elemeket

absztrakt

A máj glükóz felszívódásának zavara (HGU) étkezés utáni hiperglikémiát okoz 2-es típusú cukorbetegségben. Itt megmutattuk, hogy a csökkent Sirt2 májaktivitás rontja a HGU-t elhízott cukorbeteg egerekben. A Hepat Sirt2 túlzott mértékű expressziója növeli a HGU-t az elhízott, magas zsírtartalmú cukorbeteg (HFD) egerekben, és enyhíti csökkent glükóz toleranciájukat. A nem diabéteszes egerekben a csökkent máj Sirt2 csökkenti a HGU-t és károsítja a glükóz toleranciát. A Sirt2 a K126 szabályozó fehérje glükokináz (GKRP) dezacetilezésével elősegíti a glükózfüggő HGU-t. A glükokináz és a GKRP glükózfüggő disszociációja elengedhetetlen a HGU szempontjából, de elhízott diabéteszes egerekből származó, a Sirt2 által kimerített vagy a GKRP acetilációt utánzó mutánsokkal transzfektált hepatocitákban gátolt. A GKRP dezacetilációt utánzó mutánsok elhízott diabéteszes egéreredetű hepatocitákban glükózfüggő módon disszociálnak a glükokináztól, és növelik a HGD és a glükóz toleranciát a HFD által kiváltott vagy db/db elhízott cukorbeteg egerekben. Megmutattuk, hogy a GKRP Sirt2-függő dezacetilezése javítja a károsodott HGU-t, és azt sugallja, hogy ez terápiás célpont lehet a 2-es típusú cukorbetegségben.

Az étkezés utáni hiperglikémia szorosan összefügg a kardiovaszkuláris szövődmények és a letalitás fokozott kockázatával a 2-es típusú 1, 2, 3 típusú cukorbetegségben. A máj glükózfelvétele (HGU) az étrendi exogén glükózbevitel egyharmadát teszi ki 4, a HGU károsodása elhízás és 2-es típusú cukorbetegség esetén étkezés utáni hiperglikémiát okoz 5, 6. A 2-es típusú 5-ös és 7-es típusú cukorbetegségben a HGU károsodásáért a máj glükokinázának nem megfelelő aktiválása felelős, de a HGU pontos mechanizmusát és a glükokináz-károsodás aktiválódását még tisztázni kell.

A glükokináz fontos szerepet játszik az étkezés utáni HGU 8-ban. A glükokináz katalizálja a glükóz foszforilezését glükóz-6-foszfáttá, míg az ellenkező reakciót a glükoneogén enzim a glükóz-6-foszfatáz (G6Páz) katalizálja. A HGU a glükokináz és a G6Páz 9 egyensúlyán alapszik, de a máj G6Páz aktivitása csak étkezés után 90 perc elteltével változik jelentősen. A máj glükokináz-aktivitásának akut növekedése az étkezés utáni vércukorszint-emelkedésre reagálva főként a transzláció utáni mechanizmusnak köszönhető, amely a szabályozó fehérje glükokináztól (GKRP) függ 8. A GKRP egy enzimhez kötődve gátolja a glükokináz aktivitást, a glükóz pedig disszociálja a GKRP-t a glükokináztól, ezáltal aktiválva a 8, 11 glükokinázt. A kis molekulájú glükokináz-GKRP-k, amelyek elősegítik a glükokináz-GKRP-kötés disszociációját, csökkentik a vércukorszintet elhízott diabéteszes egerekben12, jelezve a GKRP fontosságát a vércukorszint homeosztázisának fenntartásában. Ugyanakkor a GKRP szerepe a HGU károsodásában a 2-es típusú cukorbetegségben továbbra sem tisztázott.

Megállapítottuk, hogy a NAD + kimerülése szerepet játszik a HGU károsodásában elhízott cukorbeteg egerekben, és hogy a Sirt2 fontos szerepet játszik ebben a folyamatban a GKRP dezacetilezésén keresztül. Ezenkívül a korlátozott Sirt2-függő GKRP dezacetilezés csökkenti a HGU és a glükóz toleranciát, valamint a Sirt2 túlexpresszió vagy GKRP mutáció, amely utánozza a mimocetilációt, javította a HGU károsodását és javította a glükóz toleranciáját elhízott diabéteszes egerekben.

