absztrakt

Antiapoptotikus és proapoptotikus markerek expressziójának vizsgálata diabéteszes retinákban.

mód

Összesen 12 szemet vizsgáltunk hat, cukorbetegségben szenvedő alanyból, és 10 szemet öt, nem diabéteszes, ismert szembetegség nélküli egyénből, akik kontroll alanyként szolgáltak. Immunhisztokémiai technikákat alkalmaztunk a ciklooxigenáz-2 (Cox-2), az Akt (a protein-kináz B), a Mcl-1, a Bad, a citokróm c, az apoptózist indukáló faktor (AIF), a tumor nekrózis faktor receptor-1 fehérjével kapcsolatos halál ellen. (TRADD) és a Fas-asszociált halálfehérje (FADD).

az eredmény

Az összes cukorbetegség nélküli alany retinájában a Cox-2, Akt és Mcl-1 antiapoptotikus molekulák esetében a ganglion sejtekben citoplazmatikus immunreaktivitást figyeltek meg. A Cox-2 citoplazmatikus immunfestését a retina pigment hámsejtjeiben is beszámolták. A mitokondriális apoptogén fehérjék, a citokróm c és az AIF gyenge immunreaktivitásáról beszámoltak a fotoreceptorok belső szegmenseiben, a külső plexiform réteg belső harmadában, a belső magréteg sejtjeiben, a belső plexiform rétegben és a ganglionban. sejtek. A többi vizsgált ellenanyag esetében nem volt immunreaktivitás. Valamennyi diabéteszes retina de novo citoplazmatikus immunreaktivitást mutatott a Bad esetében ganglionsejtekben és alkalmi sejtekben a belső magrétegben. A citokróm c és az AIF fokozott immunreaktivitásáról számoltak be. A Cox-2, Akt és Mcl-1 immunreaktivitása nem változott a diabéteszes retinákban. A TRADD és FADD esetében nem volt immunreaktivitás.

következtetések

A diabéteszes és nem diabéteszes retinák ganglionsejtjei a Cox-2, Akt és Mcl-1 antiapoptotikus molekulákat expresszálják. A retina ganglion sejtjei kifejezik az Evap proapoptotikus molekulát, válaszul a cukorbetegség által kiváltott idegsejtkárosodásra. A diabéteszes retinák a mitokondriális citokróm c és AIF fehérjék upregulációját mutatják.

A fő

Úgy tűnik, hogy az apoptózis által okozott sejthalál, a genetikai programok irányítása alatt álló, szigorúan kontrollált esemény fontos szerepet játszik a diabéteszes szövődmények kialakulásában és patogenezisében. Számos in vitro és in vivo vizsgálat kimutatta, hogy a hiperglikémia által kiváltott oxidatív stressz az idegsejtek oxidatív károsodásához vezet, ami viszont aktiválja a neuronok apoptózisával összefüggő halálozási utakat. A diabéteszes patkányok 1, 2, 3 retinája fokozott oxidatív stresszt mutatott, az antioxidánsok beadása pedig gátolta a retinopathia kialakulását. 4, 5, 6 A közelmúltban dokumentálták az ideg retina sejtek apoptózisának növekedését patkányok kísérleti cukorbetegségében és emberekben a diabetes mellitusban. Ez az apoptózis által okozott sejthalál krónikus neurodegenerációhoz vezet, amelyben a neuronok elvesznek a diabéteszes retinákban, mielőtt más szövettani patológia kimutatható lenne. 7, 8

A cukorbetegségben szenvedőknél az idegsejtek túlélését és a retina apoptózisát szabályozó molekuláris mechanizmusokat nem sikerült teljesen azonosítani. Egy korábbi tanulmányunkban kimutattuk, hogy a diabéteszes retinák ganglionsejtjei a kaszpáz-3, Fas és Bax apoptózist elősegítő tényezőket expresszálnak, ami arra utal, hogy ezek a sejtek a legkiszolgáltatottabb populáció. Számos más mediátort azonosítottak, amelyek antiapoptotikusak vagy proapoptotikusak. Ide tartoznak, de nem kizárólag, a szerin/treonin protein kináz Akt (más néven protein kináz B), ciklooxigenáz-2 (Cox-2), Mcl-1, Bcl-2-asszociált halál promoter (Bad), citokróm c, apoptózis. indukciós indukáló faktor (AIF), tumor nekrózis faktor-1 receptorhoz kapcsolódó domén halálfehérje (TRADD) és Fas-asszociált halálfehérje (FADD).

