vastagbél

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • Betegek és módszerek
  • Biológiai mintavétel
  • A CD és az ITB diagnosztikai kritériumai
  • Mintakészítés iTRAQ jelöléshez és erős kationcserélő kromatográfiához
  • A fehérjék azonosítása és mennyiségi meghatározása
  • Bioinformatikai elemzés
  • immunhisztokémia
  • az eredmény
  • Proteomikai kísérletek
  • Differenciális fehérje expresszió az ITB-ben szenvedő betegek makroszkóposan érintett vastagbél nyálkahártyájában a kontroll biopsziákkal összehasonlítva
  • Differenciális fehérje expresszió CD betegek makroszkóposan érintett vastagbél nyálkahártyájában a kontroll vastagbél biopsziákhoz képest.
  • Differenciális fehérje expresszió CD és ITB betegek makroszkopikusan érintett vastagbél nyálkahártyájában
  • Bioinformatikai elemzés
  • A differenciálisan expresszált fehérjék validálása immunhisztokémiai módszerekkel
  • vita
  • További részletek
  • Hozzászólások

elemeket

  • Crohn-betegség
  • Colitis ulcerosa

absztrakt

A klinikai proteomika legújabb fejleményei miatt ezt a technikát alkalmaztuk olyan biológiai markerek azonosítására, amelyek megkülönböztethetik az ITB-t a CD-től. A proteomika ígéretes technológia, és a gyulladásos bélbetegség (IBD) által okozott biológiai folyamatok megértésére szolgál 15. Mivel mind az ITB, mind a CD először a bélnyálkahártyán jelenik meg, a két betegség nyálkahártya-proteomjának összehasonlítása segíthet azonosítani a differenciálisan expresszált fehérjéket, azok lehetséges hálózatait és a két betegség kialakulásában szerepet játszó kölcsönhatásokat. A proteomikus megközelítést már alkalmazták a kolloidok különböző formái közötti különbségek kimutatására és a 16, 17, 18, 19, 20 betegségaktivitás biomarkereinek vizsgálatára. A proteomikát a tuberkulózis kutatás területén is alkalmazzák a biomarkerek felkutatásában 21. Ezt a technológiát még nem vizsgálták olyan potenciálisan hasznos markerek azonosítására, amelyek segíthetnek megkülönböztetni az ITB-t a CD-től.

Ebben a tanulmányban elemeztük és összehasonlítottuk az ITB-vel és CD-vel rendelkező betegek gyulladásos nyálkahártya-proteomját. A két feltétel proteomjának összehasonlításához a két betegség megkülönböztetésére szolgáló potenciális biomarkerek azonosításához izobár jelölési technológiát alkalmaztunk a relatív és abszolút mennyiségi meghatározáshoz (iTRAQ), majd kétdimenziós folyadékkromatográfiát és tandem tömegspektrometriát.

Betegek és módszerek

CD-ben és ITB-ben szenvedő betegeket az Új-Delhi Gasztroenterológiai Klinika All India Orvostudományi Intézetéből vettek fel. Ezt a tanulmányt intézményünk Etikai Bizottsága hagyta jóvá. A vizsgálatot az Indian Council for Medical Research/Good Clinical Practice irányelveinek megfelelően végezték el. A vizsgálat minden résztvevőjétől tájékozott és írásbeli beleegyezést kaptak.

Elvégeztük a betegek teljes értékelését, beleértve klinikai, endoszkópos, radiológiai és szövettani jellemzőket. A múltban a tuberkulózis kezelés bevitelének részleteit dokumentálták. A vastagbél (polietilénglikol) előkészítése után minden páciens kolonoszkópiás (és esetleg retrográd ileoszkópos) vizsgálaton esett át videokolonoszkóp segítségével. Míg legfeljebb 30 beteget vettek fel, és biopsziájukat -80 ° C-on tartották, csak azok a betegek, akiknek a nyomon követése teljes volt, és az ITB vagy CD diagnózisát megerősítették proteomikai feltáró elemzés céljából. Mivel ez a vizsgálat kísérleti feltáró vizsgálat volt, 15 beteget vontunk be a feltárási szakaszba és 52 beteget a validációs szakaszba.

