savban

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • Az RA szignalizáció DC-ben szabályozza a bél cDC fejlődését
  • Az RA irányítja az alkotást in vitro bél cDC1 és cDC2 alcsoportok
  • Az RA ellenőrzi az átiratokat in vitro származtatott cDC1 és cDC2 a génexpresszió fiziológiai mintázata felé.
  • Az RA szabályozza a cDC differenciálódásában szerepet játszó transzkripciós faktorok expresszióját
  • Az NF-κB/REL kötőhelyek túlzott bemutatása RA génnel elnyomott gén promoterekben
  • vita
  • mód
  • növekményekkel
  • Gén expressz Omnibus
  • További információ
  • Word dokumentumok
  • További képmondák
  • Képfájlok
  • További kép S1
  • További kép S2
  • További kép S3

elemeket

  • Sejtjelzés
  • Dendritikus sejtek
  • Nyálkahártya immunológia
  • átirat

absztrakt

A beleket folyamatosan mikrobiotikumoknak, emésztett ételeknek és betörő kórokozóknak teszik ki. A bél dendritikus sejtek (DC) kulcsszerepet játszanak az immun homeosztázisban azáltal, hogy az egyes antigéneknek és ingereknek megfelelő immunválaszokat irányítanak. A DC-k egyedülállóan képesek antigének mintavételezésére és feldolgozására, valamint a T- és B-sejtekre vonatkozó mikrokörnyezeti jelek átültetésére citokinek és metabolitok bemutatásával, az immunválasz kiváltására és szabályozására, vagy a tolerancia kiváltására vagy fenntartására.

A vékonybélben (SI) a hagyományos dendritikus sejtek (cDC) két domináns alcsoportját fenotípusosan CD11c + MHCII + sejtként azonosítják, amelyek CD103 + CD11b - (cDC1) vagy CD103 + CD11b + (cDC2). Az alcsoportok fejlettsége eltérő, és eltérő transzkripciós tényezőket igényelnek. Bár mindkét folyamat feldolgozza a helyi antigént, vándorol a mesenterialis nyirokcsomókba (MLN), tolerogén vagy immunstimuláló válaszokat produkál, és a T-sejteket a bélbe nyomja, funkcionálisan is különböznek egymástól: pl. A CDC2-ek a TLR5-t expresszálják, amely felismeri a flagellint, és jobb induktorok. A Th17 sejtek, valamint az IgA és a cDC1 szintézisek a TLR3-at expresszálják, amely a kettős szálú vírusos RNS példaértékű receptora, és a Clec9A és XCR1 receptorokat mutatják be, amelyek szerepet játszanak a cDC1 speciális képességében a sejtekkel társított antigének CD8 T-sejtek in vivo keresztben történő bemutatásában. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 Mindkét alcsoport fenotípusosan különböző csontvelő (BM) prekurzorokból származhat, 10, 11, beleértve a nyálkahártya előtti DC-t (pre-μDC), egy bélprekurzort, amely cDC részhalmazokhoz, valamint plazmacitoid DC-hez vezethet. A pre-μDC kifejezi az α4β7 bélvezető receptort, előnyösen vándorol a bél lamina propriájába (LP) és hatékonyan újratelepíti a bél cDC raktárait.

Itt arra kerestük a választ, hogy az RA vezérli-e a pre-μDC további fejlődését, és megvizsgáltuk annak hozzájárulását a cDC bél alcsoportjainak specializálódásához. Eredményeink azt mutatják, hogy az intracelluláris RARα jelátvitel szabályozza a bél cDC termelését az μDC-k előtt, és központi szerepet játszik mind a cDC1, mind a cDC2 transzkripciós programozásban. Megmutatjuk továbbá, hogy a granulocita-makrofág kolóniastimuláló faktorral (GM-CSF) és az Flt3L-rel kombinálva az RA hatékony in vitro cDC-termelést irányít a bél cDC1 és cDC2 egyedi jellemzőivel a bél prekurzoraiból, előzetesen μDC.

