transzkripciós

  • absztrakt
  • a cél:
  • mód:
  • az eredmények:
  • következtetés:
  • bevezetés
  • mód
  • elemeket
  • Antropometriai mérések
  • A testösszetétel értékelése
  • Biokémiai elemzések
  • Zsírbiopsziák és mRNS extrakció
  • Statisztikai analízis
  • az eredmény
  • vita
  • Tanulmányi korlátozások

absztrakt

Az adiponektin termelést moduláló szabályozási folyamatok és a κB (NF-κB) nukleáris faktor transzkripciós aktivitásában szerepet játszó mechanizmusok emberi adipocitákban még nem teljesen ismertek. Vizsgálatunk célja a testzsír, a zsíreloszlás, a szisztémás gyulladás, az inzulinrezisztencia, a leptin és a tumor nekrózis faktor alfa (TNF-α), az adiponektin és a kappa szérumban és szubkután szövetében lévő génexpressziós gének szintjének összefüggéseinek értékelése volt. B-alfa-gátló. (IkB-a), testtömeg-index (BMI) széles tartományú egyéneknél. Azt is meg akartuk határozni, hogy ezek közül a változók közül melyik kapcsolódik leginkább az adiponektin gén expressziójához és az NF-κB adipocita transzkripciós kapacitáshoz.

mód:

Összesen 27, 50 és 80 év közötti nőt vizsgáltak, akiknek BMI-je 22,1 és 53,3 kg/m2 között változott. Minden alanynál BMI, derékbőség, testösszetétel kettős röntgenabszorpciós módszerrel, trigliceridek, koleszterin, nagy sűrűségű lipoprotein koleszterin (HDL-Ch), glükóz, inzulin, homeosztázis modellek, inzulinrezisztencia (HOMA) értékelése, rendkívül érzékeny C reaktív értékeltük a fehérjéket (hs-CRP), a szérum adiponektint, a leptint és a TNF-a-t. A szubkután zsírszöveti biopsziákat minden alany hasáról vettük, és meghatároztuk az adiponektin, TNF-α és IkB-α mRNS szinteket.

az eredmények:

A BMI és a derék kerülete pozitívan társult a leptinnel, a HOMA-val és a hs-CRP-vel, negatívan a HDL-Ch-vel; a sáv adiponektinnel és IκB-α mRNS-sel is társult. A HOMA negatívan társult a szérum adiponektinhez és az adiponektin mRNS-hez. A Hs-CRP negatívan kapcsolódott az IκB-a mRNS-hez, és pozitívan társult a HOMA-hoz. A BMI, a sávkörfogat, a trigliceridek, a HDL-Ch, a HOMA, a hs-CRP, a leptin, a szérum és a TNF-a mRNS együttes hatásának meghatározása az adiponektin gén expressziójára többszörös regressziós elemzést hajtottunk végre: a sáv kerülete és a leptin egyaránt szerepel a legmegfelelőbb regressziós egyenlet: az adiponektin gén expressziójának előrejelzése (R2 = 0,43, P = 0,006). Szekvenciális többszörös regressziós elemzést végeztünk, az IκB-α mRNS-t tekintve függő változónak, és a BMI, a sáv, a HDL-Ch, a HOMA, a hs-CRP és az adiponectin mRNS-t használtuk független változóként. Az adiponektin mRNS volt az egyetlen változó, amely visszafejlődött (R2 = 0,406, P1,2). Kimutatták, hogy nem minden elhízott egyénnek van magas C-reaktív fehérje (CRP), hanem csak azoknak, akik inzulinrezisztensek. szoros kapcsolat az inzulinrezisztencia és a gyulladás között.

