modell

  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • Pikkelysejtes metaplázia krónikusan fertőzött MTB egerek tüdejében alakul ki
  • A laphámsejtes metaplazia aránya genetikailag szabályozott
  • A pikkelyes sejtek metaplazái rosszindulatú transzformációt eredményeznek
  • A laphámsejtre hajlamosító tényezők vannak jelen a TB tüdőelváltozásokban
  • vita
  • Összeférhetetlenség
  • További információ
  • Word dokumentumok
  • 1. függelék

absztrakt

A tuberkulózis (TB) továbbra is a fertőző betegségek által okozott halál egyik vezető oka, és globális veszélyt jelent a közegészségügyre. A virulens Mycobacterium tuberculosis (MTB) évente több mint 2 millió halálesetet okoz világszerte, az emberi populáció körülbelül egyharmada látens formában hordozza a kórokozót. A TB-fertőzés eredményei a primer progresszív betegségtől, amely a fertőzött személyek kevesebb mint 10% -ánál fordul elő, a látens fertőzésig terjed, amely a betegség újbóli aktiválódásához vezethet az elsődleges fertőzés után sok évvel, vagy szubklinikus marad a fertőzöttek életében. A tüdőbetegség a klinikai esetek ∼ 85% -ában alakul ki, és ez a betegség epidemiológiailag legjelentősebb formája. Az a képesség, hogy egy kórokozó destruktív tüdőbetegséget okozhat immunkompetens gazdaszervezetekben, lehetővé teszi annak hatékony átvitelét a légzőrendszeren keresztül az emberi populációban. A kórokozó által a tüdőben elindított folyamat megértése kulcsfontosságú annak evolúciós sikeres virulencia-stratégiájának megfejtéséhez és hatékony betegség-ellenőrzési beavatkozások kidolgozásához. A tüdőben előforduló TB elváltozások jellemzői azonban, amelyek megkülönböztetik őket a többi szerv granulomájától, továbbra sem ismeretesek.

A tüdő TBC és a carcinoma együttélését sok patológus írja le Bayl első, 1810-es jelentése óta (Sakuraba et al., 2006; Tan és Coussens, 2007). Azóta felmerült, hogy a tüdőbetegség együtt járhat a tüdőrák különböző szövettani típusaival. Például dokumentálták a tüdő metasztatikus laphámsejtes karcinómájának (SCC) szoros összefüggését a nagy TB üregekkel rendelkező elváltozásokkal (Oka és Chan, 2005). Az indiai Dacosta és Kinare tanulmánya arról számolt be, hogy a bronchogén daganatos betegek 30-33% -ának tüdejében találtak aktív vagy gyógyító TB elváltozásokat, szemben az általános populáció 7% -ával (Dacosta és Kinare, 1991). Kurasawa a pulmonalis tuberkulózis és a tüdőrák együttélésének magasabb arányáról is beszámolt, amelyet ebben a tanulmányban főleg az SCC képvisel (Kurasawa, 1998). A boncolásokkor túl magas tüdőrákos halálozási arányt figyeltek meg mind a dohányzók, mind a nem dohányzók tuberkulózisban (Sakurai et al., 1989). Az egyidejűleg fennálló tuberkulózis és tüdőrák klinikai diagnózisa kihívást jelent, és gyakran jelentős késleltetés adódik mindkét betegség megfelelő kezelésének beadásában, ami rossz prognózissal jár együtt (Gopalakrishnan et al., 1975; Ting et al., 1976 ).

A tüdőrák és a tüdő TB közötti ok-okozati összefüggés nem egyértelmű. Egyrészt a látens TB-fertőzéssel járó krónikus gyulladásos reakció rosszindulatú daganatok kiváltó okaként szolgálhat. Ezt a lehetőséget közvetetten alátámasztják az ún "Scarring on Scars" (Cagle et al., 1985). Ardies feltételezte, hogy sok esetben a tüdő hegesedése a visszatérő TB-fertőzést követő spontán gyógyulásnak köszönhető, és a gyulladásos és szöveti helyreállítási folyamatok ciklusainak megindításával kedvező környezetet teremtettek a tumorgenezishez (Ardies, 2003). Másrészt a tüdőrák autonóm módon kialakulhat, majd a helyi immunitás gyengítésével indukálja a látens TB reaktiválódását. Ez szintén valószínű forgatókönyv, mivel az emberi populáció csaknem egyharmada látensen fertőzött MTB-vel. Ezért ok-okozati összefüggésre nem lehet kizárólag a klinikai összefüggések alapján következtetni. Eközben ez a megkülönböztetés kulcsfontosságú a TB és a rák együttélésének alapjául szolgáló specifikus molekuláris mechanizmusok bemutatásához, valamint a racionális megelőző és terápiás intézkedések kidolgozásához.

