípus felé in vitro és in vivo. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az n-3 PUFA-k klinikailag hasznosak lehetnek immunmoduláló szerként a demielinizáló betegségek számára egy új mechanizmus révén, amely magában foglalja a mikroglia fenotípus váltását.

A mikroglia a környezettől függően különbözik fenotípusában. Míg a "klasszikusan aktivált" M1 fenotípus az antigén megnövekedett megjelenésével, valamint a toxikus citokinek és reaktív oxigénfajok termelésével társul, az "alternatív módon aktivált" M2 fenotípus a sejttörmelék eltávolítását, a helyi gyulladásfeloldást és a felszabadulást kezeli. trofikus tényezők, amelyek elősegítik a regenerációt a neurológiai sérülés után 5, 6. A fenotípus polarizációjáról ismert, hogy számos idegrendszeri betegség progressziója befolyásolja, beleértve az MS 7-et, a 8-as stroke-ot, a traumás agysérülést 9 és a gerincvelő-sérülést 10, 11, és ezért potenciális terápiás célpontot jelenthet a neurológiai rendellenességek szempontjából.

Az omega-3 többszörösen telítetlen zsírsavak (n-3 PUFA-k) jótékony hatását számos neurodegeneratív betegség állatmodelljében tanulmányozták, például Alzheimer-kór 12, 13, 14 és Parkinson-kór 15. Az n-3 PUFA által közvetített neuroprotekció alapjául számos mechanizmus ismert, mint például a sejthalál elnyomása, a gyulladás gátlása és a neurogenezis elősegítése. A legújabb tanulmányok azt is vizsgálták, hogy az n-3 PUFA milyen hatással van a fehérállomány patológiájára. Például az n-3 PUFA-kiegészítés kevesebb fehérállományi elváltozással és jobb teljesítményfunkcióval jár együtt idős 16, 17 éves felnőtteknél. Ezenkívül számos epidemiológiai tanulmány azt sugallja, hogy az n-3 PUFA-kiegészítés javuló klinikai eredménnyel jár MS 18, 19-es betegeknél. Az n-3 PUFA-kiegészítés jótékony hatásait a kísérleti autoimmun encephalomyelitisben (EAE) szenvedő MS kísérleti állatmodelljében is leírták, és a dokozahexaénsav (DHA) dendritikus sejtfüggő T-sejtek aktivációjára gyakorolt ​​moduláló hatásának tulajdonítják 20. Az n-3 PUFA hatását a válasz mikrogliára SM-ben vagy más fehérállományi patológiában azonban nem vizsgálták.

Jelen tanulmányban primer mikroglia kultúrákat és egy demielinációs modellt használtunk, amelyet az n-3 PUFA elhanyagolható hatása indukált a mielin patológiára adott mikroglia válaszokra. Megállapítottuk, hogy a DHA és az eikozapentaénsav (EPA), a központi n-3 PUFA a központi idegrendszerben, koncentrációfüggő módon gátolta a gyulladásos mediátorok mikroglia felszabadulását a mielin és IFN-γ stimulációra válaszul, és fokozta a mielin fagocitózisát in vitro. A mechanizmus további tanulmányai kimutatták, hogy a DHA és az EPA in vitro fiziológiai körülmények között elmozdíthatja a mikroglia polarizációját az M2 fenotípus felé, és gátolhatja az M1 polarizációt gyulladásos körülmények között. Az in vivo vizsgálatok azt is megerősítik, hogy az n-3 PUFA-val történő kiegészítés csökkenti az elhanyagolható hatás által kiváltott demyelinizációt, és javítja a motoros és kognitív képességeket. Az n-3 PUFA ezeknek az állatmodellekben kifejtett jótékony hatásainak együtt jártak az M2 mikroglia fenotípusra való áttérés in vivo .

