metiltranszferáz

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • A chaetocin javította a prognózist szívelégtelenségben szenvedő Dahl-sóra érzékeny (DS) patkányokban
  • A kaotocin helyreállította a szívelégtelenséghez kapcsolódó mitokondriális gének szabályozását
  • A chaetocin javította a mitokondriális légzést és növelte a kudarcot szenvedő szívek mitokondriális tartalmát
  • A szívelégtelenség növelte a H3K9me3 szintjét a visszatérő elemeken, és ez a hatás megfordult a chaetocin kezelés után.
  • A chaetocin csökkentette a H3K9me3 szintjét az intron Pgcla ismétléseken
  • A chaetocinnal megfordított, ismétlődő H3-up H3K9me3 lokuszok GO-analízise
  • vita
  • Anyagok és metódusok
  • Állatok és gyógyszerszállítás
  • Vérnyomás és echokardiográfiai vizsgálatok
  • Morfometrikus elemzés
  • Valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakció (PCR)
  • DNS mikroarray
  • Forgács
  • szekvenálás
  • A H3K9me3 szint változása az ismétlődő elemeken
  • A szív mitokondriumainak izolálása
  • Mitokondriális oxigénigény
  • Mitokondriális fehérjék és DNS tartalma
  • Statisztikai analízis
  • Adattárolás
  • További részletek
  • További információ
  • PDF fájlok
  • További információ
  • Hozzászólások

elemeket

  • Szívroham
  • A hiszton transzláció utáni módosításai

absztrakt

A hiszton-acetiláció a szív hipertrófiájához és szívelégtelenségéhez kapcsolódik. A hiszton-metiláció változásainak kóros következményeit és a hiszton-metil-transzferáz inhibitorokkal végzett beavatkozások szívelégtelenségre gyakorolt ​​hatásait azonban nem sikerült teljesen tisztázni. A szív H3K9me3 állapotára összpontosítottunk, és megvizsgáltuk a hisztetin inhibitor H3K9 metiltranszferáz chaetocin hatásait a Dahl sóérzékeny patkányok prognózisára, a krónikus szívelégtelenség állatmodelljére. A chaetocin meghosszabbította a túlélést és helyreállította a mitokondriális diszfunkciót. A ChIP-seq elemzés azt mutatta, hogy a krónikus szívterhelés több ezer ismétlésben indukálta a H3K9me3 növekedését, beleértve a mitokondriális rokon gének intronrégióit, például a peroxiszóma proliferátor által aktivált gamma-alfa-receptort kódoló gént. Ezenkívül a chaetocin megfordította ezt a hatást ezeken az ismétlődő helyeken. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a mitokondriális gének ismétlődő elemeinek túlzott heterokromatinizációja egy kudarcot szenvedő szívben géncsendesedéshez és a szívműködés károsodásához vezethet. Így a chaetocin potenciális terápiás szer lehet krónikus szívelégtelenség esetén.

A szívelégtelenség az egyik vezető halálok világszerte 1, 2. Bár a renin-angiotenzin-aldoszteronra és az adrenerg idegrendszerre irányuló meglévő szívelégtelenségi terápiák hatékonyak 3, 4, 5, 6, 7, a szívelégtelenség okozta halálozás továbbra is magas 1, 2, 8. A hatékonyabb terápiás stratégia kidolgozásához új ismeretekre van szükség a betegség hátterében álló mechanizmusokról. A mitokondriumokat és az anyagcsere-funkciókat a szívelégtelenség kezelésére irányították, mivel elengedhetetlenek a szívizom energiatermeléséhez, a sejtek redoxpotenciáljához, a reaktív oxigénfajokhoz (ROS), a mitokondriumoktól függő apoptózishoz, a kalcium homeosztázishoz, valamint a zsírsavak és a glükóz anyagcseréjéhez.

