bialélikus

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • Tantárgyak és módszerek
  • elemeket
  • Abszolút kiváló szekvenálás
  • A teljes C-vitamin kontrollált mutagenezise
  • Sejtkultúra és immunfluoreszcencia
  • Western blot elemzés és a fehérjék szekvenciális extrahálása detergenssel
  • immunhisztokémia
  • az eredmény
  • vita

elemeket

  • Genetikai kutatások
  • Új generációs szekvenálás

absztrakt

A dilatált kardiomiopátiában szenvedő gyermekgyógyászati ​​betegek túlnyomó többségében a specifikus etiológia ismeretlen. Tágult kardiomiopátiában szenvedő családokkal végzett vizsgálatok szemléltetik a genetikai tényezők szerepét a kardiomiopátiás etiológiában. Ebben a tanulmányban abszolút kiváló szekvenálást alkalmaztunk egy szétválasztott család tagjaira, akiket korábban nem jelentettek veleszületett dilatált kardiomiopátia szindróma, amely korai szívátültetést igényel. Az exomoma-elemzés a vegyület heterozigóta variánsait azonosította az FLNC génben. A szívizom szövettani elemzése szignifikáns szarkómikus és miofibrilláris rendellenességeket, az immunhisztokémiai festés pedig a Filamin C aggregátumok jelenlétét mutatta a szívizomsejtekben. Arra a következtetésre jutunk, hogy az FLNC bialélikus változatai veleszületett dilatált kardiomiopátiát okozhatnak. Mivel az érintett betegek kapcsolódó klinikai tünetei enyheek és könnyen figyelmen kívül hagyhatók, a kitágult kardiomiopátiában szenvedő gyermekeket fontolóra kell venni az FLNC-vizsgálat során. .

Tantárgyak és módszerek

elemeket

a ) Családi törzskönyv, amely bemutatja az egyének életkorát és a mutáns FLNC allélek szegregációját. A vad típusú FLNC allélt pluszjel jelöli. A kitöltött szimbólumok az érintett személyeket jelzik. A szimbólumokon átlós vonalak jelzik az elhunytat. b ) Az F106L missense variánst (piros) tartalmazó FLNC domén evolúciós konzerválása különböző gerincesekben (gerincesek összehasonlítása és védelme, állapotok összehasonlítása és védelme, UCSC genom böngésző). c ) Elektroferogramok, amelyek FLNC mutációkat mutatnak a betegben és szüleikben. A kép teljes színes változata elérhető az Európai Journal of Human Genetics online.

Teljes méretű kép

Abszolút kiváló szekvenálás

A genomi DNS kivonása, az exoma dúsítása, a szekvenálás és az elemzés a fent leírtak szerint fejeződött be. Három változatot szűrtünk, hogy elkészítsük a csak ritka funkcionális variánsok végleges listáját (missense, nonszensz, splice hely variánsok és indels). Az Exome Variant kiszolgálón (ESP6500 kiadás) alacsonyabb, mint 0,01 allélfrekvenciájú változatokat vagy az ExAC European Samples Database (NFE)> 150-es allélszámú változatokat eltávolítottuk. Validációs és szegregációs elemzéseket a leírásnak megfelelően végeztünk. Három változatot értékeltünk az Országos Biotechnológiai Információs Központban (FLNC: NM_001458.4) tárolt referenciaszekvenciákkal szemben. Variánsadatokat nyújtottak be a ClinVar-hoz (SUB1474516; //www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/).

A teljes C-vitamin kontrollált mutagenezise

Teljes hosszúságú cDNS-klónt az FLNC-hez (NM_001458.4) N-terminális Myc-DDK-taggal az OriGene-től (Rockville, MD, USA) szereztünk be. Helyspecifikus mutagenezist végeztünk a p.F106L, p.R991 * variánsokkal rendelkező klónok előállításához a QuikChange II XL helyspecifikus mutagenezis készlet használatával, a gyártó ajánlásaival (Stratagene, Santa Clara, Kalifornia, USA) és specifikus oligonukleotidokkal ( c.318C> G, p. (F106L), előre - 5'-GCCCTCGAGTTgCTCGAGCGCGA-3 'és hátramenet - 5'-TCGCGCTCGAGcAACTCGAGGGG-3'; c.2971C> T esetén, (R991 *), előre - 5 ' -CTGGGGGGA 3 'és visszafelé - 5'-GCCAGCCCCTCaTGTGTTCACAG-3'; F106L-ek esetén, 5'-ATGAGCACCAAGTGCG-3 '; A helyes variáns bevezetését és más változatok hiányát Sanger szekvenálás igazolta.