az eredmény

A DHA és az EPA gátolja a mikroglia gyulladásos reakcióit

Annak megállapítására, hogy a DHA és az EPA képesek-e modulálni a mikroglia aktiválódását, az elsődleges mikrogliákat 24 órán át DHA-val vagy EPA-val kezelték, majd további 24 órán át LPS-stimulációt (2,5 ng/ml). A nitrogén-monoxid (NO) és a TNFa felszabadulását a táptalajban a gyulladásos válasz markereiként mérjük. Amint az 1. ábrán látható, a DHA előkezelés szignifikánsan gyengítette az LPS által kiváltott NO és TNFα felszabadulást koncentrációfüggő módon, 20 μM-tól kezdődően (1A. És 1D. Ábra). Az EPA hatása minőségileg hasonló volt a DHA hatásához (1B. És 1E. Ábra). A későbbi kísérletek során a DHA (20 μM) és az EPA (20 μM) legalacsonyabb koncentrációit alkalmazták, amelyek sikeresen gátolták mind az NO, mind a TNFα felszabadulását. Az NO és a TNFa termelésének elnyomása nem magyarázható a DHA-val és az EPA-val társított sejttoxicitással, mivel sem a DHA, sem az EPA nem növelte az LDH extracelluláris felszabadulását a táptalajba (1C. És 1F. Ábra).

myelin

(A - F) Az 5x104/lyukban beoltott primer mikrogliákat 24 órán át különböző koncentrációjú DHA-val vagy EPA-val (5-80 μM) kezeltük, majd LPS-stimuláció (2,5 ng/ml). A táptalajt 24 órával az LPS után gyűjtöttük össze. A gyulladás markereiként a nitrogén-oxid (NO) (A, D) és a tumor nekrózis faktor-α (TNF-α) (B, E) termelését mértük. A laktát-dehidrogenáz (LDH) termelését (C, F) sejthalálvizsgálatként mértük. (G - J) Az 5x104/mélyedésbe beoltott primer mikrogliákat 24 órán át DHA-val (20 μM) vagy EPA-val (20 μM) kezeltük, majd myelin (1, 5 vagy 10 μg/ml) következett IFN- vagy anélkül. γ stimuláció (5 ng/ml) további 24 órán át. Az extracelluláris NO (G, I) és a TNF-a (H, J) táptalajban mértük. Az eredményeket három-négy független kísérlet átlagában ± SEM-ben fejezzük ki, mindegyiket három példányban végezzük. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01, *** P ≤ 0, 001 a vivőanyag-kezeléshez képest.

Teljes méretű kép

Megerősítettük továbbá a DHA és az EPA gátló hatását a gyulladásos mikroglia válaszokra egy betegséghez kapcsolódó in vitro modellben, mielint és IFNy-t használva gyulladásos stimulátorokként. Míg az egyes aktiváló faktorok önmagukban csak gyenge mikroglia választ váltottak ki, a mielin és az IFNy együttes kezelés erős szinergetikus és koncentrációfüggő hatást mutatott a mikroglia gyulladásos markereire (1G-J ábra). Ezenkívül a DHA-val (20 μM) vagy az EPA-val (20 μM) végzett előkezelés jelentősen csökkentette a NO (a mielin + IFNγ által indukált) (1G és 1I ábra) és a TNFα (1H és 1J ábra) termelését. Ezek az adatok határozottan arra utalnak, hogy az n-3 PUFA-k gátolják az MS-hez kapcsolódó gyulladásos ingerekre adott mikroglia reakciókat. Ezenkívül úgy tűnik, hogy az EPA valamivel nagyobb gyulladáscsökkentő hatással bír.

A DHA és az EPA növeli a mielin fagocitózisát a microglia-ban

Az n-3 PUFA mielin fagocitózisra gyakorolt ​​hatásának vizsgálatához a mikrogliákat 24 órán át inkubáltuk DHA vagy EPA különböző koncentrációival, 5 μM és 80 μM között. Cyel-jelölt mielint adtunk a tenyészetekhez további 6 órán át. Mosás után a mielin fagocitózisát kvantifikáltuk a Cy3 fluoreszcencia mérésével a sejtlizátumban. A DHA-val (2A. Ábra) vagy az EPA-val (2B. Ábra) végzett kezelés 10-40 μM koncentrációban szignifikánsan növelte a mielin fagocitózisát. A konfokális képalkotás megerősítette, hogy a DHA (20 μM) - vagy az EPA (20 μM) kezelés fokozta a mikroglia fagocitózisát (2C. Ábra).

Az elsődleges mikrogliákat különböző koncentrációjú DHA-val vagy EPA-val (5-80 μM) 24 órán át előkezeltük, majd további 3 órán át inkubáltuk Cy3-jelölt mielinnel (0,5 μg/ml). (A, B) A mielin fagocitózist intracelluláris fluoreszcenciaként számszerűsítettük. (C) Reprezentatív képek, amelyek azt mutatják, hogy a DHA-val (20 μM) vagy az EPA-val (20 μM) végzett kezelés fokozta a mielin fagocitózisát. Az eredményeket három-négy független kísérlet átlagában ± SEM-ben fejezzük ki, mindegyiket három példányban végezzük. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01 a vivőanyag-kezeléshez képest.

