A mikroRNS-ek a természetben előforduló rövid, nem kódoló RNS-molekulák nemrégiben felfedezett osztályai, amelyek negatívan szabályozzák az eukarióta gén expresszióját a cél mRNS 3'-UTR-jében lévő komplementer szekvenciákhoz való kötődés révén. Gyorsan gyűlnek a bizonyítékok arról, hogy a diszfunkcionális mikroRNS expresszió a hematológiai rosszindulatú daganatok közös jellemzője. 1 A talán krónikus limfocita leukémia (CLL) kivételével azonban a mikroRNS-ek szerepe a hematológiai rosszindulatú daganatokban nem ismert; Különösen a limfómában rendellenesen expresszált mikroRNS-eket még nem azonosították szisztematikusan. Ennek a problémának a kezelésére mikroarray elemzést alkalmaztunk a mikroRNS expressziójára összpontosítva a hematológiai sejtvonalak széles körében (n = 40), beleértve a B- és T-sejtes lymphomák összes fő típusát (n = 29), a jóindulatú limfoproliferatív rendellenességeket, perzisztens poliklonális B-sejtes limfocitózis (PPBL; n = 3), akut T-sejtes limfoblasztos leukémia (T-ALL; n = 6) és akut myeloid leukémia (AML; n = 2; 1. táblázat). Ezeknek a mintáknak a normális származási sejtjeikkel való összehasonlításához, valamint a mikroRNS-ek szerepéhez a limfociták fejlődésében megvizsgáltuk az expressziót a B-limfociták és az érett T-sejt alcsoportok fő fejlődési szakaszaiban is (n = 12; 1. táblázat). . ).

Asztal teljes méretben

A mintákat (kb. 107 sejt) először mikroRNS-sel dúsított frakciókba tisztítottuk Qiagen (Crawley, Egyesült Királyság) miREase oszlopai és 500 ng Cy3 vagy Cy5 jelzéssel, a Genisphere Array 900microRNA RT kitjével (Hatfield, PA, USA). A 12 egészséges egyedből összegyűjtött tonzilláris anyagot használták mint referenciaanyagot a színkiegyensúlyozott kialakítású kísérletekhez. A mintákat hibridizáltuk mikro-sugarakkal (μRNS microarray), amelyek az érett mikroRNS-próbák humán és EBV-eredetű érzékeinek teljes készletét tartalmazzák (MirBase v.9.2), amelyeket egymás mellé négyszeresen töltöttünk be. A szondaszekvenciák a www.microRNAworld.com címen érhetők el. A mezők érzékenységét, specifikusságát és reprodukálhatóságát a leírtak szerint teszteltük (S1 - S3 további ábrák). A kiválasztott mikroRNS szintjét kvantitatív RT-PCR-rel (qRT-PCR) mértük a fent leírtak szerint, U6-ot használva kontrollként.

mikroarra

Az emberi mikroRNS expressziójának hőtérképe 40 hematológiai sejtvonalban és 12 limfocita alcsoportban, mikroarray elemzéssel mérve. A sejtsorok részleteit az 1. táblázat tartalmazza. Ellenőrzetlen klaszteranalízist végeztünk az expressziós szintek alacsony normalizált logaritmikus arányán (minta/referencia) (négy ismétlés átlaga). A kiterjesztett dendrogram megjelenik a hőtérkép oldalon.

Teljes méretű kép

Huszonhét mikroRNS-t azonosítottak differenciálisan expresszáltként (módosított P * és miR-96), és a sejtvonalakban magasan expresszálták, mint a normális limfocita mintákat (2a-c. Ábra).

( a ) A differenciálisan expresszált (módosított P4, és érett B és T sejtekben erősen expresszálódik, ahol a pro-pre-B sejtekből való átmenetet szabályozza) a mikroRNS expressziós szintje. Ramkissoon és munkatársai 5 korábban arról számoltak be, hogy a miR-223 nem blot humán B-sejtekben, eredményeink és Landgraf és mtsai.4 eredményei azt találták, hogy ezt a mikroRNS-t normális limfocitákban expresszálták, de nem B- vagy T-sejtvonalakban, a mieloid sejtvonalak kivételével, következetes a myeloid differenciálódásban betöltött szerepével (2d. ábra). Ramkissoon és mtsai. 5 azonban miR-223 expressziót mutattak ki B-sejtekben, amikor oldat-hibridizációt alkalmaztak az alacsonyabb érzékenységű technika helyett, és a miR-155-et északi elemzéssel mindkét esetben észlelhetetlennek B vagy T sejtek 5, de később fontos szabályozónak bizonyultak e sejtek fejlődésében. 6 A B és T sejt alcsoportok expressziós profiljának összehasonlításával hat mikroRNS-t azonosítottunk differenciálisan expresszálva (miR-92, miR-342, miR-559, miR -768, miR-146b és miR-125a). erősebben expresszálódtak a T-sejtekben, mint a B-sejtekben (3a., d. és e. ábra).

A differenciálisan expresszált (módosított P6) mikroarray mikroRNS expressziós szintjei azt tapasztaltuk, hogy a B-sejtek in vitro aktivációja IL-2 vagy IgM stimulációval tizenegy mikroRNS expressziójában változott, ezek többsége (9/MiR-7 és miR-132 (2b. Ábra aca 3b, fg) Ezzel szemben a B-sejtek fejlődésének terminális szakaszai (memória/plazma sejtek) társultak a downregulációhoz (10/11.) differenciálisan expresszált mikroRNS-ek, köztük miR-181a, amelyek hasonlóan csökkentik a T-sejt érlelésére adott választ (3c. És 3. ábra). Érdekes módon ezek közül a mikroRNS-ek közül hármat, a miR-17, miR-20b és miR-106a, szintén azonosítottak a B-sejt aktivációban szabályozottnak. Ezek a mikroRNS-ek szintén a 17-92 klaszter részét képezik, ami a B-sejtek differenciálódásának eddig ismeretlen funkciójára utal.