Ebben a tanulmányban kísérleti bizonyítékokat mutatunk be arra vonatkozóan, hogy a tüdő krónikus tuberkulózis-fertőzése elegendő ahhoz, hogy a laphámsejt-diszplázia révén a tuberkulózisos tüdőelváltozásokkal összefüggő sejtek többlépcsős átalakulását rosszindulatú SCC-vé váljon. Kimutattuk, hogy a DNS-károsító reaktív oxigénfajták és a nitrogén mellett az MTB-vel fertőzött makrofágok az epidermális növekedési faktor epiregulin családjának legerősebb tagját is előállítják, amely parakrin növekedési faktorként szolgálhat a tumorgenezis kezdeti lépéseiben. Modellünkben azonosítottuk az MTB által kiváltott tüdődaganatképzés hatásos genetikai módosítóját is: az sst1 genetikai lokuszt (Kramnik et al., 2000), amely specifikusan szabályozza a szövetkárosodást és a tuberkulózis progresszióját a tüdőben.

az eredmény

A krónikusan fertőzött MTB egerek tüdejében méretarányos sejtmetaplázia alakul ki

Az SCC-szerű sejtek kezdeti csoportosulásait figyelték meg az F2 utódok tüdejében, viszonylag rezisztensek a TB (C3HeB/FeJxB6.C3H-sstl) F2-vel szemben, iv MTB fertőzés után. Ebben a fogékony, de egyébként genetikailag heterogén sst1 populációban a túlélés 5 és 6 hét között mozgott több mint egy évig. Hét hosszú távú túlélőt öltek meg 15 hónappal a fertőzés után. Élő MTB-ket detektáltunk a tüdőben szervhomogenátumok alkalmazásával. A hisztopatológiai vizsgálat során a hét állat közül négyben találtunk kóros nagyméretű sejteket, amelyek hasonlítottak a laphámsejtekre, amelyek szilárdan kapcsolódtak egymáshoz és nagy atipikus magokat tartalmaztak. Ezek a klaszterek nagy gyulladásos elváltozások mellett voltak, de egyértelműen eltértek a környező gyulladásos sejtektől (1a. Ábra, nyilak). Ezek a sejtek pozitívan festődtek az 5., 6. és 14. citokeratin esetében, és elfoglalták a tüdő nagy szomszédos területeit (1b. Ábra), míg az 1., 8. és 10. citokeratinok festése negatív volt (az adatokat nem mutatjuk be).

Pikkelyes sejtek krónikusan fertőzött MTB egerek tüdejében. a ) laphámsejt a genetikailag rezisztens (C3HeB/FeJ × B6.C3H-sstl) F2 hibrid egér tüdejében 15 hónappal az MTB fertőzés után. A tüdőszekciók festése hematoxilinnel és eozinnal (H&E). Nyilak - laphámsejtek csoportjai. Eredeti nagyítás - × 40, × 200 és × 600 (bal, középső és jobb oldali panelek). ( b ) Az F2 egér tüdőszövet immunhisztokémiai elemzése anti-citokeratin 5 (bal oldali panel), anti-citokeratin 6 (középső panel) és anti-citokeratin 14 (jobb oldali panel) antitestek alkalmazásával. Eredeti nagyítás - × 200. ( c ) A veleszületett B6.C3H-sst1 egér törzs tüdőszekciói, amelyeket az sst1 észlelt 5 hónappal az MTB aeroszolfertőzés után, kettős festés a citokeratin 6 esetében (bal és középső panel, eredeti nagyítás - × 40 és × 400) (illetve) és saválló mikobaktériumok (jobb oldali panel, × 400). ( d ) A B6.C3H-sstl egerek nekrotikus tüdőléziójával járó masszív fibrózis (nyilak). Trikrom színezés, eredeti nagyítás - × 40 és × 200, bal és középső panel. Jobb panel - a laphámsejtek nagy csoportja a tüdő tuberkulózis elváltozásában. H&E, eredeti nagyítás - × 400.

