elemeket

absztrakt

A rákprofilaktikus vakcinák tervezésének fő feladata az immunogén és biztonságos rákantigének meghatározása. Az antigén expressziós mintázatok erős hasonlósága miatt a rák és az embrionális szövetek között meghatároztunk egy prototípus stratégiát placenta eredetű hősokk fehérje gp96 fehérje alkalmazásával, amely T-sejt profilaktikus válaszokat indukál a tumorokkal szemben. A placenta gp96-mal végzett immunizálás részleges védelmet és hosszú távú (legalább 3 hónapos) tumorellenes immunitást biztosított egerekben a transzplanálható melanoma vagy emlődaganatok növekedése ellen, teljes védelmet kiváltva a 7,12-dimetilbenz (a) -antracén (DMBA) ellen. . patkányokban indukált emlődaganatokat, és jelentősen csökkentette az autochton emlődaganatok előfordulását és növekedését HER2 transzgenikus egerekben. A placenta gp96 aktiválta a HER2 és MUC1-specifikus T-sejt-válaszokat a tumorral társult antigénekhez való kötődéssel. Eredményeink megmutatják a placenta gp96 új immunogenitását és potenciális alkalmazását multivalens rák vakcinaként.

Annak ellenére, hogy az utóbbi években figyelemre méltó fejlődés történt a rák okainak megértése és a rákkezelés terén elért jelentős előrelépés ellenére, a betegség továbbra is fennáll, és a rák előfordulása világszerte növekszik 1. A fertőző betegségek elleni rendkívül hatékony profilaktikus oltásoktól eltérően az olyan terápiás rák elleni vakcinák, amelyek nem okoznak elfogadhatatlan autoimmun rendellenességeket, nem voltak olyan hatékonyak, csupán növekményes terápiás hatásokat produkáltak 2. A legegyszerűbb magyarázat az lehet, hogy a terápiás oltóanyagok alkalmazása a megállapított daganatok kezelésében egyenértékű azzal a sikertelen megközelítéssel, amikor a hepatitis B vírus (HBV) vagy az emberi papillomavírus (HPV) vakcinákat krónikus HBV vagy HPV fertőzés kezelésére alkalmazzák. Számos visszafordítási mechanizmusról számoltak be, amelyek a tumor szivárgását és az immunrendszer elnyomását vonják maguk után, feltehetően a tumor hosszú távú fejlődése, kialakulása és növekedése miatt, ideértve a károsodott T-sejt-válaszokat, az immun toleranciát és a valószínűleg szuppresszív tumor mikrokörnyezetet. . szinergikusan 3. Ez aláhúzza annak szükségességét, hogy olyan profilaktikus megközelítést dolgozzanak ki a rák elleni oltásokkal kapcsolatban, amely olcsó és rendkívül hatékony racionalizálást biztosít.

A rákprofilaktikus vakcinák tervezésének egyik fő kihívása az immunogén és biztonságos rákantigének meghatározása, amelyek a hatékony vakcinák célpontjaként szolgálhatnak, beleértve a daganatspecifikus antigéneket és a daganaton túl expresszált fehérjéket, de a normális szövetekben nem. A mai napig csak korlátozott számú rákantigént azonosítottak, 4, 5, 6 sikerrel. Jól dokumentálták, hogy a szilárd daganatok legtöbb típusa különböző mértékben expresszálja az embrionális antigéneket, és az antigén expressziójában erős hasonlóság mutatkozik a rák és az embrionális szövetek között, ami lehetőséget nyújt az embrionális komponensek célba vételére, mint hatékony stratégiára a rák megelőzésére 7. Az embrionális vagy őssejt-antigénekkel történő oltás erős védő immunválaszhoz vezet a rák ellen 8, 9, 10. Átmeneti szervként, amely tápanyagokat és salakanyagokat cserél az anya és a magzat között, a méhlepény egy rákkal kapcsolatos gén, köztük az IGF2, a HIF-2a, a GPC3, a terhességgel összefüggő plazmafehérje A (PAPP-A) és a MUC1 nagyobb expressziót mutat. 11. .