Biológiai mintavétel

A kolonoszkópia során dokumentálták a vastagbél szegmentális érintettségét. Számos nyálkahártya biopsziát nyertek, köztük öt-hat darabot egy makroszkóposan rendellenes területről (fekély, nodularitás) és két-három darabot egy endoszkóposan normális kinézetű területekről származó biopsziából. A négy biopsziás darabot külön-külön rögzítettük 10% -os pufferolt formalinban a szövettani tünetekre. Megfelelő rögzítés után a paraffin blokkokat feldolgozták. Mindegyik blokkból 20 lépéses szakaszot készítettünk 4 μm vastagsággal a részletes morfológiai értékeléshez. A metszeteket hematoxilinnal és eozinnal festették, és két, a gyomor-bélrendszeri patológiában különös érdeklődésű patológus vizsgálta őket, akiket elvakítottak a betegek klinikai adatai és végső diagnózisa. A proteomikai vizsgálatokhoz 6-8 nyálkahártya biopsziát nyertünk a vastagbél leginkább érintett területéről, többnyire a vastagbél jobb oldaláról és az ileocecalis szelepről. A normál vastagbél nyálkahártyájából származó biopsziákat kontrollként ITB betegektől is vettük. Ezeket a biopsziákat folyékony nitrogénben gyorsfagyasztottuk, és -80 ° C-on tároltuk.

A CD és az ITB diagnosztikai kritériumai

A CD diagnózisát az Európai Szervezet a Crohn-betegség és Kolitisz iránymutatásai alapján állapították meg, amely a klinikai, endoszkópos és szövettani jellemzők kombinációja 22. Az ITB diagnózisát jellegzetes klinikai tünetek (hasi fájdalom, székrekedés és/vagy hasmenés, konstitutív tünetek és bélelzáródás), endoszkópos tünetek (ileocecalis érintettség, fekély, nodularitás és szűkületek), szövettani tünetek (granulomák jelenléte) alapján állapították meg., mikrobák), mikrobák), (saválló bacillusok jelenléte bevonat vizsgálatához vagy savrezisztens bacillák polimeráz láncreakcióval történő bemutatásához) és válasz a tuberkulózis elleni kezelésre (Paustian-kritériumok Logan módosítással) 23, 24 .

Mintakészítés iTRAQ jelöléshez és erős kationcserélő kromatográfiához

Asztal teljes méretben

A kationcserélő kromatográfiát folyadékkromatográfiai rendszerrel hajtottuk végre (Shimadzu, Kyoto, Japán). A peptidelegyet 1 ml A pufferrel (10 mM kálium-foszfát, 25% acetonitril, pH 2,9) hígítottuk, és 5 μm részecskéket tartalmazó, 300 μm pórusméretű 2,1 mm x 150 mm-es kationoszlopra vittük fel (ZORBAX SCX 300; Agilent) Technologies, Santa Clara, Kalifornia, USA). A peptideket 300 μl/perc sebességgel 0% B puffer (1 M KCl, 10 mM kálium-foszfát, 25% acetonitril, pH 2,9) gradienssel eluáltuk 10 perc alatt, 0-30% B puffer 25 perc alatt, 30-60 % B puffer 10 percig, 60-100% B puffer 5 percig. A rendszert ezután 10 percig 100% -os B pufferben tartottuk, majd a következő injekció előtt 30 percig 0% B pufferral egyensúlyba hoztuk. Minden percben harminc frakciót gyűjtöttünk. Az elúciós monitorozást abszorbancia mérésével 220 nm-en kapcsoltuk össze, és vákuumban szárítottuk.

A fehérjék azonosítása és mennyiségi meghatározása

Az egyes kationcserélő frakciók peptidjeit újraszuszpendáltuk 0,1% hangyasavban és 3% acetonitrilben, és egy C18-75 μm x 150 mm oszloppal ellátott nano-LC rendszerbe (TempoTM; Siex, Framingham, MA, USA) injektáltuk. (Michrom Bioresources, Inc. USA). A mintákat online sótalanítottuk, és a peptidek elválasztására 84 perc gradienst használtunk növekvő acetonitril koncentrációval. Az eluenst egy tandem tömegspektrométerre (QSTAR XL; Siex, Framingham, MA, USA) permeteztük, és Információfüggő beszerzés (IDA) módban elemeztük szoftverrel (Analyst QS 1.1; Siex, Framingham, MA, USA). Az ütközési energiát +4 magasabb elfogási értékkel állítottuk be, mint a peptideknél szokásos érték, hogy biztosítsuk a peptid elégséges széttöredezettségét és az iTRAQ riportercsoportok keletkezését.