az eredmény

A NAD + helyreállítása növeli a HGU-t elhízott cukorbeteg egerekben

megkönnyíti

A Sirt2 leütése megakadályozza a NAD + függő HGU-t

A GKRP dezacetilezése megkönnyíti a glükokináz-GKRP disszociációt

A K126 GKRP-n történő dezacetilezése alapvető szerepet játszik a NAD +/Sirt2-függő glükózfelvételben. a - c A GKRP-K126R vagy a vad típusú GKRP-GT (GKRP-WT) adenovírus által közvetített máj-túlexpressziójának hatása a Sick2 máj knockdown egerekben a vércukorszintre (n = 5) ( a ), plazma inzulin (n = 5) 5) ( b ) és a 2-dezoxi-glükóz (2-DG) bevitele a májban, a WAT-ban és a vázizmokban (n = 4) ( c ) glükóz beadása után (2 g/kg). d - f Az NMR-nal kezelt magas zsírtartalmú (HFD) egerekben a GKRP-K126Q vagy a GKRP-WT adenovírus által közvetített máj túlzott expressziójának hatása a vércukorszintre (n = 5) ( d ), plazma inzulin (n = 5) ( e ) és a 2-DG felvétele májban, WAT-ban és vázizmokban (n = 4) ( f ) glükóz beadása során (1 g/kg). * P

Mivel a HGU-t mind a glükóz, mind a 4 inzulin szabályozza, az NAD +/Sirt2 inzulinfüggetlen glükóz tolerancia hatása részben felelős lehet a HGU glükózfüggő szabályozásáért, amely magában foglalja a glükokinázt és a GKRP-t is. Ko-immunprecipitációt és hAG/Ash címkéket használó vizsgálatokban a GKRP-t a Sirt2 közvetlen célfehérjéjeként tervezték. Ezután azt tapasztaltuk, hogy a Sirt2 leütése és a túlexpresszió fokozott és csökkent GKRP-acetilációhoz vezetett az elsődleges májsejtekben, ami arra utal, hogy a Sirt2 dezacetilálja a GKRP-t. A máj Gck génexpressziója megnövekedett a Sirt2 máj leütése után, és csökkent a Sirt2 máj túlzott expressziója után. Ezek a változások a Sirt2 HGU-szabályozásra gyakorolt ​​hatásainak alulbecsüléséhez vezethetnek. Mivel a Sirt2 leütésnek nem volt hatása a primer hepatociták Gck génexpressziójára, ezek a Gck génexpresszió változásai leütési körülmények között és a Sirt2 túlexpressziója a plazma inzulinszintjének az inzulinérzékenységgel korreláló változásának köszönhetők.

A tömegspektrometria és a mutáns GKRP vizsgálatok azt mutatták, hogy a K126 GKRP a Sirt2 céldeacetilezési helye. A GKRP acetilezése előrehaladott a HFD-vel táplált egerek májában, míg a GKRP acetilációja db/db egér hepatocitákban gyengül, és a máj túlzott mértékben expresszálja a K126R májat. Ez arra utal, hogy a K126 fokozott acetilezésen megy keresztül az elhízott diabéteszes májban bekövetkezett Sirt2 aktivitás következtében. A GKRP acetilezése továbbra is csekély változást mutatott a glükóz beadása után, és minimális növekedést mutatott a sovány egerek revakcinációja után, de a Sirt2 leütés fokozta a GKRP acetilezését sovány egerekben. Ezek a megállapítások azt mutatják, hogy a Sirt2 aktivitás elegendő a GKRP dezacetilezéséhez a sovány egerek májában, még éhgyomri és etetési körülmények között is. A GKRP acetilezése nemcsak a dezacetilázt, hanem az acetil-transzferázt is magában foglalja. A revakcináció után a GKRP acetilezésében bekövetkezett enyhe változás alapját képező részletes mechanizmus nem világos, de magában foglalhatja az acetil-transzferázt. A HeLa sejteken végzett vizsgálat a p300-at azonosította a GKRP 24 K5 acetilezéséért felelős acetiltranszferázként, de további vizsgálatra van szükség a tanulmányunkban talált K126 acetilezés mechanizmusának azonosításához.

Az in vivo vizsgálatok azt mutatják, hogy a Sirt2-függő GKRP K126 dezacetilezés fontos szerepet játszik a HGU és a glükóz tolerancia károsodásának patogenezisében elhízott diabéteszes májban. Mivel a GKRP (K126Q) acetilezést utánzó mutációja gátolta a glükózfüggő glükokináz - GKRP disszociációt és csökkentette a 2-DG felvételét egér eredetű hepatocitákban, a máj acetilációt utánzó GKRP (K126Q) expresszáló egereknél csökkent a máj 2-DG felvétele és csökkent glükóz tolerancia és rezisztencia az akadályozott máj 2-DG felvételének NMN-függő javulásával és glükóz intolerancia elhízott HFD-vel táplált egerekben. Másrészt, mivel a glükózfüggő glükokináz - GKRP disszociáció helyreállt, és a 2-DG felvételét fokoztuk dezacetilációt utánzó GKRP mutáns (K126R) túlzott expresszióval db/db egér eredetű hepatocitákban, dezacetilációt utánzó GKRP (K126R) transzdukcióval a HFD-vel táplált egerek és a db/db egerek májában megnövekedett a máj 2-DG felvétele, javult a glükóz tolerancia és az inzulinrezisztencia, annak ellenére, hogy a máj NAD + szintjük nem változott. Továbbá a máj K126R transzdukciója felülmúlta a máj Sirt2 leütés okozta károsodott máj 2-DG felvételét és glükóz intoleranciáját.