az eredmény

Az RA szignalizáció DC-ben szabályozza a bél cDC fejlődését

Eredetileg az A-vitamin-hiányos (VAD) egerekben vizsgáltuk a cDC-t VAD-étrenddel 12 hétig a méh után. 17 A VAD mindkét fenotípusra és a bél cDC alcsoportok reprezentációjára hatással volt. A cDC2 (CD103 + CD11b +) gyakorisága és száma mind a C57BL/6 egerek SI LP-jében, mind mezenteriális nyirokcsomóiban csökkent, összehasonlítva a kontroll étrendben lévő egerekkel (1a, b ábra). Hasonló eredményeket kaptunk BALB/c egereknél (további Sla kép online) és C57BL/6 egereknél VAD-étrendet etettek az elválasztás után (további S1b kép). A CD103 + cDC alcsoportokkal ellentétben a vegyes CD103 - CD11b + populáció, amely makrofágokból és kisebb CD103 bél cDC populációkból áll, bár vizsgálatainkban számukban és gyakoriságukban különböznek egymástól, nem mutattak következetes különbséget a kontroll és a VAD egerek között ( adatok nem láthatók). Az RA makrofágok fejlődésére gyakorolt ​​hatásának kritikus értékelése más makrofág markerekkel végzett vizsgálatokat igényel.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

Az RA a bél több sejttípusát érinti, beleértve a sztrómasejteket és az epitheliumot, és közvetetten befolyásolhatja a cDC-t. Annak megállapítására, hogy DC-belső RAR-jelzésről van-e szó, terveztünk egereket egy domináns negatív RARα, RAR403 expresszálására a CD11c promoter irányítása alatt, oly módon, hogy a CD11c-Cre egereket kereszteztük olyan egerekkel, amelyek RAR403-at hordoztak a lox P oldalsó STOP kazettától lefelé. . (dn Rara lsl/lsl). 29 Ezeknek a „DC-RAR403 egereknek” szignifikáns csökkenése volt az abszolút cDC2 számban és a cDC2/cDC1 arányban a SI LP és a mesenterialis nyirokcsomókban a vad típusú (WT) almaikhoz képest (2a. Ábra), és ezek a hatások egerek, amelyek két példányban voltak a RAR403 génből (DC-RAR403 fl/fl), összehasonlítva az egy példányú egerekkel (DC-RAR403 fl/-). A VAD egerekhez hasonlóan a DC-RAR403 egerekben a bél cDC1 sejtjeinek egy alcsoportja CD207-et (Langerin) expresszált (2b. Ábra). Az eredmények arra utalnak, hogy az RA belsőleg hat a bél cDC1 és cDC2 sejtjeire, ezáltal befolyásolva azok fenotípusát és fejlődését. A jelentések szerint azonban a bél makrofágok alcsoportjai krea rekombinációt mutatnak 30 CD11c-cre egérben, és kifejezhetik RAR403-at a modellünkben; ezért nem zárható ki a makrofágok cDC fenotípusokra gyakorolt ​​közvetett hatása.

A dendritikus sejtek (DC) hatásai - a retinsav (RA) jelzésének korlátozott hiánya a vékonybél DC-n (SI). a ) A cDC2 és a cDC1 aránya SI lamina propria (LP) és MLN-ben és a cDC2 száma SI LP-ben a DC-RAR403 -/- (standard típus (WT)), DC-RAR403 fl/- (heterozigóta) és DC - RAR403 arányban fl/fl (homozigóta) egerek. ( b ) a CD207 rendellenes expressziója SI cDC1-en DC-RAR403 egerekből. Reprezentatív grafikonok, amelyek DC-RAR fl/fl egerekből származó SI cDC1 alkalmazásával mutatják be a CD207 expressziós sejteket (a CD207 + kapun belüli sejteket szemléltetésként nagy pontokként mutatjuk be). A szórási diagram a CD207-et expresszáló cDC1 százalékos arányát mutatja az SI-ben. Párosítatlan egyoldalú t-teszt. cDC, hagyományos dendritikus sejt; MLN, mesenterialis nyirokcsomók.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