Bioinformatikai elemzés

Az azonosított svájci Prot fehérjék hozzáférési számait használtuk a gén ontológiai annotációk fehérje-analízisből történő kinyerésére az Evolutionary Relationships (PANTHER) osztályozási rendszer alkalmazásával. Ezután a fehérjefunkciót és a szubcelluláris lokalizáció elemzését gén ontológiai információk felhasználásával hajtottuk végre, és grafikonokat készítettünk a PANTHER osztályozási rendszer (//pantherdb.org; 9.0 verzió) felhasználásával. A PANTHER adatbázis ideális volt az azonosított fehérje szekvenciák adatsorainak nagy áteresztőképességű funkcionális elemzéséhez.

immunhisztokémia

A metszeteket vastagbélbiopszia archív parafin blokkjaiból vágtuk, viaszmentesítettük és rehidratáltuk. Ezután az endogén peroxidáz aktivitást 3% hidrogén-peroxiddal (H202) és 0,1% proteázzal blokkoltuk, 2 percig szobahőmérsékleten emésztettük. A metszeteket ezután primer antitestekkel (Abcam, Egyesült Királyság) inkubáltuk és egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk. Elsődleges antitestek a trefoil-faktor 3 (TFF3; 1: 200), a tioredoxin (TRX; 1: 500), a transzgélin (SM22; 1:) ellen. 200), tropomyozint (TPM; 1:50), IgGFc-kötő fehérjét (FCGBP; 1): 200) és miozint (MYH; 1: 100) használtunk a proteomanalízis eredményeinek megerősítésére, mivel ezekről a fehérjékről kiderült, hogy a CD-vel és az ITB-vel rendelkező betegek gyulladt nyálkahártyájában különböző módon fejeződnek ki.

A tárgylemezeket ezután háromszor mossuk Tris-pufferolt sóoldattal (pH 7,6), végül 30 percig inkubáljuk univerzális szekunder antitesttel (BioCare Universal Kit, MACH4, Concord, CA, USA). Az antigén-antitest reakciót peroxidáz-szubsztrát reakcióval tettük láthatóvá, kromogénként 3,3'-diaminobenzidint (DAB) használva. Az értelmezés során a szemikvantitatív értékelést a festés expressziójának teljes területének és a festés intenzitásának figyelembevételével végezzük. A fehérjefestés mértékét 1-től 4-ig, a festés intenzitását 1-től 3-ig értékeltük. A pontszámokat ezután összeszoroztuk, és a végső pontszámot a következőképpen osztályoztuk: 1-3, gyenge festés; 4 - 8, enyhe szín; és 9 - 12, erős színű. Fisher pontos vizsgálatát végeztük az immunkémiai fehérje expressziós pontszám eloszlásának értékelésére.

az eredmény

Proteomikai kísérletek

Az ebben a vizsgálatban a proteomikai elemzéshez használt stratégiát az 1. ábra mutatja be. 15 beteg (5 ITB-vel, CD-vel és kontrollokkal) kolorektális biopsziás mintáit használtuk az 1. táblázatban szereplő modell szerint. Öt kísérletben összesen 533 fehérjét azonosítottunk végeztek, és 241 fehérjét számszerűsítettek, legalább két peptid kritériumainak számszerűsítésével a kabalában. Százharmincnyolc fehérjét azonosítottak és számszerűsítettek legalább két kísérletsorozatban (2. táblázat). Az öt kísérletsorozat eredményei összehasonlíthatók voltak az azonosított és számszerűsített fehérjék összes számát tekintve, és a hamis pozitív eredmények aránya folyamatosan alacsony volt. A hemoglobin még mindig gyakori. Az összes azonosított fehérje bioinformatikai elemzését a PANTHER-ben végeztük. Ezeknek a fehérjéknek a gén ontológiai elemzését a 2. ábra mutatja.

A folyamatábra bemutatja az iTRAQ elemzés 1–5.