Teljes méretű kép

Továbbá megvizsgáltuk, hogy a B6.C3H-sst1 egerekben kialakult tipikus nekrotikus pulmonalis tuberkulózis elváltozások alacsony dózisú aeroszolos fertőzés után kialakultak-e laphámsejt diszpláziában. Öt hónappal az MTB-fertőzés után a citokeratin 6-pozitív sejtek nagy csoportjait találtuk a perifériás TB-elváltozások szélén (1c. Ábra, bal és középső panel), a szomszédos mycobacteriumokat tartalmazó központi nekrotikus régió mellett (1c. Ábra, jobb oldali panel)., jobb oldali panel) és masszív fibrotikus szövet vette körül (ld kép, bal és középső panel).

Mindkét kísérletünkben előzetes diagnózisunk az alveoláris sejtek laphámsejtes metapláziája volt, lehetséges malignus transzformációval.

A laphámsejtes metaplazia aránya genetikailag szabályozott

Összehasonlítottuk a metaplasztikus sejtek előfordulását a következő egér törzsek TB tüdőlézióiban: C3HeB/FeJ (TB-érzékeny törzs, amely az sst1 lokusz eredeti érzékelhető alléljét hordozza), sst1 kongén B6.C3H-sstl. (mérsékelt TB érzékenység) és C57BL/6J (rezisztens). Amint a 2. ábrán látható, alacsony dózisú virulens MTB-vel végzett aeroszolos fertőzés után ezek a törzsek különböznek túlélésükben (2a. Ábra), képességükben szabályozni az MTB proliferációját a tüdőben (2b. Ábra) és a tüdőgyulladás mértékében (2c. Ábra, 4. ábra). hónap a fertőzés után).). Az MTB-vel fertőzött egerek tüdejében laphámsejtek megjelenését figyelték meg citokeratin 6-specifikus antitestekkel történő immunfestéssel, lehetővé téve a laphámsejtek érzékenyebb azonosítását komplex TB-elváltozásokban. Ezt a technikát alkalmazva nem találtak laphámsejteket bármelyik törzs nem fertőzött egereinek tüdejében (nem látható).

Méretezett sejt metaplázia tuberkulózis fertőzés során MTB-rezisztens egér törzsekben. a ) A C3HeB/FeJ, B6.C3H-sstl és C57BL/6J egér törzsek túlélési görbéi az Erdman törzs 30-50 CFU MTB alacsony dózisú aeroszolos fertőzése után. ( b ) mikobakteriális terhelés a C3HeB/FeJ, B6.C3H-sstl és C57BL/6J egér törzsek tüdejében, tüdőhomogenátumok (CFU - telepképző egységek) alkalmazásával meghatározva. ( c ) a tüdő gyulladásos elváltozásai 4 hónappal az aeroszolos fertőzés után (H&E, kezdeti nagyítás - × 40 felső paneleknél; × 100 alsó paneleknél). ( d ) Cytokeratin 6 pozitív sejtek elemzése C3HeB/FeJ, B6.C3H-sst1 és B6 egerek tüdő tuberkulózis elváltozásaiban (bal, középső és jobb oldali panel) 4 hónappal a fertőzés után (eredeti nagyítás - × 100),

Teljes méretű kép

Asztal teljes méretben

Teljes méretű kép

Összességében az adataink azt mutatják, hogy a laphámsejtes metaplazia kialakulása a krónikus tuberkulózis-fertőzés gyakori jellemzője a tüdőben, míg a lépben és a májban a fertőzés egyetlen szakaszában sem társult laphámsejt az MTB-vel fertőzött sejtekhez (az adatokat nem mutatjuk be) ). ).

A pikkelyes sejtek metaplazái rosszindulatú transzformációt eredményeznek

Morfológiai kritériumok alapján a laphámsejtek metapláziája a fertőzés későbbi szakaszában SCC-képződéssé fejlődhet (1. ábra). A metaplasztikus elváltozásokhoz kapcsolódó sejtek proliferatív aktivitásának értékeléséhez foszforilezett hiszton-3-specifikus antitesteket használtunk, amelyek felismerik a mitotikus sejtmagokat (Hendzel és mtsai., 1997; Inagaki és mtsai., 1997; Preuss és mtsai., 2003). A fertőzés után 7 hónappal a 6-os citokeratin-pozitív sejtek tipikus klasztereihez szorosan kapcsolódó sejtek nagy része markáns nukleáris hiszton-3 festést mutatott (3b. Ábra). Ezt a C57BL/6J és a B6.C3H-sstl egerek metaplasztikus tüdőlézióiban figyelték meg (3b. Ábra, bal és jobb panel).