A patológiás hipertrófia és a szívelégtelenség számos gén 9, 10, 11, 12, 13 megváltozott expressziójával jár. Asakura és mtsai. megállapítja, hogy sok szívelégtelenségi gén vesz részt a mitokondriális működés, az oxidatív foszforiláció és az extracelluláris jelátvitel útjában14. Az epigenetikus változások fontos szerepet játszanak a transzkripciós tevékenység szabályozásában. A hiszton módosítások megváltoztathatják a kromatin szerkezetét, hogy befolyásolják a transzkripciós faktor DNS-hez való hozzáférését és a transzkripciós komplexek toborzását a gén promoter/enhancer régiókba 15. A hiszton-acetilezés és a dezacetilezés közismerten szerepet játszanak a szív hipertrófiájának és szívelégtelenségének kialakulásában 16, 17. Ezenkívül a hiszton-deacetiláz (HDAC) aktivitásának gátlása megakadályozza a szív átalakulását 18. A HDAC-gátlók valószínűleg sok hatásmechanizmussal rendelkeznek 19, ideértve a 20, 21, a 21. autofág, a 23 apoptózis, a 24, a 25, a 25, a 25, a 25, a 25, a 25 gyulladásokat és a 25 a 27 .

Korábban kimutattuk, hogy a lizin 9 hiszton H3 trimetilációjának (H3K9me3) és a lizin 4 hiszton H3 trimetilációjának (H3K4me3) kromoszómaeloszlása ​​eltér a normál és a szívelégtelenség hiszton acetilációjának megoszlásától a szívelégtelenség állatmodelljeiben 29. További bizonyítékok arra utalnak, hogy a lizin 4 (K4), a K9 vagy a K36 hiszton H3 hiszton-metilezése részt vesz a szív 30, 31, 32, 33 átalakításában. Ezért mind a hisztonmetilezés, mind a hisztonacetilezés terápiás célpontként működhet a szívelégtelenség kezelésében.

A H3K9me3 heterokromatin képződéssel társul, és a pericentromere és telomer régióinak meghatározásához 34 szükséges. A H3K9me3 szintjének változása a különféle genomi helyeken, beleértve a műholdas ismétléseket és az ismétlődő transzponálható elemeket, szintén összefügg a rákra és a stresszre adott válaszokkal, 35, 36. Azonban sem a H3K9me3 szerepét egy meghibásodott szívben visszatérő lókuszokban, sem a hiszton-metil-transzferáz inhibitorok hatását szívelégtelenségben nem sikerült tisztázni.

Ezért ebben a tanulmányban megvizsgáltuk a H3K9 trimetiláció állapotát ismétlődő elemeken egy hibás szívben, és feltételeztük, hogy a H3K9 trimetiláció állapotát befolyásoló hisztont módosító enzim fontos szerepet játszhat a szívelégtelenségben. Az SU (VAR) 3-9 egy enzim, amely katalizálja a H9 hisztonban lévő K9 átalakulását a dimetilezett formából a trimetilezett formába. A chaetocin, egy természetes kismolekula, amelyet a Chaetomium 37 faj gombái termelnek, az SU (VAR) 3-938 inhibitora. Így azt vizsgáltuk, hogy ez a H3K9 metiltranszferáz inhibitor blokkolja-e a szívelégtelenség progresszióját állatmodellben. Ebben a tanulmányban bebizonyítottuk, hogy a chaetocin késleltette a hipertrófiáról a szívelégtelenségre való átmenetet, helyreállította a kudarcot szenvedő szívekben a mitokondriális diszfunkciókat és meghosszabbította az állatok túlélését.

az eredmény

A chaetocin javította a prognózist szívelégtelenségben szenvedő Dahl-sóra érzékeny (DS) patkányokban

Bár a mitokondriális DNS-tartalom nem különbözött a kontrollcsoport és a HF-csoport között, a chaetocin-kezelést követően a mitokondriális DNS-tartalom jelentős növekedését figyelték meg (2C. Ábra). A mitokondriális biogenezisben és az energiatermelésben fontos szerepet játszó, peroxiszóma proliferátorral aktivált gamma receptor, a koaktivátor 1 alfa (Pgcla) kódoló gén expressziója a chaetocin beadása után jelentősen megnőtt (2D. Ábra). Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a chaetocin javította a mitokondriális légzést, amelyet a megnövekedett mitokondriális DNS-tartalom és a Pgcla-expresszió közvetített a sikertelen szívekben.

A szívelégtelenség növelte a H3K9me3 szintjét a visszatérő elemeken, és ez a hatás megfordult a chaetocin kezelés után.