A lép cDC-t DC-RAR403 egerekben is befolyásolták (S2 kiegészítő ábra). A DC-RAR403 egerek DC-jéhez hasonlóan a lép CD8a + cDC1 részhalmaza DC-RAR403 egerekben, de a WT kontrollokban nem, Langerint (CD207) expresszált (S2a. Kiegészítő ábra). Mind a CD11b +, mind a CD8a + cDC szám csökkent a DC-RAR403 egerek lépében, de a CD11b + cDC és a CD8a + cDC aránya nem változott a WT dobókhoz képest (S2b. Ábra és az adatok nem láthatók). A Clec4a4-et expresszáló cDC-t (DCIR2, amelyet Mab 33D1, egy klasszikus cDC2 marker ismer fel) jelentősen csökkent, ami a ClD42 által meghatározott cDC2 és cDC8a + cDC1 arányának csökkenéséhez vezet (S2c kiegészítő ábra). A Clec4a4 + alcsoport, amelynek száma erősen csökken a DC-RAR403 egerekben, szintén Esam-t expresszált WT egerekben (S2d. Kiegészítő ábra). Így a sejten belüli RAR jelátvitel mind a lépben, mind az SI-ben egyaránt befolyásolta a cDC1-t és a cDC2-t.

Az eredmények együttesen azt sugallják, hogy a DC-intrinsic RAR jelátvitel szabályozza a cDC alcsoportok fejlődését és fenotípusos specializálódását mind a bél, mind az extraintesztinális helyeken, de támogatja az RA különösen fontos szerepét a bél cDC fenotípusainak meghatározásában és a regionális szakosodást a proximális SI és mesenterialis nyiroksejtekben. vízelvezetés. csomópontok, ahol az RA koncentráció magas.

Az RA irányítja a bél cDC1 és cDC2 alcsoportjának in vitro képződését

A retinsav (RA) in vitro szabályozza a DC-szerű dendraktikus sejtek (DC) intendinális részhalmazainak kialakulását. ( a - c ) A nyálkahártya előtti DC-ket (pre-μDC-ket) Flt3L-rel injektált BM egerekből válogattuk, és teljes Iscove módosított Deulbecco táptalajban tenyésztettük 10% delipidált szérummal kiegészítve Flt3L-lel és granulocita-makrofág kolóniastimuláló faktorral (GM) -CSF). 100 nM RA (vagy AM580 in c ), eltérő rendelkezés hiányában. A tenyészeteket a 4. napon gyűjtöttük be, és áramlási citometriával elemeztük. a ) Felületi markerek és retinaldehid-dehidrogenáz (RALDH) aktivitás, amelyet AldeFluor festés jelez a bélben, és in vitro származó cDC1 (szaggatott vonal) és cDC2 (folytonos vonal). Legalább három független kísérlet képviselője. ( b ) Clec9a expressziója in vitro származó cDC1-en és CD101 expressziója cDC2-n változó RA koncentrációval. Két független kísérlet képviselője. ( c ) A cDC2 és a cDC1 arányát, a teljes utód sejtjeinek számát, valamint a cDC1 és cDC2 számát feltüntetjük az RA vagy AM580 jelzett koncentrációval kezelt tenyészetekben. Az adatokat három független kísérletből gyűjtjük össze. cDC, egy hagyományos dendritikus sejt.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

Az RA hozzáadása azonban cDC1 és cDC2 képződését eredményezte két bél cDC alcsoport fő fenotípusos jellemzőivel, beleértve a cDC1 TLR3-at és a cDC2 CD101-et, valamint mindkét alcsoport retinaldehid-dehidrogenáz expresszióját (3a. Ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a GM-CSF, az Flt3L és az RA együttesen biztosítja a bél cDC-k és a BM prekurzorok megkülönböztetéséhez szükséges kritikus jeleket. A Clec9a RA szabályozása a cDC1 és CD101 expresszióhoz a cDC2 alcsoportban dózisfüggő volt (3b. Ábra).