Teljes méretű kép

A DHA és az EPA modulálja a mikroglia polarizációját fiziológiai és gyulladásos állapotokban

Amint a bevezetőben említettük, ismert, hogy a mikroglia különböző fenotípusokat foglal el, például M1 és M2, válaszul a különböző külső ingerekre 10, 21. Ezért nagy áteresztőképességű PCR mezőt alkalmaztunk több M1 és M2 jelző gén expressziójának elemzésére DHA-ban vagy EPA-val kezelt mikrogliában. A DHA és az EPA egyaránt figyelemre méltó tendenciákat mutat az M2 gének szabályozásának fokozásában és az M1 gének csökkentésében fiziológiai körülmények között (3A - 3B. Ábra).

A 6-lyukú lemezen 5x104/üregben beoltott primer mikrogliákat 24 órán át DHA-val vagy EPA-val (egyenként 20 μM) kezeltük. (A-B) valós idejű PCR-ek azt mutatják, hogy a DHA (A) és az EPA (B) kezelés szignifikánsan gátolta több M1 gén expresszióját és javította az M2 gének expresszióját. A (C - F) valós idejű PCR az M2-hez kapcsolódó CD206 (C) és TGFβ (D) gén jelentős stimulációját mutatta DHA vagy EPA kezelés után. Ezenkívül a DHA-val vagy az EPA-val végzett előkezelés 24 órán át jelentősen gátolta az M1-rel rokon TNF-a (E) és iNOS (F) gének expresszióját LPS-stimuláció (2,5 ng/ml) után. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01, *** P ≤ 0, 001 a kontrollhoz képest; P = 0,01, ## P = 0,001 az LPS-hez viszonyítva.

Teljes méretű kép

Hagyományos, valós idejű PCR-t is alkalmaztunk a DHA és az EPA mikroglia polarizációra gyakorolt ​​hatásainak igazolására. Az elsődleges mikrogliákat DHA-val (20 μM) vagy EPA-val (20 μM) kezeltük 24 órán át. A PCR terepi adatokkal összhangban a DHA-val és az EPA-val végzett kezelés szignifikánsan megnövelte a CD206 és/vagy a TGFβ, két reprezentatív M2 gén expresszióját fiziológiai körülmények között (3C-3D ábra). A DHA-val vagy EPA-val végzett kezelés nem gátolta a TNFα és az iNOS, két reprezentatív M1 gén expresszióját fiziológiai körülmények között, de jelentősen csökkentette e két gyulladásos gén termelését 24 órás LPS-stimuláció után (3E. És 3F. Ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a DHA és az EPA mind fiziológiai, mind kóros körülmények között modulálhatja a mikroglia fenotípusos polarizációt.

Az n-3 PUFA kiegészítés csökkenti a demielinizációt az MS egérmodelljében

Az egereket 0,2% cuprizont (N3H) tartalmazó étrenddel etettük (N3L) n-3 PUFA dúsítással vagy anélkül 5 hétig. (A) A corpus callosum (CC) demielinizáló elváltozásait Luxol gyorskék (LFB) festéssel (balra), MBP festéssel és elektronmikroszkóppal (EM, jobbra) detektáltuk. Az axonokban bekövetkezett patológiás változásokat SMI32 immunjelöléssel tárták fel. A képek négy állat metszetét reprezentálják. (B) Az MBP intenzitást a szimulált értékhez viszonyított hajtásváltozásként mértük és számítottuk. (C) Az SMI32 és az MBP arányát a fehérállomány károsodásának (axonális károsodás és demielinizáció) mutatójaként számítottuk ki. (D) Az MBP expressziójának Western blot elemzése. n = 4 egér minden csoportra. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01 a szimulált kontrollokhoz képest.