Kimutatták, hogy az Akt megvédi az idegsejteket az apoptózistól azáltal, hogy befolyásolja a sejtek túlélésének szabályozásában szerepet játszó számos transzkripciós faktor aktivitását. 11., 12., 13., 14., 15., 16. Számos tanulmány kimutatta, hogy a Cox-2 túlélési tényezőként funkcionál azáltal, hogy megvédi a sejteket az apoptózistól. 17, 18, 19, 20, 21 A Bcl-2, 22 családba tartozó Mcl-1 túlzott expressziója sokféle szerrel késlelteti az apoptózist. A 18., 21., 23., 24., 25., 26. A gonosz a Bcl-2 géncsalád proapoptotikus tagja, amely a Bcl-2 és Bcl-xL antiapoptotikus fehérjék megkötésével és funkcióinak gátlásával elősegíti az apoptózist. A mitokondrium kulcsszerepet játszik az apoptotikus sejthalál ellenőrzésében. Az apoptotikus folyamat kezdetén a mitokondriumok számos apoptotikus fehérjét szabadíthatnak fel a citoszolban, mint például a citokróm c és az AIF. 27, 28 A TRADD és FADD adaptereket tartalmazó haláldomén kulcsfontosságú fehérjeként működik a ligandum által indukált programozott sejthalál (apoptózis) mechanizmusában, amely a Fas receptorokból (CD 95/APO-1) és az 1. típusú tumor nekrózis receptorokból származik. a kaszpáz-8 a TRADD és FADD révén kaszpáz aktiválódáshoz és az azt követő apoptózishoz vezet. 29.

A diabéteszes retinákban az idegsejtek apoptózisát szabályozó molekuláris mechanizmusok azonosítása olyan terápiás stratégiák kidolgozása szempontjából előnyös, amelyek módot nyújtanak a retina idegsejt halálának késleltetésére vagy megakadályozására a cukorbetegeknél. Ezért immunhisztokémiai technikákat alkalmaztunk az Akt, Cox-2, Mcl-1, Bad, citokróm c, AIF, TRADD és FADD apoptózisával összefüggő markerek expressziójának vizsgálatára a cukorbeteg betegek retináiban és a cukorbetegek nélküli retinákban .

mód

Vizsgálati populáció

Hat diabétesz mellitusban szenvedő egyén után 12 emberi szemet kaptunk egy postmortem donortól. Korábban egyetlen alanynál sem volt retina fotokoaguláció. Öt olyan személytől is kaptunk 10 szemet, akiknek anamnézisében nem volt cukorbetegség vagy szembetegség, ezt durva kóros vizsgálat állapította meg. A donor szemeit az emberi szövetek kutatására vonatkozó Helsinki Nyilatkozat rendelkezéseinek megfelelően szerezték be és használták fel a vizsgálat során. A minták laboratóriumba érkezése után azonnal 3 mm-es bemetszést végeztek a limbus hátulján, és a szaruhártyát, az íriszt, a lencsét és az üvegtestet óvatosan eltávolították. A retinát és az uvealis szövetet elválasztottuk a környező szövetektől, 4% paraformaldehidben rögzítettük és paraffinba ágyazottuk.

Immunhisztokémiai festés

Asztal teljes méretben

Asztal teljes méretben

Negatív kontrollként az elsődleges antitest kihagyását vagy helyettesítését ugyanazon faj irreleváns antitesttel, és csak kromogénnel történő festést alkalmaztuk. A vastagbél- és mellrákos betegek metszeteit használtuk pozitív kontrollként. A kontroll betegek metszeteit egy egyetemi kórházban (Leuveni Egyetem, Belgium) kezelt betegektől vettük, teljes összhangban a Helsinki Nyilatkozat elveivel.

Az összes szakaszt két független megfigyelő (AMA, KG) vizsgálta. Egyikük (KG) nem tudott a minták eredetéről. Egyet nem értés esetén a megvakult megfigyelő eredményeit használták. A két megfigyelő közötti eltérés kevesebb, mint 5% volt. A festést az immunreaktivitás jelenléte vagy hiánya, az immunreaktivitás intenzitása, a festés vastagsága és a festés homogén vagy heterogén jellege alapján osztályoztuk.

az eredmény

A donor életkorát és nemét, a cukorbetegség típusát, a cukorbetegség időtartamát, az artériás hipertónia jelenlétét vagy hiányát, a retinopathia státuszát, a halál okát és az enukleációs halálozási időket a 3. táblázat foglalja össze. esetek (1. és 2. eset). A retina állapota három esetben nem volt ismert (3., 4. és 5. eset). Ezekben a szemekben nem voltak hisztopatológiai változások, amelyek diabéteszes retinopathiára utalnának. Egy esetben (6. eset) nem volt retinopathia.