Az RA a cDC2 növekedését okozta in vitro, hasonlóan az in vivo hatásához. Amikor pre-μDC-ket tenyésztettünk különböző koncentrációjú RA-val vagy az AM580 RARα agonistával 4 napig, az RA vagy AM580 jelenléte növelte a keletkezett cDC2 számát, miközben csökkentette a cDC1 számát, hatékonyan növelve a cDC2/cDC1 arányt. Az RA hatása dózisfüggő volt, a cDC2/cDC1 arány 0-ról 1 nM RA-ra nőtt, és a plató nőtt, amikor az RA-koncentráció elérte a SI 25-re jelentett szintet (

10 nM). Mivel az utódsejtek teljes számát nem befolyásolta RA vagy AM580 (3c. Ábra), az eredmények összhangban vannak az RA közvetlen hatásával a DC prekurzorok RARα-ján, hogy befolyásolják a sorsukat.

Az eredmények együttesen arra utalnak, hogy az RA kritikus sejtes belső szerepet játszik a bél cDC specializációjában, és meghatározzák a tenyésztési feltételeket a bél cDC fejlődésének modellezéséhez.

Az RA a cDC1 és cDC2 eredetű in vitro transzkriptumokat a génexpresszió fiziológiai mintázatai felé irányítja.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát
  • Töltse le a PowerPoint diát

Az RA szabályozza a cDC differenciálódásában szerepet játszó transzkripciós faktorok expresszióját

Az NF-κB/REL kötőhelyek túlzott bemutatása RA génnel elnyomott gén promoterekben

Az RA általában aktiválja a génexpressziót, de az RA-kezelés elnyomta sok más kultúra modellünkben egyébként indukált vagy expresszált gén expresszióját. Az Enrichr 38-at használtuk a felülreprezentált transzkripciós faktor-kötő motívumok azonosítására a gének promoter régióiban, amelyek kétszer alacsonyabbak voltak az RA-val kezelt sejtekben, mint a kontroll cDC1 sejtekben: a legmagasabb pontszámot a nukleáris faktor-kB (NF-kB) és a REL TFBS ( TRANSFAC), és a pwm modul JASPAR, P ≤ 10 −20 és −12 (lásd alább)). A cDC1-ben az RA által csökkentett gének jelentősen gazdagodtak az NF-KB által közvetített gyulladásgátló jelátviteli utakban részt vevő gének esetében is (Wikipathways, P = 0, 00004). Az NF-κB motívumokat gazdagítottuk az RA által elnyomott (kettős vagy több) gén promóterei számára is a differenciálódó cDC2-ben (TRANSFAC és JASPAR pwm modul; P 10-9). Így azon túl, hogy szerepet játszik a cDC2 termelésének növelésében a cDC1 és cDC2 differenciálódást elősegítő in vitro körülmények között, az RA elnyomja a gyulladásgátló génprogramokat.

vita

Értékeltük az RA és RAR jelátvitel szerepét a béltrópusi prekurzorokból származó cDC bélspecializált alcsoportjainak generálásában és transzkripciós programozásában in vivo, valamint a cDC1 és cDC2 fejlődésének új in vitro modelljében. Eredményeink azt sugallják, hogy az RA valójában a sejtekre hat, hogy globális hatást gyakoroljon a gén expressziójára a cDC1 és cDC2 vonalakban, és olyan transzkripciós programokat irányít, amelyek vezérlik az alcsoportok létrehozását, valamint a cDC1 és cDC2 bélspecializációját meghatározó funkcionális és fenotípusos tulajdonságok kifejeződését. in vivo. .