Sejtkultúra és immunfluoreszcencia

Western blot elemzés és a fehérjék szekvenciális extrahálása detergenssel

A sejteket 2 μg plazmiddal nukleofektáltuk, és fehérje jelenlétében elemeztük 48 órával a transzfekció után. A fehérje-extrakcióhoz a tenyésztett sejteket kétszer mostuk 1x PBS-sel és RIPA pufferben (100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 m EDTA, 1% nátrium-deoxi-cholát, 1% Triton X -100, 0%) lizáltuk., 1% SDS) komplett proteáz inhibitor koktéllal kiegészítve EDTA és PhosStop EASYpack (Roche) nélkül. A sejtlizátumokat 13 000 g-vel 5 percig centrifugáltuk, és a felülúszót megmentettük. A fehérjekoncentrációt bicinchonininsav technikával értékeltük (Pierce BCA Protein Assay Kit, Waltham, MA, USA). A fehérjéket 8% SDS-PAGE géleken futtattuk, nitrocellulóz membránokra vittük, 5% sovány tejporral blokkoltuk TBS-T pufferben (20 mM Tris (pH 7, 4), 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20) és egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk a következő primer antitestekkel: anti-DDK tag antitest (Cell Signaling, Beverly, MA, USA) és anti-aktin (Sigma, St. Louis, MO, USA). Az elsődleges antitesteket torma-peroxidázzal konjugált fajspecifikus másodlagos antitestekkel (Jackson Immunoresearch (West Grove, PA, USA) vagy Thermo Scientific (Waltham, MA, USA)) detektáltuk Luminata Forte Western HRP szubsztráttal (Millipore, Billerica, MA, USA) ). ) a LAS-300 FUJIFILM segítségével (Tokió, Japán).

immunhisztokémia

az eredmény

A genomi hibridizáció összehasonlító vizsgálata nem mutatott változást a kópiaszámban. Ezenkívül a teljes exoma szekvenálást a probandon, 16 éves nővérén és szülein végezték. A szekvenálást egy Illumina HiSeq 2500 (San Diego, Kalifornia, USA) alkalmazásával végeztük, hogy 150 bp páros eredményeket hozzunk létre 95x átlagos lefedettséggel. A pontos eredményeket elemeztük az összes öröklődési séma esetében, és feltártuk az FLNC: g gén missense és stop-gain variánsainak heterozigóta vegyületét. [128471009C> G]; [128484099C> T]. Az első missense variáns, c. [318C> G], p. (F106L), az ExAC adatbázis (//exac.broadinstitute.org) szerint négyszer találták meg 32 261 európait, és édesanyjától örökölték. A fenilalanin ebben a helyzetben erősen konzervált az evolúcióban (1b. Ábra) (GERP + = 4, 5, phyloP100way = 3, 2, 5, 6), és várhatóan zavarni fogja az összes vizsgált előrejelzett algoritmust (SIFT, Polyphene2, LRT, VariantTaster, VariantAssessor, FATHMM). A második változat, c. [2971C> T], p. (R991 *), egy stop-gain/nonszensz variáns, amelyet még egyetlen adatbázis sem tartalmazott, és amelyet az apától adtak át. Megállapították, hogy az FLNC variánsai elválnak egymástól a családban. Az elhunyt testvér DNS-mintájának elemzése a vegyület azonos heterozigozitását mutatta ki az FLNC-variánsok esetében (1a. És c. Ábra).

Mivel az FLNC heterozigóta variánsai myofibrilláris és disztális myopathiákkal társultak, 7, 8, 9, 10, 11, neurológiai értékelést végeztek minden olyan családtagnál, amelyről kiderült, hogy variáns hordozó (hét alany; 5–72 éves). Év). A neurológiai vizsgálatok és az echokardiogramok normálisak voltak minden alanynál.

Teljes méretű kép

vita

Végül azt javasoljuk, hogy mérlegeljék a dilatált kardiomiopátiában szenvedő gyermekeknél a C-vitamin tesztet. A korai molekuláris diagnózis fontos a gyorsan előrehaladó szívelégtelenség és az életveszélyes aritmiák előrejelzésében, kezelésében és megelőzésében.