absztrakt

Krónikus mieloproliferatív rendellenességekben számos tirozin-kináz gén vesz részt kromoszóma transzlokációban, de egyes esetekben még mindig léteznek nem szabványosított transzlokációk. Két ilyen esetről számolunk be, amelyek az atipikus krónikus myeloid leukémiának felelnek meg transzlokációval (8; 9) (p22; p24). Fluoreszcens in situ hibridizációval (FISH) a megfelelő metafázisokon egy bakteriális mesterséges kromoszómaszondával, amely 9 p24-nél a janus kinase 2 (JAK2) gént tartalmazta, megoszlást figyeltünk meg mindkét páciensben, jelezve, hogy ez a gén átrendeződött. A 8p22 lokusz különféle jelölt géneket tartalmaz, köztük a pericentriolar material 1 (PCM1) gént, amely már részt vesz a kölcsönös transzlokációkban. A PCM1 gén átrendeződését a FISH mindkét betegben kimutatta. Az RT-PCR megerősítette a JAK2 3'-részének fúzióját a PCM1 5'-es részével. A PCM1-JAK2 kiméra mRNS szekvenciaelemzése azt jelzi, hogy a feltételezett fehérje PCM1 tekercsdoménnel és JAK2 tirozin-kináz doménnel rendelkezik. Ez az új transzlokáció a JAK2-t az antitrosin-kináz aktivitású vegyületek potenciális terápiás célpontjaként azonosítja.

A fő

A krónikus myeloproliferatív rendellenességek közül a krónikus myeloid leukémia paradigma, mivel összefüggésbe hozható az Abelson (ABL) tirozin-kináz gént érintő kölcsönös transzlokációval (Heisterkamp et al., 1983). A t (9; 22) (q34; q11) transzlokációja egy tirozin-kináz aktivitású BCR-ABL fúziós fehérjét eredményez, amelyet egy kis vegyület, az imatinib-mezilát (STI571) képes blokkolni (Druker és mtsai, 2001). A CML (atipikus CML) klinikai jellemzőivel rendelkező betegek egy részében más tirozin-kinázokat kódoló gének is szerepelnek, például a PDGFRA (Baxter et al., 2002; Trempat et al., 2003) és a PDGFRB (Baxter et al., 2003).

Ebben a tanulmányban két atipikus CML esetről számolunk be, azonos t (8; 9) (p22; p24) transzlokációval. Az új transzlokációban részt vevő egyik jelölt gén nagy valószínűséggel a tirozin-kináz aktivitással rendelkező fehérjéket kódoló gének csoportjába tartozik. A janus kinase 2 (JAK2) gén jó jelölt, mert 9p24-nél található. Valójában a JAK2-t a T-ALL (Lacronique et al., 1997), a B-ALL és az atipikus CML (Peeters és mtsai, 1997) számos esetben írták le, amelyekben a TEL/ETV6-hoz olvadtak össze. Ezenkívül számos csoport (Baxter és mtsai, 2005; James és mtsai, 2005; Levine és mtsai, 2005) arról számolt be, hogy az egyetlen megszerzett JAK2-aktiváló mutációt (Val617Phe) a legtöbb policitémia verában, esszenciális trombocitémiában és idiopátiás mielofibrosis, hangsúlyozva ennek a kináznak a myeloproliferatív betegségekben betöltött szerepét.

Az általunk elvégzett vizsgálatok azon a feltételezésen alapultak, hogy a JAK2 gén átrendeződött két beteg tumorsejtjeiben. Lehetővé tették egy új reciprok transzlokáció jellemzését PCM1 fúzióval 8p22-nél JAK2-vel 9p24-nél.