Az Flt3L, GM-CSF és RA kombinációja elegendő volt ahhoz, hogy a bél pre-μDC-k in vitro fejlődését CD103 + cDC1 és cDC2-re ösztönözzék, amelyek a sejtfelszíni receptor expressziójában hasonlóak voltak a bélfalban található két alcsoporthoz. Mayer és mtsai. 32 azt mutatta, hogy az Flt3L és a GM-CSF együttesen támogatja az IRF8 és Batf3 függő CD103 + cDC-k kialakulását, de azt találtuk, hogy az RA hiányában keletkezett pre-μDC-eredetű cDC1 sejtje aberráns sejtfelszíni fenotípussal rendelkezik, és kevésbé illeszkedik a bél cDC1-hez . a génexpresszióban, mivel a cDC1 mindhárom tényezővel létrejött. Ezenkívül az RA-val történő tenyésztés lehetővé teszi mindkét hasonló bélrendszerű bél DC kialakulását. A VAD egerekben végzett megfigyeléseinknek megfelelően az RA koncentrációja a proximális SI-ben jelzett mértékben növekszik (

10 nM), növelte a cDC2 és a cDC1 arányát in vitro a μDC előtti utódok között. A magasabb koncentrációk tovább fokozták a fenotípusos specializációt, amint ezt pl. A CD101 és a Clec9a fokozatos felszabályozása. Ezek a megfigyelések alátámasztják az RA kritikus szerepét a cDC normális fejlődésében, és összhangban vannak az RA különösen fontos szerepével a cDC specializációjában a bélben és a GALT-ban, ahol az A-vitamin koncentrációja a legmagasabb. Az itt leírt kultúramodell megkönnyíti a vonatkozó mechanizmusok jövőbeli tanulmányozását.

Transzkripptikus elemzéseink megerősítették, hogy az RA-val tenyésztett pre-μDC-k utódai in vivo jobban mutatják a génexpressziót, mint a bél cDC1 és cDC2, mint egyedül GM-CSF-del és Flt3L-lel tenyésztett társaik. Ez különösen nyilvánvaló volt, amikor alcsoportokat hasonlítottunk össze a cDC1 által differenciálisan expresszált gének expressziója alapján. cDC2 in vivo. Érdekes módon az in vitro származó cDC2 jobban eltért az in vivo társaitól, mint a cDC1, bár RA jelenlétében keletkezett, ami arra utal, hogy ezek különösen érzékenyek és függhetnek a helyi környezeti hatásoktól. Ennek megfelelően a bélből, a bőrből, a limfoid szövetekből és a vérből származó cDC-k génexpressziójának korábbi tanulmányai azt mutatták, hogy a különböző szöveti helyekről származó cDC2-k sokkal jobban különböznek a génexpresszióban, mint a cDC1-ek. 37

Összességében megállapításaink egy olyan forgatókönyvet javasolnak, amelyben a bél DC RA szabályozása BM-ben kezdődik, ahol pozitívan szabályozza a bél-DC prekurzor, pre-μDC fejlődését. A pre-μDC otthon van, és mind a cDC1, mind a cDC2-hez vezet az SI-ben. A bélfalban az RA közvetlenül a pre-μDC-re hat, feltehetően a sorsdöntő transzkripciós faktorok szabályozásával, a cDC2 termelés növelése és a cDC1 és cDC2 gén expressziós programjainak ellenőrzése érdekében, amelyek hozzájárulnak funkcionális specializációjukhoz és fenntartási képességükhöz. immun homeosztázis és immunkoordináció.reakciók behatoló kórokozókra.