A 90 fős hősokkfehérje (HSP) család tagjaként a gp96 egyedülállóan képes kötődni antigén peptidekhez, bemutatni ezeket a megterhelt antigéneket az MHC I. és II. Osztályú molekulák számára, és aktiválni a specifikus 12, 13 T-sejteket. Korábbi vizsgálataink azt mutatják, hogy a hepatitis B vírussal (HBV) fertőzött májrákban a gp96 megköti a vírus eredetű peptideket és a 14, 15 antigén bemutatásával aktiválja a specifikus CTL válaszokat. Ezenkívül a legújabb tanulmányok meggyőző bizonyítékot szolgáltatnak a makrofágok és a dendritikus sejtek gp96-aktiválására a Toll-szerű receptorok (TLR) vagy a CD91 16, 17, 18, 19 részhalmazával történő kölcsönhatás révén. enyhe daganatellenes hatású daganatok kezelésére indítottak 20. A fenti megfigyelések alapján e vizsgálat célja annak meghatározása volt, hogy a placenta eredetű gp96 (P-gp96) indukál-e profilaktikus T-sejt tumorellenes válaszokat.

az eredmény

Először tumorok provokációs tesztjeivel teszteltük a placenta eredetű gp96 vakcina képességét a daganatok megelőzésére. A Gp96 fehérjét a C57BL/6 egerek placentájából vagy májszövetéből extraháltuk a fentiek szerint. A C57BL/6 egereket háromszor szubkután immunizáltuk placentából származó gp96 (P-gp96), májból származó gp96 (L-gp96) vagy PBS (immunizálás nélkül) kontrollként. Egy héttel az utolsó immunizálás után az egereket szubkután stimuláltuk B16-F10 melanoma sejtekkel (5x104 sejt/egér). Az L-gp96-hoz vagy a PBS-hez képest a P-gp96-mal végzett immunizálás szignifikánsan gátolta a tumor növekedését, és a 30. napon körülbelül 49 vagy 45% -kal csökkentette a tumor mennyiségét (mind

multivalens

Továbbá teszteltük, hogy a P-gp96-mal végzett immunizálás képes-e hosszú távú védő tumorellenes immunitást biztosítani. A C57BL/6 egereket háromszor C57BL/6 egerekből származó P-gp96 vagy L-gp96 oltással oltottuk be . Az utolsó immunizálás után három hónappal az egereket szubkután B16-F10-vel oltottuk be (5x104 sejt/egér). A kezelés nélküli kezeléshez képest a tumor növekedése lelassult a P-gp96-mal kezelt egereknél, de az L-gp96-tal (P-gp96) nem.

A nőstény C57BL/6 (a-d) vagy BALB/c (e-h) egereket háromszor immunizáltuk P-gp96, L-gp96 vagy PBS-sel. Három hónappal a harmadik immunizálás után az egereknek 5 x 104 B16-F10 sejtet vagy 6 x 105 TUBO sejtet adtunk szubkután. (a, e) A tumorterhelést 2 napos időközönként mértük. (b, f) Az egerek túlélésének Kaplan-Meier-diagramja különböző oltások után. (c, g) Az immunizált egerekből származó splenocitákat B16-F10 (c) vagy TUBO (g) teljes sejt-lizátum antigénekkel vagy BSA-val stimuláltuk háttér-értékelés céljából, és IFN-y ELISPOT-mal vizsgáltuk. (d, h) A splenocytákat besugárzott B16-F10 (d) vagy TUBO (h) sejtekkel stimuláltuk in vitro 3 napig, és FACS-mal elemeztük a citotoxikus aktivitást CFSE-jelzett B16-F10 sejtekkel vagy TUBO sejtekkel célsejtként. A hibasávok sd ** P-t jeleznek

vita

Vizsgálatunk kimutatta, hogy a placentából izolált gp96 embriókarcinóma antigénekkel társítva indukálja a daganat-specifikus T-sejt válaszokat, a gp96 immunizálás pedig profilaxist biztosít a tumor xenograftokkal, valamint a karcinogén által indukált vagy spontán rákokkal szemben. Tekintettel az antigén hasonlóságra a rák és az embrionális szövetek között 7, valamint arra, hogy a gp96 képes megkötni a 13. sejtben létrehozott teljes peptidkészletet, eredményeink ezért racionális alapot szolgáltatnak egy multivalens rákprofilaktikus vakcina kifejlesztéséhez.

mód

Emberi minták

A normál májszöveteket a máj transzplantációjára használt öt máj máj fel nem használt részeiből nyertük a pekingi You'an Kórházban, a Központi Orvostudományi Egyetemen. A pekingi egyetem harmadik kórházában 2011 júliusa és 2011 decembere között kórházba került öt nőből placentamintákat vettek. A vizsgálat minden résztvevője írásos beleegyező nyilatkozatot adott. A vizsgálati protokollt a pekingi You'an kórház etikai bizottsága és a harmadik pekingi kórház etikai bizottsága hagyta jóvá.