Az 1. beteget, egy 46 éves férfit 1998 januárjában kórházba szállították aszténia, fogyás és vérhibák miatt. Fizikális vizsgálat során a beteg sápadt bőrt mutatott, de a máj vagy a lép megnagyobbodásának jeleit nem mutatta. A laboratóriumi eredmények vérszegénységet (hemoglobin = 11,9 g/dl), hiperleukocitózist (WBC = 11,8 × 109/l) és normális vérlemezkéket mutattak. A leukocitaszám 28% éretlen granulocitát, 2% eritroblasztot mutatott, de nem volt hipereozinofília. A csontvelői kenet és a trefin biopszia megerősítette a csontvelő hiperpláziáját myelofibrosisban, de myelodysplasia nélkül. A csontvelő sejtek kromoszomális elemzése izolált t (8; 9) (p22; p24) transzlokációt mutatott ki Philadelphia kromoszóma nélkül. A végső diagnózis atipikus CML volt. A beteget Hydrea-val kezelték, és 1998 augusztusában allogén csontvelő-transzplantációt kapott. 1 hónap múlva felépült a vérképzésből, de 1999 januárjában hemofagocita szindrómával járó fertőző tüdőgyulladásban halt meg.

A 2-es beteget, egy 44 éves férfit 2004 novemberében kórházba szállították, miután egy hónapos kórelőzményben a jobb supra clavicularis tömeg kar-bénulással és áll (V-koponyaideg) érzéstelenítéssel történt. Abban az időben a vérsejtek száma hiperleukocitózist mutatott (WBC = 45, 8 × 109/l), 21% eozinofil, 30% éretlen granulocita, 4% blaszt és 1% eritroblaszt. A csontvelő aspiráció hipercelluláris volt, és a peroxidáz-pozitív mieloblasztok 54% -át és az eozinofilek 24% -át tette ki. A myelodysplasia jeleit nem figyelték meg. Az atipikus CML hátterében kialakult eozinofíliával diagnosztizálták az AML M2 diagnózisát. A kromoszómális analízis kóros kariotípust mutatott, izolált t (8; 9) transzlokációval (p22; p24). A pácienst kombinált kemoterápiával kezelték, ideértve az Idarubicint és az Aracytint, amely meningealis profilaxishoz társult. Egy hónap után teljes remissziót ért el. A kezelést sugárterápiával fejezték be a belépéskor diagnosztizált szilárd anyagig.

Különböző ABL-re és FGFR1-re specifikus FISH-próbákat (8p11) teszteltünk, és két esetben megerősítették e gének átrendeződésének hiányát (az adatokat nem közöljük). Ezért kerestük a 8p22 és 9p24 jelölt gének jelenlétét. A 9p24-re jelentett többszörös gének vizsgálata erősen jelezte, hogy tirozin-kinázt kódoló JAK2 érintett. Ezenkívül a JAK2-t számos esetben akut limfoblasztos leukémia és krónikus mieloproliferatív rendellenességek írták le (9; 12) (p24; p13) (Lacronique et al., 1997; Peeters et al., 1997). Ezen okokból a metafázisos kromoszómákat FISH alkalmazásával teszteltük a megfelelő JAK2 BAC próbával (RP11-927H16), amelyet a biotin nick-transzlációval jelöltünk, amint azt korábban leírtuk (Trempat et al., 2003). Mindkét esetben osztott jelet rögzítettünk: az egyik részt a 9p24 kromoszómán, a másikat a 8p22 kromoszómán (1. ábra, 1a. Ábra).

atípusos

FISH elemzés: Fluoreszcencia in situ hibridizáció JAK2 próbával (BAC RP11-927H16), illetve biotinnal és digoxigeninnel jelölt PCM1 próbával (BAC RP11-484L21), nick-fordító készlet (Amersham Pharmacia biotech) felhasználásával a gyártó utasításai szerint. 1. beteg: (1a) FISH JAK2 szondával (Baxter és mtsai.). A jel megoszlik a származtatott 9. és 8. kromoszóma között (nyilak). (1b) FISH a JAK2 (zöld) és a PCM1 (piros) szondákkal, ez a két jel fel van osztva (nyilak: fúziós jelek a származtatott 8. és 9. kromoszómán). 2. beteg: metafázis (2a) és a megfelelő FISH (2b) JAK2 (zöld) és PCM1 (piros) szondákkal, ez a két jel fel van osztva (nyilak: fúziós jelek). A többi jel nem transzlokált 8 és 9 kromoszómának felel meg. Ebben a két esetben a JAK2 és a PCM1 átrendeződik.