mód

Áramlási citometria. A mintákat (egysejtű szuszpenziók) először fluoreszcensen aktivált sejtrendező pufferrel (Hank kiegyensúlyozott sóoldata 2% magzati borjúszérummal) blokkoltuk, amely egér-ellenes FcIII/II receptor antitest 100-szoros hígítását tartalmazta (BD Bioscience, San Jose, CA ). és patkányszérum a monoklonális antitestek nem specifikus kötődésének megakadályozására. A festéshez a következő antitesteket használtuk: CD3-PECy7/CD3-biotin (145-2C11), CD19-PECy7/CD19-biotin (ID3), NK1.1-PECy7/NK1.1-biotin (PK136), CD49b-biotin (DX-5), Ly6G-biotin (1A8), Ter-119-biotin (Ter-119), B220-PECy7/B220-biotin/B220-PerCPCy5, 5 (RA3-6B2), MHCII-AF700/MHCII-FITC (M5/114, 15, 2)/MHCII-biotin (2G9), CD11c-PB (N418), a4p7-APC/a4p7-PE (DATK32), CCR9-APC/CCR9-PE/CCR9-FITC (242503), CD103 - PE/CD103-APC (M290), CD11b-AF700 (M1/70), CD8a-PE (53-6, 7), CD45.1-PerCPCy5, 5/CD45.1-APC, CD45.2-FITC/CD45.2 -PerCPCy5.5 (RA3-6B2), CD135-PE/CD135-PerCP-efluorF710 (A2F10), CD4-AF700 (RM4-5), Sirpa-FITC/Sirpa-PerCP-eFluor710 (P84), TLR3 - PE (11F8)), Clec4a4-PE/Clec4a4-biotin (33D1), CD101-PE (Mousei101), Clec9a-PerCP-eFluor710 (44D2) és Langerin-FITC. A cDC alcsoportokat elemző összes kísérlet tartalmazott élő pre-kapuzást, CD3e-, CD19-, NK1.1-, MHCII + és CD11c + .

Sejtek izolálása a szövetekből

Sejtválogatás. Az előzőleg μDC-t és a pre-cDC-t B16/Flt3L-kezelt egerekből rendeztük. 11 BM sejtet izoláltunk a fent leírtak szerint, és mágnesesen aktivált sejtválogatással gazdagítottuk Miltenyi (San Diego, Kalifornia) pan-DC kitjeivel. A sejteket ezután Aria II vagy III (BD) osztályba soroltuk (CD3, CD19) és NK1.1) -CD11c int B220 + a4β7 + CCR9 - pre-μDC és vonal (CD3, CD19, NK1.1 és B220) - CD11c int MHCII-Sirpa + pre-cDC.

Adopciós átvitel. A besorolt ​​pre-μDC-t (0, 5–1 x 106; CD45.2 vagy CD45.1) retroorbitálisan injektáltuk a befogadónak (CD45.1 vagy CD45.2). A fertőzés után 5-7 nappal kellemes állatokat áldoztak fel.

In vitro tenyészet. Az előzetes μDC-ket Flt3L-kezelt egerekből származó BM-ből szkríneltük, és 0,5 millió sejt/ml, 200 μl/lyuk tenyészettel tenyésztettük 96 lyukú, síkfenekű lemezen, vagy 2 ml/üreg 6-lyukú lemezen, teljes Iscove módosított Deulbecco táptalaj. (10). % delipidált borjúmagzati szérum, 1 x penicillin/sztreptomicin), kiegészítve 100 ng ml -1 rekombináns Flt3L-rel, 10 ng ml -1 rekombináns GM-CSF és RA-val a jelzett koncentrációban. A média a 3. napon változott.

Az aldehid-dehidrogenáz aktivitásának elemzését írták le

Microarray. A teljes RNS-t izoláltuk in vitro származó cDC1-ből és cDC2-ből 100 nM RA jelenlétében vagy hiányában, az Immgen (//immgen.org) által biztosított fenol-kloroformos extrakciós módszerrel. Az RNS integritását egy Agilent Bioanalyzer (Stanford PAN Facility, Stanford, CA) alkalmazásával határoztuk meg. Az egyes minták intakt teljes RNS-ét használtuk amplifikációhoz, jelöléshez és expressziós analízissel végzett hibridizációhoz. A mintákat egy GeneChip egér Gene 1.0 ST Array-vel (Affymetrix, Santa Clara, Kalifornia) hibridizáltuk. A mikrochip adatok feldolgozásához és elemzéséhez a GeneSpring GX 12.6 szoftvert (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia) és a Partek Genomic Suite programot (6.6 verzió, St. Louis, MO) használták.

Statisztikai analízis. A két adatsor közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját Student t-próbájával értékeltük, hacsak másképp nem jelöljük.