A zsírszövet számos gént expresszál, amelyek a szekréciós fehérjéket kódolják, sokféle hatással: 4 egyre több bizonyíték támasztja alá azt az elképzelést, hogy az adipocita szekréciós termékek részt vesznek egy olyan mechanizmusban, amely egyesíti az elhízást és az inzulinrezisztenciát, egyesek javítják az inzulinérzékenységet, mások pedig javítják. 4 Ezen túlmenően ezen adipocitokinek egy része gyulladáscsökkentő, míg mások gyulladáscsökkentő. 4, 5

Az adiponektin egy viszonylag nemrégiben felfedezett zsírszövet-specifikus fehérje, inzulin-szenzibilizáló, gyulladáscsökkentő hatása 4, 5, 6, 7, és alacsonyabb a plazmakoncentrációja elhízott betegeknél, mint szegény egyéneknél. 4, 5, 6, 8 Az adiponektin és az inzulinérzékenység kapcsolata erősebb, mint az adiponektin és az adipozitás kapcsolata. Negatív összefüggést figyeltek meg az adiponektin és a CRP között. 10., 11. A gyulladásos markerek, az inzulinrezisztencia, a leptin, a hasi elhízás és az adiponektin gén expressziója közötti összefüggés még vitatott.

Ezek a kapcsolatok különösen relevánsnak tűnnek, mivel nemrégiben bebizonyosodott, hogy az adiponektin lokális gyulladásszabályozóként működhet a hím sertés szubkután adipocitákban, ahol a kB (NF-kB) nukleáris faktor gátlásával hat. 12.

Az NF-κB a citoplazmában megmarad a kappa B (IκB) gátló faktor család gátló fehérjéivel való kölcsönhatás révén. 13, 14 A sejtes ingerek széles spektrumára reagálva az IκB-α disszociálódik az NF-κB komplexről, majd proteolitikusan lebomlik. Ez a folyamat magában foglalja az IκB-α foszforilezését az IκB kináz (IKK) család tagjai által. Az IκB-α lebomlása az NF-κB "aktiválásához" vezet, amelyet az NF-κB komplex transzlokációjaként határozunk meg a citoplazmából a sejtmagba. A magba kerülve az NF-KB kötődik specifikus DNS-promoter elemekhez, és a releváns gének transzkripcióját indukálja, beleértve a gyulladásgátló citokineket, számos kemokint és sok vaszkuláris endoteliális sejtadhéziós molekulát, 13, 14 (1. ábra).

Az NFκB aktiválásának mechanizmusa.

Teljes méretű kép

A gyulladásos ingerek, mint például az endotoxin és a citokinek, kimutatták, hogy az intranukleáris NF-κB növekedését indukálják, míg a gyulladásgátló szerek az IκB-α expresszió és a fehérje szint növekedését okozzák. 15, 16

Az NF-κB aktivitást szabályozó mechanizmusok az emberi zsírsejtekben azonban még mindig nem ismertek. Feltételezik, hogy az adiponektinnek helyi gyulladáscsökkentő hatása lehet azáltal, hogy növeli az IκB-α fehérje expresszióját és szintjét az adipocytában.

Vizsgálatunk célja a testzsír, a zsíreloszlás, a szisztémás gyulladás, az inzulinrezisztencia, a leptin és a TNF-α, az adiponektin és az IkB-α génexpressziós szintek közötti összefüggések értékelése volt a szérumban és a szubkután zsírszövetben, széles testtömeg-index (BMI), valamint annak meghatározása, hogy ezek a változók közül melyik a legrelevánsabb az adiponektin gén expressziója és az adipocita NF-κB transzkripciós potenciálja szempontjából.

A szisztémás gyulladás értékeléséhez a hs-CRP-t, egy jól elfogadott helyettesítőt mértük, míg az NF-κB aktivitást az IκB-α citoplazmatikus inhibitorának génexpressziójának meghatározásával értékeltük.

mód

elemeket

Összesen 27, 50 és 80 év közötti nőt vizsgáltak testtömeg-indexekkel (BMI) 22,1 és 53,3 kg/m2 között.