Teljes méretű kép

Asztal teljes méretben

( A ) Kördiagram, amely a proteomelemzés során a makroszkopikusan érintett vastagbél nyálkahártya biopsziájában azonosított összes fehérje genetikai ontológiai megjegyzésének eloszlását mutatja. A fehérjék molekuláris funkciójuk szerint vannak csoportosítva. ( B) Kördiagram, amely a proteomelemzés során a makroszkopikusan érintett vastagbél nyálkahártyájában azonosított összes fehérje gén ontológiai megjegyzésének eloszlását mutatja. A fehérjéket ismert biológiai folyamatok szerint csoportosítják, amelyekben részt vesznek. ( C ). Kördiagram, amely a proteomelemzés során a makroszkopikusan érintett vastagbél nyálkahártyájában azonosított összes fehérje gén ontológiai megjegyzésének eloszlását mutatja. A fehérjéket a sejtek eloszlása ​​szerint csoportosítják.

Teljes méretű kép

Differenciális fehérje expresszió az ITB-ben szenvedő betegek makroszkóposan érintett vastagbél nyálkahártyájában a kontroll biopsziákkal összehasonlítva

Ötvenegy fehérjét expresszáltak differenciáltan az ITB betegek biopsziáiban, az iTRAQ 1.3 arány kritériumaival összehasonlítva, az iTRAQ kísérletek legalább egy sorozatában. Huszonhárom fehérjét nem expresszáltak alul az ITB-ben, és 28 fehérjét túlexpresszáltak a kontrollokhoz viszonyítva. Az egynél több kísérletben azonosított fehérjék közül négy fehérje (miozin-11, makrofág-migrációt gátló faktor, a 2-hez hasonló heterogén nukleáris ribonukleoprotein A1 és a miozin-10) szignifikánsan nem expresszálódott (p-érték).

( A ) CD-ben nem expresszált fehérjék az ITB fehérjékhez képest. ( B ) CD-betegeknél túlexpresszált fehérjék az ITB fehérjékhez képest.

Teljes méretű kép

Bioinformatikai elemzés

A túlexpresszált és nem expresszált fehérjék bioinformatikai elemzését PANTHER-ben végeztük. Ezeknek a fehérjéknek a molekuláris funkciója, a biológiai folyamat és a sejtek elhelyezkedése hasonló volt a teljes lefedett fehérjéhez. Ezeknek a differenciálisan expresszált fehérjéknek az útvonal-elemzését a PANTHER-ben végeztük. A különböző útvonalakat, amelyekben ezek a különböző módon expresszált fehérjék valószínűleg részt vesznek, a 4. ábra mutatja. A podexpresszív fehérjéket feljegyeztük a fruktóz-galaktóz metabolizmusára, az apoptózis szignál útjára, a plazminogént aktiváló kaszkádra, a Parkinson-kórra, a gonadotropin felszabadító hormon receptor receptorra, a glikolízisre. és a véralvadási utak. Másrészt a túlzottan expresszált fehérjéket annotálták olyan utakba, mint a citoszkeletális szabályozás, a gyulladás, az integrin jelátviteli útja, a hipoxia, az oxidatív stressz válasza, a FAS jelátviteli útja és a G-fehérje jelátviteli útja.

( A ) Kördiagram, amely a gének ontológiai annotációját és a nem expresszált fehérjék úteloszlását mutatja CD és ITB betegek makroszkóposan érintett nyálkahártyájában. (B) Kördiagram, amely a gén ontológiai annotációját és a túlexpresszált fehérjék úteloszlását mutatja CD és ITB betegek makroszkóposan érintett nyálkahártyájában.

Teljes méretű kép

A differenciálisan expresszált fehérjék validálása immunhisztokémiai módszerekkel

Asztal teljes méretben

Fotomikrográf, amely a trefoil-faktor 3 normál expressziós profilját mutatja [ A ), IHC [TFF3] x40), IgGFc-kötő fehérje [nyíl] ( B ), IHC [FCGBP] x40), miozin nyíl (( C ), IHC [MYH] x40), transzgélin (( D ), IHC [SM22] x40), tropomiozin (( E ), IHC [Tropomyosin] x40) és tioredoxin fehérje [nyíl] ( F ), IHC [TRX] x40). A trefoil-faktor 3 expressziójának összehasonlító mintái vastagbél biopsziákban:( G ), amely a trefoil faktor-3 expresszió 12-es (( G, IHC [TFF3] x40), expressziós pontszám 6 (( H ), IHC [TFF3] x40), és egy expressziós pontszám 0 (( én ), IHC [TFF3] x40).

