Új megközelítések a lizoszomális betegségek diagnosztizálásához a vizeletben lévő szabad oligoszacharidok meghatározása alapján

Absztrakt:

A lizoszomális betegségek diagnosztizálása erősen személyre szabott megközelítést igényel, mivel ezek a betegségek az örökletes anyagcserezavarok széles skáláját fedik le, különböző molekuláris alapokkal. A hagyományos módszerek mellett gyors és ígéretes alternatívává válik a betegek vizeletében a szabad oligoszacharidok strukturális elemzése a MALDI TOF/TOF tömegspektrometriával. Ezzel az új diagnosztikai megközelítéssel pontosan meghatároztuk a vizeletben található szabad oligoszacharidok reprezentatív profilját, jellemzően a glikokonjugátum metabolizmusának bizonyos rendellenességeire.

diagnosztizálásának

Kulcsszavak: diagnosztika, glikogenózis, lizoszomális betegségek, MALDI TOF/TOF

* A cikk részét képező összes táblázat, grafikon és ábra a tanulmány végén található csatolt PDF fájlban található.

Bevezetés

Annak a becsült feltételezésnek az ellenére, hogy Szlovákiában legfeljebb 300 000 ember szenved ritka betegségekben (1), e betegségek molekuláris jellege sokszor egyedülálló, ezért diagnózisuk maximálisan személyre szabott megközelítést igényel. A lizoszomális tárolási rendellenességek (LSD) a ritka örökletes anyagcsere-betegségek széles csoportját alkotják, amelyeken belül felosztjuk őket:

A.) a glikánok és glikoproteinek hasadásának és lebontásának rendellenességei (pl. Alfa- és béta-mannosidosis, szialidózis), glikolipidek (pl. GM1 gangliozidózis, Gaucher és Fabry-kór), glikozaminoglikánok (pl. MPS I-III) és mukopoli-szacharidok (pl. MPS) IV), B.) a lipidek hasadásának és lebontásának rendellenességei - a szfingolipidek (pl. Niemann Pick A vagy B típus) és a triacilgliceridek, C.) a fehérje lebontásának rendellenességei és D. ) (2).

Az egyes LSD-k a nem lebomlott termékek felhalmozódásával járnak a szövetekben és a glikokonjugátumok a vizeletben a lizoszómális lebontó enzimek (hidrolázok) elégtelen aktivitása miatt. Néhány közülük, pl. a szabad oligoszacharidok (FOS) a betegségre jellemző jellemzőkkel rendelkeznek. Az FOS gyors, pontos és nem invazív diagnosztikai módszerrel mutatható ki - a tandem tömegspektrometria MALDI-TOF/TOF, amely pontosan meghatározza a vizeletben felhalmozódott oligoszacharidok szerkezeti összetételét, és alternatívája a hagyományos szűrési technikáknak, például a vékonyréteg-kromatográfiának ( TLC): a mintában jelenlévő FOS mobilitásának összehasonlítása 1-9 hexóz egységet tartalmazó oligoszacharidok standard keverékével. Ez a módszer megfelelő kezdeti szűrési megközelítés, határhatár esetén, ill. Pozitív eredménnyel azonban elengedhetetlen a megfigyelt profil további jellemzése. A nagy áteresztőképességű MALDI TOF/TOF elemzés megfelelő alkalmazás annak megkülönböztetésére, hogy a kumulatív FOS az étrendből származik-e, vagy kóros, specifikus metabolitokból áll-e.

Az LSD betegségeket a multisystem klinikai tünetek jellemzik, tartósan előrehaladva, a nem lebomlott szubsztrát tartós felhalmozódása miatt. Egyes tünetek kezdetben jelentéktelennek tűnhetnek, ill. jellemző egy másik vagy gyakoribb betegségre (pl. hányás, hipoglikémia, hipotenzió, letargia, görcsök, süketség, általános boldogulási kudarc, pszichomotoros retardáció), és bármely életkorban előfordulhat, a magzattól a szenilisig. Az LSD együttes előfordulása legfeljebb 1: 5000 élveszületés (3), ezért korai és megbízható diagnózisuk alapvető tényező a betegek és családjaik életében. A Szlovák Tudományos Akadémia Kémiai Intézetének Glikobiológiai Tanszéke a pozsonyi NÚDCH Örökletes Metabolikus Rendellenességek Központjával együttműködve bevezette és optimalizálta a vizeletmentes oligoszacharidprofilok analitikai módszerét, amely nagy pontossággal, specifikussággal, érzékenységgel rendelkezik és a kezdeti diagnosztikai megközelítés mellett alkalmazzák.a terápia hatékonyságának monitorozása esetén is.

Anyag és módszer

Különböző lizoszómás betegségekben (béta-mannosidosis, alfa-mannosidosis, különféle típusú mukopoliszacharidózisok, mucolipidosis, I és II típusú gangliosidosis, sialidosis) és glycogenosis II-ben szenvedő betegek vizeletmintái. típusú (Pompe-kór), ill. egészséges fiziológiai egyedektől negatív kontrollként -20 ° C-on tároltuk a feldolgozásig. Az oldhatatlan üledék eltávolítása után a híg vizeletet liofilizáltuk, és az így megszárított mintákat permetilezéssel (PerMe) derivatizáltuk jód-metánnal bázikus NaOH-ban, majd a felesleget kloroformmal végzett extrakcióval eltávolítottuk. Szárítás után az előállított PerMe FOS-ot 50% metanolban oldjuk és MALDI lemezre viszünk 1: 1 arányban 2,5-dihidroxi-benzoesav-mátrixszal. A PerMe FOS elemzést tandem tömegspektrométeren (UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF, Bruker Daltonics, MA, USA) reflektron pozitív ion módban végeztük. A mért spektrumok posztanalitikai értelmezését a GlycoWorkbench és a ProteinScape 3.0 szoftverek dolgozták fel.