Noha a sejtvonalak mikroRNS-profiljai nagyrészt tükrözik a diagnózist, nagyon kevés olyan mikroRNS-jelölt van, amelynek expressziója egyértelműen összefüggött egy specifikus diagnózissal, ami arra utal, hogy az egyes mikroRNS-ek a limfóma osztályozásra korlátozódhatnak. Az egyetlen kivétel a miR-148a volt, amely erősen expresszálódott a mielómában, de más B- vagy T-sejtvonalakban vagy limfocitákban nem (4c. És h. Ábra). Kevéssé ismert a miR-148a, bár kiderült, hogy az aktiváló KRAS mutációkat tartalmazó kolorektális daganatokban fel van szabályozva. Az ilyen mutációk gyakoriak a mielómában, de ritkák a nem Hodgkin-limfómában. Ezenkívül ez a mikroRNS a HOX A klaszter közvetlen közelében helyezkedik el, amely a hematopoiesis fontos szabályozója, amelyet aberránsan expresszáltak AML-ben és mielómában. Érdekes módon a miR-148a egyik célpontja, amely több predikciós algoritmus (PicTar, TargetScan és miRanda) közös, a MAFB, a myeloma gyakori genetikai elváltozása. Más mikroRNS-eket nem kizárólag diagnosztikai osztályozással, például miR-153-mal társítottak, amely bár HL-ben magasan expresszálódik, de más B-sejtvonalakban vagy limfocitákban nem, de a T-ALL sejtvonalakban is felülszabályozott (4e. És i. Ábra) ).

A differenciáltan expresszált mikroarray mikroRNS-ek expressziós szintje (módosított P 2 azt találta, hogy az ABC típusú sejtvonalak (OCI-Ly3, OCI-Ly10, HLY-1 és HBL-1) és a GCB típusú sejtvonalak (SU-DHL4, SU-DHL6 és SU- DHL10) egyértelműen csoportosultak (1. ábra), a miR-155, a miR-221, a miR-222 és a miR-21 az ABC sejtvonalakban szabályozva volt, és ezeket a megállapításokat kiterjesztettük a miR-363 és miR-518a (amelyek nem szerepeltek) Meghatároztuk azokat a mikroRNS-eket is, amelyeket a GCB-típusú sejtvonalakban szabályoztak, beleértve a miR-181a, miR-590, miR-421 és miR-324 (4m és n ábra), és folyamatban van a ezek a mikroRNS-ek a DLBCL klinikai mintákban, amint azt korábban bemutattuk, a miR-155, a miR-21 és a miR-221 magasabb szintjei társultak az ABC immunfenotípussal a betegeknél.

A hematológiai rosszindulatú daganatok és a jóindulatú rendellenességek összehasonlításához megvizsgáltuk a PPBL limfoproliferatív rendellenességből származó lymphoblastoid sejtvonalakat. Ezek a sejtvonalak a miR-132 és miR-155 szignifikáns újraszabályozását mutatták, míg a miR-550 és miR-641 szabályozása alacsony volt (4b. És g. Ábra). Érdekes módon mind a miR-132-et, mind a miR-155-et endotoxin-stimulációval indukálták, ami valószínűleg tükrözi az e rendellenességre jellemző erős dohányzással való összefüggést.

Az EBV-eredetű mikroRNS-ek expressziós szintje az EBV-vel fertőzött sejtvonalakban, mikroszkóppal mérve. Összehasonlítás céljából bekerült a Ramos EBV-sejtvonal.

Teljes méretű kép

Érdekes, hogy a miR-155 expressziója a BL-ben az EBV III. Ezzel az elképzeléssel összhangban azt tapasztaltuk, hogy a miR-155 magasan expresszálódik a PPBL Raji és Granta-519 sejtvonalakban, de nem az EBV-BL Ramos sejtvonalban vagy a II. Típusú késéssel fertőzött YT sejtvonalban. Mint azonban már említettük, Daudiban nem találtuk ennek a mikroRNS-nek az expresszióját. Ennek oka lehet az EBV fertőzés abnormális jellege ebben a sejtvonalban, amelynek deléciója magában foglalja az EBNA2-t és az EBNA5 egy részét, és nincs LMP-expressziója.

Míg a mikroRNS termelésének egyéb vizsgálatai tartalmaznak néhány hematológiai sejtvonalat és/vagy a limfociták részhalmazait, addig a 4, 5 az eddigi legátfogóbb tanulmány a mikroRNS expressziójának a limfoid fejlődésben és a rosszindulatú daganatokban. Nemrégiben Landgraf et al. 4 klónozott és szekvenált 256 kicsi RNS könyvtár, amelyek 98 vérképző könyvtárat tartalmaznak. Noha nem közvetlenül egyenértékű, a kilenc közös sejtvonal összehasonlítása hasonló expressziós mintákat mutatott (S4. Kiegészítő ábra).

Az azonosított mikroRNS-ek többségéhez rendelkezésre álló funkcionális információk hiánya miatt szerepük a limfociták fejlődésében és a rosszindulatú daganatokban csak jövőbeni vizsgálatokkal valósulhat meg, ahol ez a tanulmány értékes kiindulópontnak bizonyul.