Teljes méretű kép

vita

Ez a tanulmány az első proteomikus elemzés a CD-ben és az ITB-ben szenvedő betegek nyálkahártya-biopsziáiról, és számos ígéretes jelöltet tárt fel a biomarkerek számára a két betegség megkülönböztetésére. Az iTRAQ kísérletek öt sorozatában 533 fehérjét azonosítottak és 241 fehérjét számszerűsítettek. Összességében 63 vastagbél nyálkahártya-beteg, CD- és ITB-beteg volt expresszálva differenciálva az iTRAQ kísérletek legalább egy sorozatában, amelyek közül 11 fehérjét differenciáltan expresszáltak egynél több kísérletsorozatban. Ezek közül azt javasoljuk, hogy a trefoil 3-as faktor, a zsírsav-szintáz, a miozin 14, a miozin 11, az emberi tioredoxin 1, az IgG-kötő fehérje Fc, a transzgélin és a tropomiozin, mint potenciális jelölt a biomarkerek kifejlesztésére a CD és az ITB megkülönböztetésére.

Azok a fehérjék, amelyek CD-ben és ITB-ben szenvedő betegek vastagbélében differenciáltan expresszálódtak, szerepet játszhatnak a betegség patogenezisében, vagy e betegségek következtében megjelenhetnek a szövetben. Például a CD-ben szenvedő betegeknél a szignifikánsan alacsonyabb trefoil faktor 3 szint valószínűleg a betegség aktivitásának indikátora. Bár a CD-t és az ITB-t is bevontuk aktív fázisukba, a CD-betegeknél a trefoil peptid-3 eltérően alacsonyabb expressziója az ITB-hez képest a nyálkahártya-érintettség nagyobb területét tükrözi a CD-s betegeknél. Egyik másik vizsgálatunkban a gyógyított fekélyes vastagbélgyulladásban szenvedő betegeknél magasabb volt a trefoil faktor-3 magasabb szérumszintje, mint az aktív betegségben szenvedőknél 25. Mindkét megfigyelés azt sugallja, hogy a trefoil 3-as faktor jó mutató lehet a betegség aktivitására. A Trefoil-faktor 3 a kicsi, kompakt fehérje egyike, amelyet serlegsejtek expresszálnak a gyomor-bél traktusban 26. Gyulladáscsökkentő tulajdonságai mellett a háromlevelű peptid fontos szerepet játszik a gyomor-bél traktus nyálkahártyájának fenntartásában és helyreállításában is. A trefoil expresszióját elnyomja a tumor nekrózis-α faktor, amelynek szintje továbbra is magas a CD27-ben szenvedő betegeknél.

Míg a disztális és a terminális ileum mind a CD-ben, mind az ITB-ben részt vesz, a nyálkahártya-érintettség mértéke nagyobb a CD-s betegeknél, mint az ITB-ben. A CD-betegek zsírsav-szintáz expressziójának négyszeres növekedése az ITB növekedéséhez képest részben a magasabb megváltozott zsíranyagcserének és az enterohepatikus epesav-keringésnek tulajdonítható CD-s betegeknél, mint az ITB 28, 29, 30 esetében. .

Összefoglalva, a CD-vel és ITB-vel rendelkező betegek vastagbélének makroszkóposan érintett területeiről származó vastagbél-biopsziák proteomprofiljának összehasonlító elemzése 533 fehérjét eredményezett, amelyekből 241 fehérje számszerűsíthető. A fehérjéket differenciálisan expresszálták a CD-ben és az ITB-ben szenvedő betegek szövetfehérjéjében. További kísérletek szükségesek nagyobb homogén szövetminták csoportjával biomarker megtalálására a CD és az ITB megkülönböztetéséhez.

További részletek

Hogyan lehet idézni ezt a cikket: Rukmangadachar, LA és mtsai. A makroszkóposan érintett vastagbél nyálkahártyájának fehérjeelemzése Crohn-betegségben és bél tuberkulózisban. Sci. ismétlés. 6., 23162; doi: 10, 1038/srep23162 (2016).

Hozzászólások

Megjegyzés benyújtásával elfogadja az Általános Szerződési Feltételeinket és a közösségi irányelveket. Ha bármi sértőnek vagy összeegyeztethetetlennek tűnik a feltételeinkkel vagy irányelveinkkel, jelölje meg nem megfelelőként.