Asztal teljes méretben

expressziója

Retina fotomikrográfia egy cukorbeteg alanyról. A lényegtelen antitesttel azonos módon kezelt negatív kontrolllemez nem jelzett. NFL, idegrostréteg; GCL, ganglion sejtréteg; IPL, belső plexiform réteg; INL, belső magréteg; OPL, külső plexiform réteg; ONL, külső magréteg; IS, a fotoreceptor sejtek belső szegmensei; OS, a fotoreceptor sejtek külső szegmensei; RPE, retina pigment hám. (Eredeti nagyítás × 100).

Teljes méretű kép

Asztal teljes méretben

A ciklooxigenáz-2-re immunfestett, nem cukorbeteg alany retinás mikroszkópos felvételei immunreaktivitást mutatnak a ganglion sejtekben (nyilak) (a) és apoptózist indukáló tényező, amelyek immunreaktivitást mutatnak a fotoreceptorok belső szegmenseiben, a plexiform réteg külső harmadának belső harmadában, a sejtmagban réteg, belső plexiform réteg és ganglion sejtek (b). A rövidítéseket az 1. ábra jelmagyarázata határozza meg. (Eredeti nagyítás × 100).

Teljes méretű kép

Hasonló eredményeket jelentettek az összes diabéteszes retinában. De novo citoplazmatikus immunreaktivitás a Bad esetében a ganglion sejtekben és a belső magréteg több sejtjében volt megfigyelhető (3a. Ábra). A granulált citokróm c és AIF immunreaktivitás szabályozását figyelték meg a fotoreceptorok belső szegmenseiben, a külső plexiform réteg belső egyharmadában, a belső magréteg sejtjeiben, a plexiform belső rétegében és a ganglion sejtekben. A 3b. Ábra ezen fehérjék expressziójának reprezentatív eredményét mutatja. A Cox-2, Akt és Mcl-1 immunreaktivitásának megoszlása ​​és intenzitása a diabéteszes retinákban nem változott a nem cukorbetegek retináihoz képest. A TRADD és FADD esetében nem volt immunreaktivitás.

A Bad-re festett diabéteszes alany retinás mikroszkópos felvételei ganglionsejtek immunreaktivitását mutatják (nyilak) (a) és apoptózist kiváltó faktorok, amelyek az apoptózist kiváltó faktor immunreaktivitását (b) mutatják. A rövidítéseket az 1. ábra jelmagyarázata határozza meg. (Eredeti nagyítás × 100).

Teljes méretű kép

vita

Ebben a tanulmányban a következő pontokat mutattuk be: (1) a retina ganglion sejtjei konstitutív módon expresszálták az Akt, Cox-2 és Mcl-1 antiapoptotikus molekulákat; (2) a diabétesz indukálta az Evil proapoptotikus molekula de novo expresszióját a retina ganglion sejtjeiben; és (3) a diabéteszes retinák a mitokondriális citokróm c és AIF fehérjék upregulációját mutatták.

A szerin/treonin protein kináz Akt, egy downstream foszfatidil-inozitol (PI) 3-kináz effektor (PI 3-kináz), kulcsszerepet játszik a neuronális sejtek túlélésének és a neuroprotekció közvetítésében. Orike és mtsai. A 11. ábra kimutatta, hogy a felnőtt szimpatikus idegsejtek túlélése neurotróf tényezők hiányában a PI 3-kináz/Akt jelátviteltől függ. Számos tanulmány kimutatta, hogy a PI 3-kináz/Akt út fő szerepet játszik a retina ganglion sejtjeinek axotomia utáni túlélésére adott válasz közvetítésében a különböző növekedési faktorokra. 12, 13, 14 Ezenkívül a retina idegsejtjeinek szérummegvonással indukált apoptózisát az inzulin csökkentette a PI 3-kináz/Akt út aktiválásával. Ezen túlmenően a retina PI 3-kináz/Akt jelátviteli útja látóideg befogásával aktiválódott, és neuroprotektív hatással volt a sérült retina ganglion sejtekre. Eredményeinkkel összhangban a foszforilált Akt immunreaktivitását detektáltuk a retina ganglion sejtjeiben a sérült retinában. 16.