Ez a tanulmány feltárta, hogy a NAD +/Sirt2 fontos a HGU szabályozásában, és hogy a Sirt2 lehetővé teszi a glükokináz glükózfüggő disszociációját a GKRP-től a GKRP K126 dezacetilezésével. HFD-vel táplált elhízott diabéteszes egerekben és db/db egerekben a Sirt2 aktivitása csökken a máj NAD + tartalmának csökkenésével, ami fokozza a GKRP acetilezését és károsítja a HGU-t. Sőt, azt tapasztaltuk, hogy a GKRP K126 dezacetilezése enyhíti a csökkent glükóz toleranciát és inzulinrezisztenciát elhízott, diabéteszes HFD-vel táplált egerekben és db/db egerekben. Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a NAD +/Sirt2-függő GKRP deacetilációs szabályozás fontos szerepet játszik a HGU kontrolljában, és hogy ez a szabályozás új terápiás célpont a 2-es típusú cukorbetegségben és az elhízásban, és felelős a HGU károsodásáért.

mód

Sejtkultúra

Biokémiai elemzés

Az elsődleges májsejtekben és a szövetmintákban a NAD + és a 2-DG szinteket NAD/NADH kvantifikációs készlet (BioVision, Mountain View, CA) és egy 2-DG Uptake Measurement Kit (Cosmo Bio, Tokió, Japán) segítségével mértük.

Glükóz tolerancia teszt

Az intraperitoneális glükóztolerancia-vizsgálatokhoz az egereknek intraperitoneálisan 1 g/testtömeg-kg glükózt adtak HFD-vel táplált egereknek és 2 g/testtömeg-kg glükózt az NC-vel táplált egereknek, folyamatos intravénás szomatosztatin intravénás adagolással (3 μg/kg/perc) (Sigma) jugularis katéteren keresztül 1 órával a glükóz beadása előtt. A vércukorszintet egy GLUCOCARD G + Meter (Arkray, Kyoto, Japán) és egy kereskedelmi színmérő készlet (Wako) segítségével mértük. A plazma inzulinszinteket egér inzulin ELISA készlet segítségével mértük (Shibayagi, Gunma, Japán).

Hiperinzulinémiás-hiperglikémiás befogás

Hiperinzulinémiás-hiperglikémiás clamp vizsgálatokat végeztek 4-7 nappal a csatornázás után, a 28. módosításokkal korábban leírtak szerint. A hiperinsulinémiás-hiperglikémiás rögzítést ébren lévő és féktelen, éjszakán át éheztetett egerekben végeztük. A clamp vizsgálat során az inzulint (1,25 mU/kg/perc) (Eli Lilly, Indianapolis, IN) és a szomatosztatint (3 μg/kg/perc) a nyaki katéteren keresztül változtatható mennyiségű, 40% -os glükózoldattal infundálták. vércukorszint 280 ± 30 mg/dl-nél. 50 perc múlva 2-DG-t (200 μmol/kg) adtunk intravénásan 1 percig, és 10 percig 2-DG-s beadás után máj-, WAT- és soleus-izomintákat kaptunk egy 2-DG felvételi vizsgálathoz.

Mennyiségi PCR

A kvantitatív PCR-t a korábban leírt módon hajtottuk végre29. A teljes RNS-t extraháltuk fagyasztott szövet- vagy sejtmintákból az SV teljes RNS-izoláló rendszer (Promega) alkalmazásával. A cDNS-t a teljes RNS-ből szintetizáltuk a PrimeScript RT reagenskészlettel (Takara Bio, Otsu, Japán). A kvantitatív PCR-t SYBR Select Master Mix kit (Life Technologies) felhasználásával kontroll génként 36B4-gyel végeztük. Az ebben a vizsgálatban használt primer szekvenciák kérésre rendelkezésre állnak (36B4, Gck [amely glükokinázt kódol] és G6pc [amely G6Pase-t kódol]).