Mivel a C57BL/6J egerek 80% -ánál a fertőzés után 12 hónappal a laphámsejt metaplázia jelei mutatkoztak, némelyiküknél rosszindulatú transzformáció morfológiai jelei voltak (1. táblázat), a TB-elváltozások tüdejéből izolált sejtek átültetésével közvetlenül teszteltük e sejtek tumorigénes potenciálját szingenikus befogadók. Öt C57BL/6J egér tüdejéből készítettünk egysejtű szuszpenziót 12 hónappal az MTB-fertőzés után kollagenáz emésztéssel, és körülbelül 10 millió szeparálatlan tüdősejtet (egyenértékű egy tüdővel) injektáltunk egerekbe szubkután (öt állat) vagy intraperitoneálisan. (öt állat). Az egerek ivóvízben izoniazid (INH) anti-TB gyógyszert kaptak, hogy gátolják az MTB növekedését. 2-3 hónapos sejtranszfer után a tumor képződését 10 egérből 2-ben figyeltük meg, amelyek tüdősejteket kaptak, egy szubkután és egy intraperitoneális transzplantáció után. Kontrollként ugyanazon MTB-vel fertőzött egerek lépéből előállított egysejtű szuszpenziókat szingenikus recipiensekbe ültettünk át, és nem figyeltünk meg tumor kialakulást.

A szubkután daganatot egy másodlagos recipiensbe ültették át, aki 2 hónappal később egy nagy daganatot is kialakított a szubkután injekció beadásának helyén (3c. Ábra, bal felső panel). A mai napig összesen három passzust hajtottak végre kéthónapos időközönként, és sav-rezisztens mikobaktériumokat nem észleltek átültetett daganatokban. Az elsődleges tüdődaganatokhoz képest a transzplantálható tumor kevésbé differenciált morfológiát mutatott (3c. Ábra, bal alsó panel, H&E), és kevesebb citokeratin 6-pozitív sejtet tartalmazott (3c. Ábra, jobb oldali panelek). Így a szingenikus recipiensekbe történő átvitel után a krónikus TB tüdőelváltozásokból származó sejtek transzplantálható daganatot indukáltak, amelynek autonóm növekedéséhez nem volt szükség MTB-re.

A laphámsejtre hajlamosító tényezők vannak jelen a TB tüdőelváltozásokban

Azt is meg akartuk határozni, hogy a laphám-diszpláziaért felelős tényezők közül melyek lehetnek jelen a pulmonalis TB-elváltozások mikrokörnyezetében. Az SCC kialakulásában kritikusan ismert növekedési faktorok egyike az epiregulin, az epidermális növekedési faktor család erős tagja (Toyoda és mtsai., 1997). Megvizsgáltuk az epiregulin gén expresszióját a C57BL/6J egerek tüdejében az MTB fertőzés során az összes tüdőszövet mennyiségi RT-PCR-jével. Amint a 4a. Ábra mutatja, az epiregulin expressziója a fertőzés első 6 hónapjában alacsony volt, és 12 hónappal szignifikánsan felemelkedett, a laphámsejtes metaplázia és a carcinoma kialakulásával egyidejűleg.

Teljes méretű kép

Annak megállapítására, hogy az MTB-fertőzés indukálhatja-e az epiregulin expresszióját a makrofágokban, csontvelőből származó makrofágokat izoláltak a C57BL/6J (fekete sávok) és a B6. törzsből. MT3-tal fertőzött C3H-sst1 (fehér sávok) és in vitro kinetikai mRNS expressziós epiregulin kvantitatív RT-PCR-rel elemeztük. Amint a 4c. Ábra mutatja, az epiregulin mRNS uregregulációját figyelték meg a C57BL/6J és a B6.C3H-sstl törzsekben, 6 órával az MTB fertőzés után. Az epiregulin mRNS expressziójának kinetikája MTB-vel fertőzött makrofágokban azt sugallja, hogy expresszióját a makrofágok MTB-vel való kezdeti interakciója indukálta, feltehetően toll receptorokon keresztül.