Teljes méretű kép

A 8p22 lokuszt nézve a legjobb jelölt a pericentrioláris 1 anyag génje (PCM1) volt, amelyet korábban egy reciprok transzlokációban leírtak, amely fúziós gént generált RET-szel a 10q11-nél (Corvi et al., 2000). Ezért primerkészleteket terveztünk a JAK2 3'-kódoló szekvenciáin belül (amelyek megfelelnek a TK-doménnek) és a PCM1 5'-es kódoló régiójában, és létrehoztuk az összes RNS RT-PCR-analízisét mindkét beteg tumorsejtjeiből. A 4 kb-os terméket 1-es beteg RNS-sel kaptuk (2. ábra). Szekvenálás után ez a termék megfelelt a feltételezett 9401 bp mRNS-nek. A PCM1-JAK2 kiméra transzkript nyitott leolvasási keretrendszere azt mutatta, hogy a PCM1 37-es exon (NM_006197) a JAK2 9-es exonnal (NM_004972) volt keretben. Ez a szerkezet bemutatja a PCM1 összes tekercselt tekercs doménjének és a JAK2 tirozin kináz doménjének megőrzését (3. ábra). A JAK2-PCM1 reverz transzkriptum a megfelelő primerekkel volt kimutatható (2. ábra). Körülbelül 700 bázispár értékű PCR-terméket nyertünk 2363 bp-os kereten belüli fúzióval. Jelentős RNS-lebontás miatt az RT-PCR a 2. betegben sikertelen maradt. A PCM1 és a JAK2 fúzióját azonban a FISH mindkét betegben megerősítette (1b., 2a., B. Ábra).

A PCM1-JAK2 kiméra transzkriptum RT-PCR elemzése: A teljes RNS-t Trizol-módszerrel (Gibco-BRL) extraháltuk, és reverz átírást végeztünk a Marathon cDNS Amplification kit (BD Biosciences) segítségével. A PCR-t BD-vel, előnyösen 2 PCR enzimrendszerrel (BD Biosciences) végeztük a gyártó utasításainak megfelelően. A 4 kbp-os és a 700 bp-os PCR-terméket PcmF/JakK és JakC/PcmO primerekkel kaptuk (lásd az alábbi szekvenciákat). Minden PCR-reakciót vakon hajtottunk végre, amely egy PCR-keveréknek volt megfelelő bemenő cDNS nélkül. Az ábrán bemutatott vak a PCM1-JAK2 PCR reakció negatív kontrolljának felel meg. A PCR termékeket QIAquick PCR tisztító készlet (Qiagen) segítségével tisztítottuk. A JakF belső primert használtuk a töréspont szekvenálására a PCM1 és a JAK2 között az ABI Prism Dye Terminator kit (Perkin-Elmer Applied Biosystem) segítségével. PcmF IndexTerm 5′-TACAGCTGTCAGCTGCTAGTGTGGG-3 ’; PcmO IndexTerm 5′-TGGGCTCCCACCGTTTCACCTTCTT-3 ′; JakK IndexTerm 5′-CATCTGGGCATCCATCTGGTCTTGG-3 ′; JakF IndexTerm 5′-CTCGTCTCCACAGACACATACTCCAT-3 ′; JakC IndexTerm 5′-ACTGGAAACGGTGGAATTCAGTGGTC-3 ′