Western blot és immunprecipitáció

Western-blotot a fent leírtak szerint hajtottunk végre. A májszöveteket és a tenyésztett sejteket jéghideg CelLytic MT sejtlízis reagensben (Sigma) homogenizáltuk proteáz inhibitorokkal. Az immunprecipitációt acetilezett K antitestekkel hajtottuk végre, konjugálva Dynabeads Protein G (Life Technologies) vagy Flag tag antitest konjugált-mágneses gyöngyökkel. A Flag tag, a GKRP acetilezett K-je és a keratin 8 acetilezett K-je immunprecipitációjában használt antitestek anti-DYKDDDDK tag mágneses gyöngyök voltak (1E6, 10 μl/mg fehérje; Wako), anti-AcK (# 9441, 0,2 μl/mg fehérje; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) és anti-AcK (ab21623, 0,2 μl/mg fehérje; Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság). A következő antitesteket kaptuk az immunblotoláshoz: anti-Sirt2 (sc-20966, 1: 500), anti-glükokináz (sc-7908, 1: 500), anti-GKRP (sc-11416, 1: 500) (Santa Cruz Biotechnology ), anti-Sirt1 (07-131, 1: 1000; Millipore, Billerica, MA), anti-Flag (F1804, 1: 1000), anti-β-aktin (A5441, 1: 1000) (Sigma), anti- HA (3F10, 1: 1000; Roche), anti-Halo (G9281, 1: 1000; Promega) és anti-keratin 8 (TROMA-I, 1: 200; Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA). Az immunblot képeket densitometriával számszerűsítettük egy LAS-3000 képalkotón (Fujifilm, Tokió, Japán). A reprezentatív immunblotok levágatlan képeit a Kiegészítő ábra mutatja. 9.

Adenovírus-vektorok

Az adenovírus-vektorokat (Flag-tagged Sirt2, HA-tagged Sirt2, Flag-tagged glucokinase, HA-tagged glucokinase, glucokinase, Flag-tagged GKRP, Flag-tagged K126R GKRP, Flag-tagged K126Q GKRP és U6) egy Adenovirus állította össze Dual Expression Kit (Takara Bio). A Flag-taggel ellátott Sirt1-et kódoló adenovírus-vektort T Kitamura (Gunma Egyetem) biztosította. Izolált hepatocitákat és egereket használtunk minden kísérlethez 24 órával, illetve 3-4 nappal az adenovírus transzfekciója után. Az egerek adenovírusokat (5,0 × 108 plakkképző egységet) kaptak a farokvénába.

Fehérje - fehérje interakciós vizsgálat

A Sirt2 és a GKRP vagy a glükokináz közötti kölcsönhatást fluoreszcens alapú rendszerrel elemeztük a fehérje-fehérje kölcsönhatások detektálására (MBL, Nagoya, Japán), amely fluoreszcens gócként detektálja a fehérje-fehérje kölcsönhatásokat. A májsejteket phAG-jelölt Sirt2, GKRP vagy glükokináz és pAsh-jelölt Sirt2, GKRP vagy glükokináz vektorokkal transzfektáltuk Lipofectamine 3000 Reagens (Life Technologies) alkalmazásával. Az intracelluláris fluoreszcens gócokat fluoreszcens mikroszkóppal (FSX100; Olympus, Tokió, Japán) figyeltük meg.

A GKRP tömegspektrometriás elemzése

A Flag-taggel ellátott GKRP-vel transzfektált HEK293-sejtek teljes sejt-lizátumait immunprecipitáljuk egy anti-DYKDDDDK tag antitesttel (Wako). A fúziós fehérjét DYKDDDDK peptiddel (Wako) eluáltuk, és újra immunprecipitáltuk anti-AcK (Cell Signaling Technology) alkalmazásával. Az immunprecipitátumot 4-12% -os gradiens SDS-PAGE gélen oldottuk fel, és a fehérjetsávot tömegspektrometriás elemzésnek vetettük alá az MS Bioworks (Ann Arbor, MI) részéről. Az ebben a cikkben szereplő vegyületek tömegspektrometriás elemzéséhez lásd az 5. kiegészítő ábrát.

Statisztikai analízis

Az adatokat az átlag ± az átlag standard hibájaként adjuk meg. Statisztikai módszereket nem használtak a minta nagyságának meghatározásához a kísérlet előtt, amely ehelyett előzetes adatokon és korábbi publikációkon alapult. Az állatokat kizártuk a kísérletekből, ha betegségre utaló jeleket mutattak. A variancia-homogenitást több csoport Levene-tesztjével vagy két csoport F-tesztjével vizsgáltuk. A statisztikai elemzést a Student-féle t-teszttel végeztük két csoport és egyirányú ANOVA összehasonlítására a Fisher PLSD post-hoc tesztjével, több csoport összehasonlításához. A különbségeket szignifikánsnak tekintették P-nél