A H3K9me3 állapotának vizsgálatához az egész genomban, ideértve a szívben ismétlődő elemeket is, kromatin immunprecipitációt (ChIP) végeztünk, hogy elemezzük a H3K9me3-t sikertelen LV-ben mutató szekvenciákat chaetocin-kezeléssel vagy anélkül. Az ismétlődő elemekhez társuló 6550 lókusznál a szívelégtelenség növekedést okozott a H3K9me3 összehangolásban a kontrollokhoz képest. Ezeket az elemeket "HF-up" -ként definiáltuk. A HF-up lókuszok kilencvenkilenc százaléka, vagyis a 6534 ismétlés a chaetocin kezelésre adott válaszként a H3K9me3 megfelelő csökkenését mutatta. Ezzel szemben 335 lókuszon a H3K9me3 igazodás csökkenését figyeltük meg a nem megfelelő szívben, összehasonlítva a kontroll csoportok csökkenésével. Ezeket az elemeket "HF-down" -ként definiáltuk. Az inhibitorok beadása megfordította ezt a hatást ezen HF-lokuszok 10,4% -ában, azaz 35 ismétlésben (3A. Ábra). Így a HF növelte a H3K9me3 szintjét az ismétlődő elemeken, és a chaetocin a várakozásoknak megfelelően megváltoztatta a H3K9me3 szintet ezeken a lokuszokon a szívszövetekben található H3K9 metiltranszferáz gátló aktivitás alapján.

( A ) Azon ismétlődő elemek száma, amelyeknél a szívelégtelenség növekedést (HF-up) vagy csökkenést (HF-down) okozott a H3K9me3-ban a kontrollokhoz képest (balra). A H3K9 trimetiláció százalékos visszanyerése chaetocin kezelés után (jobbra). ( B ) H3K9me3 szintek a Pgcla intronismétlődő régióiban. A piros négyzetek azt a területet jelzik, amelyet gazdagnak találtak a H3K9me3 ismétlődése szempontjából szívelégtelenségben szenvedő patkányokban. A fekete dobozok ismétlődő helyeket jelölnek. Az oszlopok a H3K9me3 ismétlődő elemek olvasási beállítását jelzik. RPM, millióra mért érték.

Teljes méretű kép

A chaetocin csökkentette a H3K9me3 szintjét az intron Pgcla ismétléseken

Ebben a tanulmányban a RefSeq gének közvetlen közelében lévő genomi régiókra összpontosítottunk. Két ismétlődő lókusz a Pgcla intronban a H3K9me3 megemelkedett szintjét mutatta a nem megfelelő szívben, és ezt a hatást chaetocin kezeléssel elnyomták (3B. Ábra). Más megismételt helyek, amelyek a H3K9me3 megemelkedett szintjét mutatják a meghibásodott szívben, több olyan genomi régiót tartalmazott, amelyek a mitokondriális gének közvetlen közelében helyezkedtek el. Például a következő génrégiókat azonosítottuk: Acyl-CoA dehidrogenáz intron, középlánc, Acadm (4A. Ábra); a NADH-ubiquinone oxidoreductase 4, Ndufs4 Fe-S fehérjének két intronrégiója (4B. ábra); és az intron régió a hexaprenil-dihidroxi-benzoát-metil-transzferázhoz, mitokondriális prekurzor, Coq3 (2. kiegészítő ábra). A H3K9me3 epigenetikai profiljával összhangban az Acadm és az Ndufs4 mRNS-szintje kölcsönösen a legalacsonyabb volt a hibás szívben, valós idejű kvantitatív PCR-rel meghatározva. Bár a Coq3 mRNS gyógyulása nem volt szignifikáns a kezelés során, a kudarcot szenvedő szívben a kontroll szívhez képest megnövekedett H3K9me3 szint hozzájárulhat a Coq3 expresszió csökkenéséhez. .