Teljes méretű kép

Az n-3 PUFA kiegészítés csökkenti a neurológiai viselkedési hiányokat egy cuprizone-nal kezelt demielinizációs modellben

Az egereket 0,2% cuprizont (N3H) tartalmazó étrenddel etettük (N3L) n-3 PUFA dúsítással vagy anélkül 5 hétig. (A - C) A Morris vízi labirintus tesztet 28-32 nappal a cuprizone diéta kezdete után hajtották végre. (A) Reprezentatív képek az egerek lebegő útvonalairól minden csoportban, amikor a platform jelen volt (helyszíni navigáció; tanulási szakasz) és eltávolítása után (szondateszt; memóriafázis). (B) A platform merülésének késleltetését n-3 PUFA-val kiegészített és rendszeres étrendű egerekben mértük 28-31 nappal a cuprizone-diéta kezdete után. (C) A korábban merített platform helyének térbeli memóriáját n-3 PUFA-val kiegészített és rendszeres étrendű egerekben mértük 32 nappal a cuprizone diéta kezdete után. A térbeli memória a célnégyzetben eltöltött idő, a platform eltávolításakor fejeződik ki. (D) Rotarod-teszt 2-5 hetes kalrizon-kezelés előtt és után. n = 8 állat/csoport. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01 az adott összehasonlításokra.

Teljes méretű kép

Az n-3 PUFA-kiegészítés elősegíti az M2 mikroglia polarizációját a cuprizonnal kezelt demielinizáció állatmodelljében

Az n-3 PUFA mikroglia polarizációra gyakorolt ​​hatásainak vizsgálatához a demielinizáló betegség in vivo modelljében mértük az M1 és M2 szignál gének sorozatának expresszióját RT-PCR-rel. Ahogy az várható volt, az M1 gének (CD16 és iNOS) expressziója szignifikánsan megnőtt a cuprizone diéta 5 hete után. Az n-3 PUFA kiegészítés gátolta ezen M1 gének növekedését (6B. ábra), és növelte a három M2 gén (CD206, YM1/2 és Arg1, 6A. ábra) expresszióját cuprizonnal kezelt egerekben. Az immunfluoreszcens festés továbbá azt mutatta, hogy az M1 (CD16) és az M2 (CD206) markerfehérjék kifejeződése 5 hetes cuprizondiéta után megnőtt (6C-F ábra). Az n-3 PUFA-kiegészítés ebben a modellben a mikroglia polarizációját elmozdította az M2 felé, amint azt a fokozott CD206 expresszió és a CD16 expresszió gátlása mutatja a corpus callosumban.

Az egereket 0,2% cuprizont (N3H) tartalmazó étrenddel etettük (N3L) n-3 PUFA dúsítással vagy anélkül 5 hétig. (A-B) Az M1 (A) és az M2 (B) markerek valós idejű PCR-jét a corpus callosumból kivont teljes RNS felhasználásával végeztük. (C) Az Iba1 reprezentatív immunfluoreszcens festése CD16/32 (M1) vagy CD206 (M2) alkalmazásával a corpus callosumban. Méret: 40 μm. (D - F) Az Iba1 + (D), CD16/32 + (E) és CD206 + (F) sejtek mennyiségi meghatározása a corpus callosumban. n = 4 állat csoportonként. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01, *** P ≤ 0, 001, szemben a szimulációval; # P ≤ 0, 05, ## P ≤ 0, 01, ### P ≤ 0, 001 vs. CPZ + N3L.

Teljes méretű kép

vita

Az ebben a dokumentumban bemutatott eredmények bemutatják a DHA és az EPA erős jótékony hatását a mielin patológiájára adott mikroglia válaszokra. Az n-3 PUFA azon képessége, hogy gátolja a gyulladást, miközben fokozza a fagocitózist a mielinnel stimulált mikrogliaban, izgalmas új lehetőségeket mutat be a neurológiai betegségek kezelésében. Ezenkívül az M1-M2 eltolódás megállapítása az n-3 PUFA mikroglia fenotípus kedvező modulációját jelzi.

A DHA és az EPA gyulladáscsökkentő hatásáról számos neurodegeneratív betegségről számoltak be, ideértve a stroke-ot és az Alzheimer-kór 24, 25, 26, 27, 28, 29. Az N-3 PUFA-k szintén kimutatták, hogy az AD 30 in vitro modellben fokozzák az amiloid-β mikroglia fagocitózisát. A DHA és az EPA szerepét azonban a mikroglia polarizációban és az SM patológiájában korábban nem vizsgálták; ez a tanulmány elsőként vizsgálja az n-3 PUFA-k szerepét a mikroglia polarizációjában egy demielinizáló betegséggel összefüggő modellben. Megállapítottuk, hogy az n-3 PUFA-k a mielin és az IFN-γ által kiváltott gyulladás differenciális gátlása és a fokozott myelin fagocitózis révén jótékony hatással vannak a mikroglia működésére. Ezek a funkcionális hatások a domináns M2 fenotípus felé irányuló mikroglia polarizációval társultak. A fenotípusos polarizáció elősegítheti azt a mikrokörnyezetet, amely ellenáll a gyulladásos károsodásoknak és a további demyelinizációnak az SM-ben, ami javított neurológiai funkciót eredményez in vivo .