Valamennyi beteg állapota jó volt, amit a teljes kórtörténet, a fizikális vizsgálat, valamint a normál vérkép, a kémiai vizsgálati elem és a vizeletvizsgálat állapított meg. Minden egyén súlya stabil volt az elmúlt 6 hónapban, és nem volt rák, máj, vese vagy pajzsmirigy bizonyítéka. Az American Diabetes Association Association kritériumai szerint hét nőnek csökkent glükóz toleranciája, két nőnek pedig 2-es típusú cukorbetegsége volt. 17 Az alanyok egyike sem kapott inzulint, tiazolidindionokat, semmilyen hipoglikémiás vagy zsírcsökkentő gyógyszert, és rendszeresen nem kapott gyulladásgátlót sem. Mindegyik posztmenopauzás volt, és nem hormonpótló kezelést kapott. A résztvevők egyike sem vett részt rendszeresen fizikai tevékenységekben.

Minden résztvevő megalapozott beleegyezést adott, és a kísérleti protokollt egyetemünk etikai bizottsága jóváhagyta.

Antropometriai mérések

Könnyű belső ruházatú és cipő nélküli alanyok esetében a testtömeget 0,1 kg-os pontossággal (Salus-skála, Milánó, Olaszország) és a magasságot 0,5 cm-es pontossággal mértük sztadiométerrel (Salus-stadiométer, Milánó, Olaszország). A BMI-t a négyzethez igazított testtömegként (kg/m2) számoltuk. A szalag kerületét mérőszalaggal kaptuk meg, amely minimális kerülete a xifuszos folyamat és a köldökzsinór között.

A testösszetétel értékelése

A testösszetételt kettős energiájú röntgenabszorpciós spektrometriával (DXA) mértük (Hologic QDR 4500, Waltham, MA, USA).

A DXA mérésének jellemzőit és fizikai fogalmait máshol írták le. Naponta 18 minőségbiztosítási tesztet hajtottak végre a gyártó utasításainak megfelelően. Az összes vizsgálatot ezt követően egy képzett kutató elemezte. Az összes testzsírt kg-ban (FM) és a test tömegének százalékában (FM%) fejeztük ki. A lágyrész sovány tömegét (FFM) teljes testtömegnek tekintettük, levonva az összes testzsír és csonttömeg összegét, és ezt kg-ban fejeztük ki. A variációs együttható (CV) a kettős meghatározáshoz 11 alanyban (66-77 éves nők) 1% volt FM esetén, 2,3% FM% -nál és 1,3% FFM-nél.

Biokémiai elemzések

Az összes metabolikus meghatározáshoz vénás vérmintákat vettünk át egy éjszakai böjt után. A plazma glükózszintet glükózanalizátorral (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, Kalifornia, USA) mértük. A teszten belüli CV 1,5% volt.

Az immunológiailag reaktív plazma inzulint duplikált méréseknek vetették alá kettős antitest radioimmun vizsgálattal kereskedelmi készlet segítségével (Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, USA). Az érzékenység 6 pmol/l volt, és a CV CV értéke 4,9%.

Az inzulinrezisztenciát a HOMA (inzulinrezisztencia homeosztázis értékelése) módszerrel értékeltük. 19.

A koleszterin és a triglicerid szintjét Technicon Auto analizátorral (Technicon Inc., Co., Tarrytown, NY, USA) határoztuk meg, és dextrán-magnézium kicsapást alkalmaztunk a nagy sűrűségű lipoproteinek (HDL) elválasztására.

A szérum leptint egy specifikus ELISA készlettel (DBC-Diagnostic Biochem Canada Inc., London, Ontario, CA) mértük. Az érzékenység 0,5 ng/ml volt, és a CV a teszt és az interteszt során 7, 4 és 9, 6%.

A szérum adiponektint egy kereskedelemben kapható ELISA készlet segítségével mértük (Linco Research Inc., St. Charles, MO, USA). Az érzékenység 0,5 ng/ml, a CV a teszt és az interteszt során 7,4, és 8,4% volt.

A szérum TNF-α-t kereskedelemben kapható készlet (Medical Systems) segítségével mértük kemoillumineszcenciás módszerrel; érzékenység 1,7 pg/ml, CV a tesztben és az interassay-ben 3, 6 és 6, 5%.