Az eredmények

A kiválasztott 7 LSD-k vizeletprofilját permetilezett FOS elemzésével határoztuk meg. Számos standard szabad oligoszacharidot figyeltünk meg a kontrollminták (egészséges kontrollok) FOS-spektrumában, amelyek minden korcsoportban jelen vannak, különösen a m/z 838,40, 879,43, 1240,61 és 1274,62. Az anyatejből származó specifikus FOS-t megerősítették az anyatej újszülöttkori spektrumaiban. Az FOS-profilelemzések eredményei összhangban vannak az irodalomban publikált adatokkal (4,5).

A reprezentatív LSD profilok FOS (1. kép), A betegek vizeletében lévő permetilezett oligoszacharidok MALDI TOF/TOF-analízisével kapott tipikus oligoszacharid-összetétel a diszfunkció vagy a specifikus lizoszomális hidrolázok alacsonyabb aktivitása következtében alakul ki:

Vita

LSD-betegek 7 referencia mintájának vizeletében a szabad oligoszacharidok tömegspektrometriával (MALDI TOF/TOF) történő elemzése azonosította a jelenlévő oligoszacharidok szerkezeti összetételét. Az oligoszacharidok pontos szerkezetének meghatározása az alkalmazott szűrési technikákkal együtt hatékony és gyors módszer a kiválasztott lizoszomális betegségek diagnosztizálásában az ezt követő molekuláris genetikai elemzés előtt. Előnye a nagy érzékenység és pontosság mellett az egyszerű automatizálás feltételezésében rejlik, 96 és több kút formátumban, amely teljes területű vagy újszülöttes szűrés esetén használható.

Az e betegségek betegmintáiban található szabad oligoszacharidok profiljának elkészítése és létrehozása a minták elérhetőségétől függ. Jellemezzük specifikus szabad oligoszacharidok jelenlétét hét genetikailag igazolt LSD-betegség vizeletében, amelyet a Pozsonyi Örökletes Metabolikus Rendellenességek Központja (NÚDCH) kapott. Nemzetközi adatbázisokból számos más LSD referenciaspektrumot ismerünk, pl. fukozidózis, aszpartil-glükózaminuria, Gaucher-kór és mások esetében (4,5). Mivel ezek nagyon ritka betegségek, a referencia FOS-profilok hozzáadásának lehetősége korlátozott a diagnosztizált LSD-betegek számától függően. Például Szlovákiában a mai napig nincs fukozidózisban szenvedő beteg. A folyamatosan fejlődő, megbízható szűrővizsgálatokkal és a betegek korai felismerésével azonban mind a 60 LSD-betegség FOS-profilja fokozatosan hozzáadódik, és részletes tanulmány készül, amely az életkor, a betegség progressziója függvényében megvitatja a FOS-profilok eredményeit is, stb. Az orvosok és a tudományos laboratóriumok közötti együttműködés hozzájárul a kétértelmű, ill. határértékek az LSD gyanújának szelektív szűrésében.

Következtetés

A vékonyréteg-kromatográfia (TLC) jelenleg az elsődleges és standard módszer a vizeletben lévő szabad oligoszacharidok elemzésére a klinikai laboratóriumokban. A TLC korlátozza a vizsgálatok specifitását és érzékenységét, és nem biztosítja a FOS oligoszacharidok strukturális elemzését, amely gyakran szükséges a lizoszómás betegségek diagnosztizálásához. Számos LSD betegség és kontroll vizeletminta sorozatában MALDI TOF/TOF tömegspektrometriás módszereket alkalmaztunk, és kiválasztott altípusokra meghatároztuk a domináns oligoszacharidok szerkezetét. A bemutatott módszer jelentős előnyt jelent az LSD diagnosztizálásában, felgyorsítja a döntéshozatali diagnosztikai folyamatot, és Szlovákiában jelenleg elérhető a fenti lizoszomális betegségek egyikének gyanújával küzdő betegek számára.

Összeférhetetlenség: A szerzők kijelentik, hogy nincsenek összeférhetetlenségük, és ugyanakkor őszintén kijelentik, hogy a mű nem jelent meg egy másik folyóiratban.

Köszönetnyilvánítás: Ezt a munkát a Szlovák Köztársaság Egészségügyi Minisztériuma támogatta a 2019/7-CHÚSAV-4 lajstromszámú projekt és a támogatás sz. 2/0130/18 Szlovák Tudományos Támogatási Ügynökség VEGA.

Mukolipidosis ML2 (GNPTAB) - különböző FOS-ok felhalmozódása változó terminális monoszacharidokkal - mannóz, galaktóz vagy sziálsavak figyelhetők meg a spektrumban egyes lizoszómás hidrolázok, szialidázok, béta-galaktozidázok vagy alfa-mannozidázok, GlcNAc-foszfotranszferáz (GNTP) termékeket használó enzimek elégtelen működése miatt.