A Cox enzimek közvetítik a prosztaglandinok termelését az arachidonsavból. Két Cox izoformát, a Cox-1 és a Cox-2-t azonosítottuk. A Cox-1 konstitutív módon expresszálódik a legtöbb szövetben, és úgy gondolják, hogy felelős a prosztaglandinszint fenntartásáért a különböző háztartási funkciók esetében. Ezzel szemben a Cox-2 a közvetlen korai gén terméke, amely gyorsan indukálható és szorosan szabályozott. A Cox-2 expressziója különféle szövetekben indukálható kóros ingerekkel, például bakteriális lipopoliszacharidokkal, gyulladásgátló citokinekkel, növekedési faktorokkal, hormonokkal és daganatpromotorokkal. Noha indukálható izoformának nevezik, a Cox-2 konstitutív módon expresszálódik az agyban, a gerincvelőben, a herékben, a trachealis epitheliumban és a vese makula densusában. Ezekben a szövetekben a Cox-2 látszólagos stimulációs folyamatok nélkül van jelen, és azt tekintik a domináns Cox izoformának. Kimutatták, hogy a Cox-2 konstitutív módon hozzájárul az élettani szabályozáshoz és a fejlődéshez ezekben az erősen differenciált szervrendszerekben. 17.

A legfrissebb adatok azt mutatták, hogy az enzimatikus aktiválódásából származó Cox-2 és prosztaglandinok részt vesznek a sejtnövekedés, az angiogenezis, az apoptózis és a neoplazia kialakulásának szabályozásában. A szelektív Cox-2 inhibitor gyengítette a retina angiogenezist, amely a koraszülöttek retinopátiáját és a retina normális fejlődését kíséri. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Cox-2 fontos szerepet játszik mind a retina fejlődési, mind a patológiás angiogenezisében. Ezenkívül számos tanulmány felvetette a Cox-2 szerepét az agy neuronális működésében. 32, 33 Ezenkívül számos tanulmány kimutatta a Cox-2 közvetlen szerepét az apoptózis-rezisztens sejtek biztosításában azáltal, hogy növeli a Mcl-1 expressziót a PI 3-kináz/Akt-függő út aktiválásával. 18, 21 Ebben a vizsgálatban a Cox-2 citoplazmatikus immunreaktivitását figyelték meg a retina ganglion sejtjeiben, a retina pigment hámsejtjeiben, valamint a ciliáris test hámjának pigmentált és nem pigmentált rétegeiben diabéteszes és nem diabéteszes retinákban, megerősítve a korábbi jelentéseket. 31, 34, 35, 36 Az Akt, Cox-2 és Mcl-1 antiapoptotikus molekulák expressziója a retina ganglion sejtjeiben tükrözheti azt a tényt, hogy a neuronok hajlamosak az egyén egész életében fennmaradni.

Ebben a vizsgálatban Bad-t ganglionsejtekben és a belső magréteg számos sejtjében fejezték ki diabéteszes retinákban. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a retina ganglion sejtjei fokozzák a rossz expressziót a cukorbetegség által kiváltott idegsejtkárosodásra reagálva. Hasonló megfigyeléseket írtak le Chen és mtsai. 37, aki kimutatta, hogy a retina idegsejtjeinek neurotoxin által kiváltott degenerációja de novo Bad expressziót váltott ki a retina ganglion sejtjeiben. Ezenkívül a retina központi artériájának elzáródása által okozott átmeneti retina ischaemia a ganglion sejtréteg és a belső magréteg sejtjeiben a gyenge expresszió upregulációját indukálta. 38

Számos in vitro és in vivo vizsgálat kimutatta, hogy a hiperglikémia által kiváltott oxidatív stressz szorosan összefügg a különböző sejttípusok apoptózisával. Az oxidatív stressz szerepet játszik a mitokondriális funkció károsodásában és a programozott kaszpázsejt halálozási útjának aktiválásában diabéteszes neuronokban. 1., 2., 3. Széles körű bizonyíték van arra, hogy a reaktív oxigénfajok részt vesznek a mitokondrium kiváltásában, hogy az apoptózis számos lényeges szereplőjét, például a citokróm c-t és az AIF-et felszabadítsák a citoszolba. 28, 49 Számos tanulmány kimutatta, hogy az oxidatív stressz fokozódik a cukorbetegségben szenvedő retinában, és úgy gondolják, hogy fontos szerepet játszik a diabéteszes retinopathia kialakulásában. Az antioxidánsok beadása gátolta az apoptózist kiváltó kaszpáz-3 enzim aktiválódását és gátolta a retinopathia kialakulását. 5, 6 Nemrégiben kimutatták a cukorbetegség által kiváltott retina mitokondriális diszfunkciót és a citokróm c fokozott felszabadulását a patkány retinájából előállított citoszol frakcióba. 50

Bár ezek a megfigyelések leíró jellegüknél fogva nem teszik lehetővé e molekulák működésének pontos megértését, azt sugallják, hogy a retina ganglion sejtjeinek védő mechanizmusai vannak az apoptózis elleni védelemhez, hogy a retina ganglion sejtjei Bad-t fejeznek ki a cukorbetegség által kiváltott neuronokra reagálva. és hogy a diabéteszes retinák a mitokondriális fehérjék, például a citokróm c és az AIF upregulációját mutatják.