Továbbá megvizsgáltuk, hogy az epiregulin in vivo expresszálódik-e a TB tüdőelváltozások makrofágjaiban. A makrofágok két populációját, az alveoláris és az interstitialis gyulladásos makrofágokat, izoláltuk a B6 egerek tüdejéből 12 hónappal az MTB fertőzés után. Az alveoláris makrofágokat bronchoalveoláris mosással, az interstitialis (granuloma) makrofágokat az interstitialis gyulladásos elváltozások kollagenázzal történő emésztésével izoláltuk. Mindkét populációban a makrofágokat dúsítottuk plasztikus tapadás céljából 2 órán keresztül, és a teljes RNS-izolálást minden további stimuláció nélkül végeztük. Az intersticiális makrofágok epiregulin mRNS-t expresszáltak, míg az alveoláris makrofágokban nem észleltek kimutatható epiregulin expressziót (4b. Ábra). Így in vivo az epiregulint gyulladásos makrofágok expresszálták pulmonalis TB elváltozásokban.

Amint a 4d. Ábra mutatja, az MTB-vel fertőzött makrofágok az indukálható nitrogén-oxid szintáz fő forrása a TB tüdőelváltozásokban (felső panelek). A reaktív oxigén és nitrogén fajok az oxidatív DNS károsodásának induktorai. Az MTB-vel fertőzött makrofágok közelében a nukleáris DNS károsodását tapasztaló sejtek felhalmozódásának értékelésére foszforilezett γ-hiszton2AX-re specifikus antitestekkel festettük meg a TB elváltozásokat, amelyeknek a magokban való megjelenése kettős szálú DNS-szünetekre utal (Bewersdorf et al., 2006) .; Nussenzweig és Paull, 2006). A Γ-H2AX festés azt mutatta, hogy a nem fertőzött sejtek bőséges punkciós magfestése vette körül az MTB-vel fertőzött makrofágokat. Ezek az adatok azt mutatják, hogy az MTB-vel fertőzött makrofágok kettős hatást gyakorolnak a közvetlen szomszédságukban lévő sejtekre, mivel DNS károsító szerek és a túlélés növekedési faktorainak forrásai.

Annak eldöntésére, hogy a magasabb mycobacterium-terhelés vagy egyéb tényezők felelősek-e a laphámsejt-diszplázia gyorsabb kialakulásáért a B6.C3H-sstl egerek tüdejében, anti-mycobacterial kemoterápiát alkalmaztunk INH-val a baktériumok növekedésének ellenőrzésére. A betegség két hónapos periódusa után 3 hónapig INH-t adtak be. Az INH-kezelés kezdetén a veleszületett B6C3H-sst1 egerek tüdõjében nekrotikus elváltozások és mintegy 500-1000-szer nagyobb baktériumterhelés kialakulását figyeltük meg, amelyek az sst1 szempontjából elfogadhatatlanok. Jelenleg azonban nem észleltek laphámsejteket a tüdőben. Az INH terápia a B6.C3H-sst1 egerek szerveinek baktériumterhelését akár 500-szorosára is csökkentette, a normálistól a kezeletlen C57BL/6J egereknél megfigyelt szintig. Ennek ellenére a citokin 6-pozitív metaplasztikus sejtek könnyen detektálhatók a három B6C3H-sstI egér közül kettőben (5. ábra). Az egyik állatban a metaplázia előrehaladott stádiumát figyeltük meg az MTB-vel fertőzött makrofágok nagy csoportjaival szomszédságában (5a-c. Ábra, bal oldali 2 panel, 1. egér). Eközben egy másik egér tüdeje a metaplázia egy korábbi szakaszát jelentette a citokeratin 6-pozitív sejtek kis csoportjaival, amelyek gyulladásos szövetekhez kapcsolódnak, amelyek nem tartalmaznak saválló rezisztens bacillusokat (5a-c. Ábra, jobb oldali panelek).

A pulmonalis tuberkulózis elváltozásaihoz társuló pikkelyes sejtek diszpláziája izoniaziddal (INH) végzett antimikobakteriális kemoterápia után. A C57BL/6J és a B6.C3H-sstl kongén egereket 50 000 CFU MTB-vel fertőzték meg. 2 hónapos fertőzés után az állatok INH-t kaptak ivóvízben (0,1 mg/ml) további 3 hónapig. Az állatokat 7 nappal az INH kemoterápia befejezése után feláldoztuk. A B6.C3H-sstl egerek tüdőjének baktériumterhelése a kezelés után 5x104 (2. egér) és 20x104 CFU (1. egér) között mozgott. Abban az időben az MTB a kimutatási szint alatt volt (