Teljes méretű kép

Az új fúziós átirat szekvenciája:( a ) A kiméra PCM1-JAK2 gén nyitott leolvasási kerete. ( b ) PCM1, PCM1-JAK2 és JAK2 mRNS szerkezete. CCD, tekercselt tekercs domén; JH2, JAK2 JAK homológia/pszeudokináz domén; PTK, fehérje tirozin kináz

Teljes méretű kép

Vizsgálatunk során a JAK2 partner gén a PCM1, amely egy 228 kD fehérjét kódol, amely amino-terminális részében több potenciálisan tekercselt tekercs domént tartalmaz (Balczon et al., 1994). Ez a fehérje a citoplazmatikus szemcsékben található, centrioláris műholdaknak nevezik. A PCM1 aktivitás blokkolását célzó kísérletek akár anti-PCM1 antitestekkel, akár kis interferáló RNS-ekkel a centrosomális fehérjék rendellenes összeállításához és a mikrotubulusok szerveződéséhez vezetnek, ami arra utal, hogy a PCM1 kulcsfontosságú szerepet játszik ezekben a folyamatokban (Dammermann et al., 2004), különösen a sejtciklusban (Balczon és mtsai., 2002). A PCM1 gén egy olyan kromoszóma régiónak felel meg, amely gyakran elveszik a rákos megbetegedésekben (Emi et al., 1992; Bhattacharya et al., 2003), de szerepe a t (8; 10) (p22; q11) transzlokációban a pajzsmirigy nyelőcső papillájában. a rák felhívta a figyelmünket a kiméra fehérjékben, például a PCM1-RET-re gyakorolt ​​lehetséges következményeire. Ezenkívül az utóbbi esetben partnere tirozin-kináz aktivitású receptor (Corvi és mtsai, 2000).

Mivel a PCM1 relatív mindenütt jelenlévő expressziója létezik, valószínű, hogy a PCM1 promoter elnyomja a PCM1-JAK2 fúziós gén expresszióját, amelyben a karboxicsoport a JAK2 katalitikus aktivitásának felel meg. A PCM1 aminoterminális részében a multi-kötő domének jelenléte miatt lehetséges, hogy a PCM1-JAK2 kiméra oligomerizáción megy keresztül, ami a JAK2 tirozin kináz domén aktivációjához vezet. További in vitro kísérletek szükségesek annak megerősítéséhez, hogy a JAK/STAT és PI3′-Kinase/AKT útvonalak konstitutív módon aktiválódnak a PCM1-JAK2 autofoszforilációra adott válaszként.

Itt két esetet írtunk le egy új transzlokációs variánsról, amely PCM1 és JAK2 géneket tartalmaz. E két partnergén azonosítása segítené az ilyen transzlokációval járó mieloproliferatív rendellenességek új eseteinek további jellemzését és a kezelés utáni maradvány betegség nyomon követését. Betegeink klinikai megjelenése kissé eltérõ volt, de mindkettõnek volt háttere az atipikus CML-ben. Az egyik beteget azonban krónikus fázisban diagnosztizálták hipereozinofília nélkül, míg a másikat akut fázisban (keringő éretlen csontvelő sejtek robbanásválsággal és hipereozinofíliával).

Ígéretesebb perspektívában feltételezhető, hogy a JAK2 jó célpont új antitozin-kináz aktivitású vegyületek számára.

köszönöm

Köszönjük Dr. Storlazzi, a Milánói Egyetem és Dr. Max Chaffanet, az INSERM U119, Marseille, a BAC JAK2 (RP11-927H16) és a PCM1 (RP11-484L21) nagylelkű ajándékát. Külön köszönet Dr. Fabienne Meggetto és Jean-Pierre Jaffrezou, INSERM U563 CPTP, Toulouse, Franciaország, a kézirat kritikus olvasatáért.

Támogatások: Cancéropole Grand Sud Ouest, a Rák elleni Liga, a Gers és a Haute Garonne bizottságai