Sejtvonalak

A TUBO egy klónozott sejtvonal, amelyet egy BALB-neuT egér spontán emlődaganatából állítottak elő, és a HER-2 fehérjét erősen expresszálja a sejtmembránon. A TUBO sejteket 10% magzati borjúszérumot (FBS), 25 ug/ml sztreptomicint és 100 NE/ml penicillint tartalmazó DMEM táptalajban (GIBCO) tenyésztettük. A B16-F10 sejteket 10% FBS-sel, 25 ug/ml sztreptomicinnel és 100 NE/ml penicillinnel kiegészített RPMI 1640 (GIBCO) táptalajon tenyésztettük.

Egerek és patkányok

A nőstény BALB/c egereket (6-8 hetesek) és a C57BL/6 egereket (6-8 hetesek) a Pekingi Egyetem (Peking, Kína) Orvosi Tanszékének Állatkutatási Központjától vásároltuk. FVB/N-Tg (MMTVneu) 202 Mul/J egeret (6–7 hetesek) prof. Mingzhao Zhu (Biofizikai Intézet, Kínai Tudományos Akadémia, Peking, Kína). Nőstény Wistar patkányokat (6-7 hetesek) a Beijing HFK Bio-technology Co. cégtől szereztünk be. kft (Peking, Kína). Az egereken és patkányokon végzett összes kísérletet szigorúan a Kutatási Etikai Bizottság Kínai Tudományos Akadémia Mikrobiológiai Intézetének szabályai szerint hajtották végre.

A gp96 előállítása

Az egeret, a patkányt és az emberi P-gp96-ot és az egér L-gp96-ot ConA-Sepharose affinitáskromatográfiával tisztítottuk, majd egerekből, patkányokból és humán placentából vagy májszövetekből származó anioncserélő kromatográfiával tisztítottuk. .

Egér és patkány oltás

Profilaktikus vizsgálatokban a BALB/c és C57BL/6 egereket szubkután injekcióval a hasüregbe immunizáltuk 20 μg P-gp96/egér, 20 μg L-gp96/egér vagy PBS önmagában az 1., 2. és 4. héten. a harmadik immunizálás, az egereknek 6 x 105 TUBO sejtet/egér vagy 5 x 104 B16-F10 sejtet/egér szubkután adtunk be. Terápiás vizsgálatok során a BALB/c egereket szubkután stimulálták 6 x 105 TUBO sejt/egér alkalmazásával. A második napon az egereket 20 μg P-gp96/egér, 20 μg L-gp96/egér vagy önmagában PBS-sel immunizáltuk háromszor, háromnapos időközönként. A hosszú távú védőimmunitás értékeléséhez a BALB/c és C57BL/6 egereket szubkután injekcióval immunizáltuk a hasüregbe, 20 μg P-gp96/egér, 20 μg L-gp96/egér vagy PBS önmagában az 1-2. Héten. és 4. Három hónappal a harmadik immunizálás után az egereknek 6 x 105 TUBO sejtet/egér vagy 5 x 104 B16-F10 sejtet/egér szubkután adtunk be. Minden csoport legalább 10 egeret tartalmazott. A tumor méretét ezután minden második nap megmértük. Az egerek túlélését 50 napig figyeltük meg.

Nőstény FVB/N-Tg (MMTVneu) 202 Mul/J egeret szubkután injekcióval a hasba oltottunk 25 μg P-gp96/egér, 25 μg L-gp96/egér vagy PBS-sel háromszor az 1., 2. és 4. héten. Az előfordulást és a tumor növekedését rendszeres időközönként ellenőriztük. A nőstény Wistar patkányokat szubkután hasi injekcióval 25 μg P-gp96/patkány vagy PBS-sel oltottuk be háromszor az 1., 2. és 4. héten. Egy héttel az utolsó immunizálás után a patkányokat 20 μg/100 g testtömeg DMBA (Sigma) 1 ml kukoricaolajban, gyomorcső alkalmazásával. A kísérletet 21 héttel a DMBA expozíció után fejeztük be.

A daganat méretét úgy határoztuk meg, hogy a legkisebb átmérőt (a) és a legnagyobb átmérőt (b) féknyereggel mértük. A tumor térfogatát a következő képlet segítségével számoltuk ki: V = (a2b)/2.