A Hs-CRP-t immunoturbidimetriás módszerrel mértük. A kimutatási küszöbérték 0,5 mg/l volt. A referencia intervallum 3 mg/l volt. Az analitikai variabilitás 5% volt.

Zsírbiopsziák és mRNS extrakció

A zsírszöveti biopsziákat reggel vették, miután egy éjszakán át böjtöltek a szubkután hasból (periumbilikusan). A biopsziákat aspirációs tűvel vettük fel. A zsírszövetet izotóniás sóoldattal alaposan mossuk, majd fagyasztjuk a későbbi RNS extrakcióhoz.

A valós idejű PCR (RT-PCR) lehetővé teszi az adiponektin RNS, IkB-α és TNF-α mennyiségi meghatározását. Röviden, a teljes RNS-t az RNeasy Mini Kit (Qiagen, GMBH, Hilden, Németország) alkalmazásával extraháltuk, és az IScript Syntax Syncesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) alkalmazásával reverz átírást végeztünk. Az RT-PCR-t iCycler termociklerrel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) hajtottuk végre, IQSYBR Green PCR SuperMix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) és 300 pmol/ml mindkét primer pár felhasználásával. Az amplifikációs körülmények a következők voltak: 95 ° C 5 percig, 50 ciklus 95 ° C-on 30 másodpercig, 60 ° C 30 másodpercig és 72 ° C 30 másodpercig. Az alapozókat az alapozók, az önfelszívás, a hiányzó alapozás és az amplikon hosszára tervezték és optimalizálták a kereskedelmi forgalomba kerülő Beacon Design 4.0 szoftverrel (Premier Biosoft International, Palo Alto, Kalifornia, USA). Valamennyi primert hasonló GC-tartalommal terveztük, és ugyanazon 60 ° C hőmérsékleten hevítettük. A primereket az MWG Biotech AG (Ebersberg, Németország) szállítja. Az eredményeket Ct értékként számszerűsítettük, ahol a Ct az a PCR küszöbciklus, amelynél az amplifikált terméket először kimutatták, és a cél és a kontroll arányában fejeződik ki (p-aktin).

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlagként ± sd Log transzformációk hajtották végre szokatlan változók esetén. A változók közötti kapcsolat tesztelésére Pearson-korrelációt használtunk. Többszörös regressziós analízist alkalmaztunk egymás után és egymás után a független változók adiponektin és IκB-α génexpresszióra gyakorolt ​​együttes hatásainak tesztelésére.

A korrelációs elemzésekhez elvégzett tesztek nagy száma miatt az összes változóra szignifikáns P 20 szintet alkalmaztak

az eredmény

A vizsgált minta főbb jellemzőit az 1. táblázat tartalmazza.

Asztal teljes méretben

A 2. táblázat az antropometrikus, az FM% DXA, a metabolikus változók, a hs-CRP, a szérum adiponektin, a leptin, a TNF-a és az adiponectin, a TNF-α és az IkB-α mRNS-szintje közötti mátrix korrelációt mutatja be.

Asztal teljes méretben

A BMI és a derék kerülete pozitívan társult a leptinnel, a HOMA-val és a hs-CRP-vel, negatívan a HDL-Ch-vel. Az útlevél negatívan társult az adiponektinnel és az IκB-α mRNS-sel is. A HOMA negatívan kapcsolódott a HDL-Ch-hez, a szérum adiponektinhez, az adiponectin mRNS-hez, és pozitívan társult a leptinhez. A Hs-CRP negatívan társult a HDL-Ch és IkB-a mRNS szérummal, míg a HOMA pozitívan.

A BMI, a derékbőség, a trigliceridek, a HDL-Ch, a HOMA, a hs-CRP, a leptin, a szérum és a TNF-a mRNS együttes hatásának meghatározása az adiponektin gén expressziójára többszörös regressziós elemzést hajtottunk végre: mind a sávot, mind a leptint belefoglaltuk. az adiponektin gén expressziójának előrejelzéséhez a legmegfelelőbb regressziós egyenletben (R2 = 0,43, P = 0,006) (3. táblázat).