Spekulálunk továbbá arra, hogy a H3K9me3 teljes változása, a Pgc1 ismétlődő elemek chaetocinra adott válasza és a Pgc1a génexpresszió kevésbé helyreállítása közötti különbség magyarázható a H3K9me3 és más epigenetikai változások előfordulásával a hipertrófia progressziója és fejlődése során. szívroham. Például hiszton-dezacetilezés és DNS-metilezés történhet a promoter régióban. A HDAC inhibitor további beadása hatékonyabb lehet az mRNS expressziójának az alapszintre történő visszaállításában.

Anyagok és metódusok

Állatok és gyógyszerszállítás

Ebben a vizsgálatban az összes állatkísérletet a Keio Egyetem Állatgondozással és -használattal foglalkozó intézményi bizottság hagyta jóvá (09088), és a Keio Egyetem állatkísérletekkel kapcsolatos intézményi irányelveinek megfelelően hajtották végre. Öt hetes hím DS patkányokat vásárolt a Sankyo Labo Service Corporation, Inc. (Tokió, Japán). A patkányokat négy csoportra osztottuk: kontroll [normál sótartalom, amely 0,3% NaCl-ot tartalmaz, NS (-)], normál sót chaetocinnal [0,25 mg/kg kaotetin (Sigma-Aldrich Co. LLC., St. Louis), MO, USA ), NS (ch +)], HF [8% NaCl-t tartalmazó magas sótartalmú étrend, HS (-)] és kezelés [magas sótartalmú étrend 0,25 mg/kg kaotetin, HS (ch +)] csoportokkal, a kaotocint dimetil-szulfoxidban oldottuk (DMSO). A kezelt csoportba tartozó patkányoknak hetente kétszer 0,25 mg/kg kaotetint adtak intraperitoneálisan, 6 hetes koruktól 13 hetes korig, az előzőekben leírtak szerint 46. Az állatokat leöltük, és a szöveteket minden kísérlethez megfelelően tároltuk.

Vérnyomás és echokardiográfiai vizsgálatok

A vérnyomásszinteket 5, 8, 10 és 13 hét múlva farok mandzsetta módszerrel (BP-98 AL; Softron, Tokió, Japán) mértük. A 13 hetes patkányok szívét echokardiográfiával értékeltük VisualSonics (Vevo 2100; VisualSonics Inc.) alkalmazásával. A vérnyomásmérés és az echokardiográfiai értékelés részletes eljárásait a kiegészítő módszerek tartalmazzák.

Morfometrikus elemzés

A szívszövetet formalinban rögzítettük, paraffinba ágyazottuk és 5 μm vastag szakaszokra vágtuk. A metszeteket hematoxilin-eozinnal vagy EvG-vel és picrosirius vörös-vel festettük a morfológia vizsgálatához és a szívfibrózis azonosításához. A kollagén rostok mennyiségének értékeléséhez metszeteket figyeltünk meg fluoreszcens mikroszkóppal (BZ-9000; KEYENCE Japan Inc. Osaka, Japán). A fibrotikus térfogat frakciót úgy értékeltük, hogy a teljes fibrotikus területet (a sejtszámláló rendszer által kiszámítva) elosztottuk a teljes LV térfogattal, szorozva 100.

Valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakció (PCR)

Kétláncú cDNS-t szintetizáltunk 2 μg RNS-ből, és PCR-nek vetettük alá TaqMan Universal PCR Master Mix-szel (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) és előre megtervezett génspecifikus primerekkel és próbákkal (TaqMan Gene Expression Assays: Applied Biosystems) . A valós idejű kvantitatív PCR-re vonatkozó részletes eljárásokat a kiegészítő módszerek tartalmazzák.

DNS mikroarray

Az RNS-t szívműködési patkányok LV-mintáiból nyertük ki mirVana (Applied Biosystems) alkalmazásával, a gyártó utasításainak megfelelően. Az egyes csoportokban véletlenszerűen kiválasztott három mintából származó RNS keverékét használtuk a genom expressziójának elemzéséhez a teljes genomban Rat Oligo chip 20 K (TORAY) alkalmazásával. A gén ontológiai elemzést a GeneCodis3 (// genecodis.cnb.csic.es/) 47, 48, 49 alkalmazásával végeztük. .