DC előállítás és immunizálás

A C57BL/6 vagy BALB/c egerek combjaitól és sípcsontjaitól eltávolítottuk a csontvelőt a medulláris csatorna PBS-sel történő öblítésével. A csontvelőt egy 100 μm-es nejlonsejt-szűrőn átszűrjük, mielőtt az eritrocitákat 0,83 M NH 4 CL pufferben lizálnánk. A sejteket 10% magzati borjúszérummal, 100 U/ml penicillinnel, 100 ug/ml sztreptomicinnel, 50 ng/ml rekombináns egér GM-CSF-rel (R&D Systems) és 20 ng/ml rekombináns egér IL-4-gyel kiegészített RPMI 1640-ben szuszpendáltuk. R&D Systems) 1x107 sejt/ml koncentrációban és 37 ° C-on tenyésztettük. A DC prekurzorokat kétnaponta 2 ml tápközeg hozzáadásával tenyésztettük. A 7. napon a DC-ket összegyűjtöttük és B16-F10 vagy TUBO tumorsejt-lizátumokkal stimuláltuk 50 μg fehérje/ml koncentrációban 24 órán át. A DC aránya a tenyészetben folyamatosan 90% volt, áramlási citometriás analízissel meghatározva.

A BALB/c és C57BL/6 egereket szubkután injekcióval a hasba immunizáltuk 20 μg P-gp96/egér, 1 x 106 DC/egér vagy PBS önmagában az 1., 2. és 4. héten. harmadik immunizálás, az egereknek szubkután 6x105 TUBO sejtet/egeret vagy 5x104 B16-F10 sejtet/egeret adtunk be.

Adoptív T-sejt transzfer

A P-gp96-immunizált, L-gp96-immunizált vagy nem immunizált (PBS) BALB/c egerek lépéből splenocitákat izoláltunk a leírás szerint. A CD3 + T-sejteket dúsítottuk (> 90%) mágneses gyöngyelválasztással (Miltenyi, Biotec, Németország) a tenyésztett lépsejtektől. A megtisztított T-sejteket (2x107) intravénásán injektáltuk y-besugárzott (500 rad) BALB/c egerekbe, majd szubkután 6x105 TUBO sejt/egér szubkután expozíciót végeztünk. A daganat méretét rendszeres időközönként mértük, és az egereket 50 napig követtük nyomon a túlélés érdekében.

Perifériás mononukleáris sejt (PBMC) gyűjtemény

A PBMC-ket öt egészséges donor frissen heparinizált véréből izolálták Ficoll-Hypaque sűrűség gradiens centrifugálással (GE health).

Enzimhez kapcsolt immunszorbens folt (ELISPOT) elemzés

Az egér IFN-y vizsgálatait és a humán IFN-y ELISPOT-ot a gyártó (Mabtech, Mariemont, OH) által biztosított protokoll szerint hajtottuk végre. Röviden, izolált egér splenocitákat vagy humán PBMC-ket (a jelzett sejtek számánál/különböző ingerekkel pulzáló mélyedés) háromszoros példányban adtunk a mélyedésbe, és 37 ° C-on 18-36 órán át inkubáltuk. A festősejteket (SFC) megszámoltuk és elemeztük egy ELISPOT Reader (Biosys, Németország) segítségével. Az említett kontroll peptideket használtuk háttér kontrollként.

T-sejt citotoxicitási teszt

A citolízist 5- (6) -karboxi-fluoreszcein-szukcinimidil-észterrel (CFSE) és propídium-jodiddal (PI) határoztuk meg két fluorokróm festéssel. Egér lépeket vagy humán PBMC-ket használtunk effektor sejtként. A vizsgálatban B16-F10, TUBO és MCF-7 sejteket alkalmaztunk célsejtként. A célsejteket előzetesen CFSE-vel jelöltük, és 200 μl végtérfogatban különböző arányban effektor sejtekkel kevertük. 5 órán át 37 ° C-on végzett inkubálás után az elhalt sejteket PI-vel jelöltük. A mintákat fluoreszcenciával aktivált sejtválogatással (FACS) elemeztük CellQuest szoftver (BD Biosciences) alkalmazásával.

Valós idejű PCR elemzés

immunocitokémia

A 4% pufferelt formalinban rögzített patkány emlőtumorokat hagyományos automatizált rendszerrel paraffinba ágyazottuk. A parafinba ágyazott szöveteket (5 μm metszetek) hemotoxilin-eozinnal festettük.

Statisztikai analízis

Az értékeket átlag ± SD értékként fejezzük ki. A PBS, P-gp96 és L-gp96 kezelt egerek átlagos tumor térfogatának, SFC-jének, százalékos elpusztulásának és relatív mRNS-expressziós szintjének különbségeit összehasonlítottuk a Student t-tesztjével és a variancia-elemzéssel (ANOVA) és post-hoc összehasonlítás a Tukey-teszt segítségével. A Kaplan-Meier görbék közötti különbségeket összehasonlítottuk a log-rank teszttel.

További információ

PDF fájlok

További információ

Hozzászólások

Megjegyzés beküldésével vállalja, hogy betartja Általános Szerződési Feltételeinket és közösségi irányelveinket. Ha ezt sértő cselekedetnek találja, amely nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.