Asztal teljes méretben

Szekvenciális többszörös regressziós elemzést hajtottunk végre, az IκB-α mRNS-t függő változónak tekintve, és az összes IκB-α-val összefüggő változót a kétváltozós elemzések során (BMI, sávkerület, HDL-Ch, HOMA, hs-CRP és adiponectin mRNS) változók. Az adiponektin mRNS volt az egyetlen változó, amely regresszióba lépett (R2 = 0, 406, P 4, 5, 6

A derék kerülete és az adiponektin mRNS szintje közötti negatív összefüggésekre vonatkozó megállapításaink összhangban vannak a korábbi jelentésekkel, amelyek azt mutatták, hogy az adiponektin gén expressziója alacsonyabb volt a hasi elhízásban szenvedő, elhízott egyéneknél, mint a szubkután elhízás esetén. 2, 4, 5, 21

A várakozásoknak megfelelően és a korábbi jelentésekkel 22 23 összhangban szignifikáns összefüggést figyeltünk meg a BMI, a sáv és az inzulinrezisztencia között, a HOMA értékelése szerint, valamint a BMI, a sáv és a hs-CRP között. 1, 24

Korábban erős összefüggést figyeltek meg a gyulladás és az elhízás között 1, és a hs-CRP magas szintjét a férfiak 35% -ánál és a nők 60% -ánál jelentették, akiknek a BMI-értéke meghaladja a 30 kg/m2-t. Így, bár sok elhízott egyénnél magas a hs-CRP szintje, ez nem mindig így van. Felvetették, hogy az inzulinrezisztencia előfordulása lehet az egyik oka annak, hogy az elhízott egyének magas szintű gyulladásos markert mutatnak. 3 Negatív összefüggés a sáv és az adiponektin mRNS, az adiponektin mRNS és a HOMA szint között, valamint a hs-CRP és a HOMA közötti pozitív kapcsolat azt jelentheti, hogy az adiponektin asszociáció lehet a hasi elhízás, az inzulinrezisztencia és a gyulladás között. Ezért nagyon fontos az adiponektin gén expresszióját szabályozó mechanizmusok tanulmányozása. Amikor szekvenciális többszörös regressziós elemzést végeztünk BMI, sáv, trigliceridek, HDL-Ch, HOMA, hs-CRP, leptin, szérum TNF-α szintek és mRNS alkalmazásával független változóként, és az adiponektin gén expresszióját függő változóként, csak a sáv kerületét és A leptin (down- és upregulatory effektusokkal) bekerült a legmegfelelőbb regressziós egyenletbe, és az adiponectin gén expressziójának variációinak 40% -át tette ki. A HOMA értékelése szerint az inzulinrezisztencia volt az utolsó változó, amelyet alanyunkban eltávolítottunk a visszafelé irányuló modellből.

Ezek a megállapítások a HOMA által értékelt inzulinrezisztencia és az adiponektin génexpresszió közötti független összefüggés hiányára utalnak, és ellentmondani látszanak Fasshauer és munkatársai (25) által végzett in vitro kísérleteknek, amelyek azt mutatták, hogy az adiponektin gén expressziója inzulinszint csökkent. Ezzel szemben Lihn et al. 26 megfigyelte, hogy az adiponektin mRNS szintje pozitív korrelációban volt az inzulinérzékenységgel egészséges egyéneknél, de a 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő betegek rokonainál nem, ami arra utal, hogy ez a szabályozás hiánya az inzulinrezisztencia státuszának tudható be az 1. fokozatú rokonokban, a 2-es típusú cukorbetegeknél.