Csoportonként egy gramm LV-szövetet alkalmaztunk ChIP-re 25 μg antitesttel (trimetilezett K4 hiszton H3 [# 8580; Abcam, Tokió, Japán) vagy trimetilezett K9 hiszton H3-val [# 07-442; Millipore, Temecula, Kalifornia, USA]) vagy 1 μg nyúl IgG (# 2729; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). A ChIP részletes eljárásait a Kiegészítő módszerek tartalmazzák. Csak a trimetilezett K9 hiszton H3 elleni ChIP eredményeket közöljük ebben a cikkben.

szekvenálás

A kicsapódott DNS-fragmensek mintáit a szekvenciaelemzés előtt tovább fragmentáltuk (HiSeq 2000). Az egyes csoportokból származó kromatin immunprecipitált (ChIP'd) genomi DNS-t és az input DNS-t szekvenáltuk a gyártó utasításai szerint (Illumina). Az olvasási igazításról további részletek a kiegészítő módszerekben találhatók.

A H3K9me3 szint változása az ismétlődő elemeken

Összehangoltuk a H3K9me3-ChIP'd értékeket a genomi tulajdonságokkal az rn4 patkánygenom és az UCSC RepeatMasker által készített patkányismétlések adatbázisának összeállításával. Ha az ismétlődő elemek és a szekvenált adatok között átfedő nukleotidok számának és az ismétlődő elemek vagy a szekvenált leolvasás minimális nukleotidszámának az aránya legalább 90% volt, akkor azt "átfedésnek" tekintettük. Ismétlődő elemeken a H3K9me3-tal dúsított régiókat azonosítottuk, amelyek százszoros különbségeket mutatnak a H3K9me3-ban az input DNS-hez képest.

A szív mitokondriumainak izolálása

A mitokondriumokat frissen izoláltuk a 13 hetes szívből, az előzőekben leírtak szerint 50. További részletek a kiegészítő módszerekben találhatók.

Mitokondriális oxigénigény

A mitokondriális oxigénfogyasztást (mitokondriális légzés) Clark O2 elektróddal mértük a Meter Model 781 oxigén és a Mitocell MT200 zárt légzőkamrával (Strathkelvin Instruments) 37 ° C-on, az 50, 51 korábban leírtak szerint. További részletek a kiegészítő módszerekben találhatók.

Mitokondriális fehérjék és DNS tartalma

A mitokondriális frakciók fehérjekoncentrációit BCA fehérje vizsgálatokkal mértük. A szívből izolált mitokondriális DNS-t kvantitatív, valós idejű PCR-rel elemeztük egy Real Time System Thermal Cycler Dice TP800 (Takara Bio Inc., Shiga, Japán) alkalmazásával. Valamennyi mintát normalizáltuk a genomi DNS-tartalom szempontjából. Az egyes PCR-ek primer- és próba-szekvenciáit a 2. kiegészítő táblázat tartalmazza.

Statisztikai analízis

A különböző csoportokban lévő patkányok kumulatív túlélési arányait log-rank tesztekkel hasonlítottuk össze. Az összes eredményt átlagként és szórásként (SD) mutatjuk be. A statisztikai összehasonlításokat egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) végeztük Bonferroni utáni korrekciókkal az 1A-D és 4 ábrákon, valamint post-hoc Dunnett korrekciókkal a 2B-D ábrákon.

Adattárolás

A microarray és a ChIP-seq adatokat a GEO GSE66617 és GSE69194 csatlakozási szám alatt tárolja.

További részletek

Hogyan lehet idézni ezt a cikket: Ono, T. és mtsai. A hiszton 3 lizin 9 metiltranszferáz inhibitor chaetocin javítja a magas sótartalmú étrend által kiváltott szívelégtelenség patkány modelljében a prognózist. Sci. ismétlés. 7, 39752; doi: 10, 1038/srep39752 (2017).

Kiadói megjegyzés: A Springer Nature továbbra is semleges a joghatósági igényekkel kapcsolatban a közzétett térképeken és intézményi szövetségekben.

További információ

PDF fájlok

További információ

Hozzászólások

Megjegyzés benyújtásával elfogadja az Általános Szerződési Feltételeinket és a közösségi irányelveket. Ha bármi sértőnek vagy összeegyeztethetetlennek tűnik a feltételeinkkel vagy irányelveinkkel, jelölje meg nem megfelelőként.