Egyes tanulmányok azt sugallják, hogy az MS1 modellekben a remyelinizáció kezdetén endogén elmozdulás következik be az M1 mikroglia fenotípusától az M2 felé. Ezenkívül az M1 vagy M2 fenotípusos sejtek szelektív kimerülése azt mutatta, hogy az M2 fenotípus elősegíti, míg az M1 fenotípus károsítja az oligodendrocita regenerációt ebben a modellben 6. Ezért lehetséges, hogy az n-3 PUFA által biztosított M2 polarizáció nemcsak csökkentheti a demielinizációt, amint az ebben a tanulmányban szerepel, hanem előnyös lehet az SM-ben végzett remyelinizációs folyamat számára is. A laboratóriumunkban folyó vizsgálatok ezért az n-3 PUFA hatását vizsgálják az oligodendrocita differenciálódására és a remyelinizációra.

A mikroglia polarizációra gyakorolt ​​jótékony hatások mellett nemrégiben készült tanulmányunk a DHA közvetlen védőhatását is kimutatta az oligodendrocyták 31 exitotoxicitása ellen. Így mind a közvetlen (oligodendrocytákon keresztül), mind a közvetett (mikroglia útján) mechanizmusok hozzájárulhatnak az n-3 PUFA-fehér anyag védelméhez. Érdekes módon a DHA optimális dózisa a mikroglia gyulladáscsökkentő hatásához és az oligodendrocyták védőhatásához körülbelül 20 μM 31. A DHA vagy az EPA hasonló dózistartományban elnyomja a gyulladást az emberi T-helper sejtekben, és fokozza a gyulladáscsökkentő faktorok szekrécióját a monocitákból 32. Ezenkívül egy állatkísérlet megerősítette, hogy a DHA-kiegészítők több hét alatt jelentősen megnövelhetik az agy DHA-szintjét, körülbelül 10-20 μM/g nedves agyszövetre 33. Mivel az n-3 PUFA-k képesek több sejttípust megcélozni, és az étrend-kiegészítés megkönnyítése érdekében terápiás szerként tovább kell vizsgálni SM-es betegek számára. Ha a DHA és az EPA képesek hasonló védőhatásokat kiváltani az emberekben, akkor ezek a természetes vegyületek biztonságos és olcsó kezelésként szolgálnának világszerte 2,3 millió ember számára, akik SM-ben szenvednek, valamint számtalan más demielinizáló betegségben szenvedő beteg számára.

mód

Az elsődleges mikrogliával dúsított kultúrák

Elsődleges mikroglia-dúsított tenyészetek készültek egynapos kölykök teljes agyából a fentiek szerint 34. Röviden: az agyszöveteket az agyhártya és az erek eltávolítása után eldörzsöltük. A sejteket ezután 5x107 sejt/150 cm 3 tenyésztőlombikba oltottuk DMEM/F12 táptalajban, amely 10% hő-inaktivált szarvasmarha-magzati szérumot, 2 mM L-glutamint, 1 mM nátrium-piruvátot, 100 μM nem esszenciális amino-t tartalmaz. savak. U/ml penicillin és 50 μg/ml sztreptomicin. A gliasejtek összefolyó egyrétegének elérése után (általában a kezdeti oltást követő 12–14 napon belül) a mikrogliákat összegyűjtöttük, összegyűjtöttük és reszektáltuk. A mikroglia tenyészeteket (97% -os tisztaság) ezután 24 órán át táptalajban oldott DHA-val vagy EPA-val (Sigma, St. Louis, MO) kezeltük, majd további 24 órán át a mielin és az IFN-y különböző koncentrációival.

A mielin előállítása

A mielint három hónapos egerek agyából izoláltuk centrifugálással szacharóz-sűrűség-gradienssel (0,32 M és 0,85 M) 75 000 x g-nél a fent leírtak szerint 35. A mielin fehérjetartalmat Bradford fehérje esszével (Bio-Rad) határoztuk meg szarvasmarha szérum albuminnal standardként. A mielinmaradványok endotoxin-koncentrációja