Azonban a leptin és az adiponektin gén expressziós sáv közötti független összefüggésről tett megállapításaink nagyon érdekesek. Számos in vitro vizsgálat nem mutatott összefüggést a leptin és az adiponektin génexpressziója között, vagy valóban negatív korrelációt mutatott, 27, 28, de az adiponectin gén expressziójának fokozott szabályozását is javasolják a leptinnel. Egyénjeinknél a leptinszintek szignifikánsan összefüggésben voltak a HOMA-val és a derék kerületével, míg a leptin és az adiponektin gén expressziója közötti összefüggés csak az övre történő beállítás után következett be (r = 0,48, P = 0,016).

Adataink arra is utalnak, hogy az adiponektin gén expressziója pozitívan kapcsolódik az IκB-α-hoz, amelyről ismert, hogy az NF-κB transzkripciós aktivitást hajtja végre. Egyénjeinkben az IκB-α mRNS negatívan társult az útlevéllel és a hs-CRP-vel, és pozitívan kapcsolódott az adiponektin gén expressziójához. A szekvenciális többszörös regressziós analízis során, az IκB-α mRNS-t használva függő változóként, az adiponektin mRNS volt az egyetlen változó, amely regresszióba lépett, magyarázva a variancia 40% -át. Ezek az eredmények kiegészítik és kiterjesztik a korábbi jelentéseket. 7, 12 Valójában korábban kimutatták, hogy az adiponektin gátolhatja az endotheliális NF-κB jelátvitelt, és hogy az adiponektin az NF-κB transzkripciós faktor részleges gátlásával szabályozhatja a sertés adipocita gyulladását. Nemrégiben felvetették, hogy az NF-κB adipocyták aktivitása fontos szerepet játszhat az elhízással járó gyulladás és metabolikus változások szabályozásában. Így az adiponektin génexpresszió és az IκB-α mRNS közötti, az egyéneknél megfigyelt szignifikáns független kapcsolat arra utal, hogy ha az adiponektin gén expressziója magas, akkor magasabb az IκB-α expresszió és az NF-κB transzkripciós aktivitás gátlása alacsonyabb gyulladással adipocita szinteken.

Tanulmányi korlátozások

Tudomásul kell vennünk tanulmányunk néhány korlátját. Először az IκB-α mRNS-t teszteltük aktivitás helyett. Az elhízott egyének alacsony IκB-α mRNS-re vonatkozó megállapításait ezért körültekintően kell értelmezni, és ezeket az IκB-α és mRNS aktivitás, valamint az NF-κB aktivációs intézkedések értékelésével kell megerősíteni. Nemrégiben azonban az RT-PCR alkalmazása az IκB-a mRNS mérésére hatékony módszernek bizonyult az NF-κB transzkripciós erejének számszerűsítésére. 29.

Másodszor az inzulinrezisztenciát értékeltük a klinikai vizsgálatokban hasznos, jól elfogadott HOMA alkalmazásával. Vitatható azonban, hogy az inzulinrezisztencia szerepe az adiponektin gén expressziójában relevánsabb lehet, ha kifinomultabb módszereket alkalmazunk az inzulinérzékenység felmérésére. Harmadszor, az adiponektin és az IκB-α közötti szignifikáns összefüggés eredményeink csak a változók közötti összefüggést mutatják, nem okozati összefüggést. Ezért az adiponektin helyi gyulladáscsökkentő hatására vonatkozó hipotézisünket az NF-κB aktiváció gátlásán keresztül további vizsgálatokkal kell megerősíteni az ok-okozati összefüggés értékelésére.

Összefoglalva, tanulmányunk egyértelműen azt mutatja, hogy a derék kerülete pozitívan kapcsolódik az inzulinrezisztenciához és a hs-CRP-hez, valamint negatívan az adiponektin mRNS-hez és az IκB-α adipocitákhoz, és ezáltal az NF-κB transzkripciós kapacitásához. Eredményeink azt is mutatják, hogy mind a hasi, mind a leptin független előrejelzője az adiponektin gén expressziójának; azt is sugallják, hogy humán adipocitákban az adiponektin génexpresszió szorosan kapcsolódik az IκB-α mRNS-hez.