elemeket

absztrakt

Az adiponektin kulcsszerepet játszik a teljes test energia homeosztázisának szabályozásában a glükóz és a lipid anyagcseréjének modulálásával. Bár az elhízás által kiváltott adiponektin-expresszió csökkenése elsősorban a transzkripciós szabályozás sikertelenségének tulajdonítható, a mögöttes mechanizmusok nagyrészt nincsenek meghatározva. Itt megmutattuk, hogy az adiponektin promóter egy bizonyos régiójának DNS hipermetilezése az epipenetikai kontroll révén elnyomja az adiponektin expresszióját, és ezt követően súlyosbítja az elhízás anyagcsere betegségeit. Az elhízás okozta pro-gyulladásos citokinek elősegítik a DNMT1 expresszióját és az enzimatikus aktivitást. Az aktivált DNMT1 szelektíven metilez és stimulálja az adiponektin promoterben a kompakt kromatinszerkezetet, ami megakadályozza az adiponektin expresszióját. A DNMT1 aktivitás elnyomása egy DNMT inhibitor által az elhízás okozta glükóz intolerancia és inzulinrezisztencia javulásához vezetett adiponektin-függő módon. Ezek a megállapítások kritikus szerepet játszanak az adiponektin gén DNMT1 általi epigenetikai szabályozásában az energia homeosztázis kezelésében, ami arra utal, hogy a DNMT1 aktivitásának modulálása új stratégiát jelent az elhízással kapcsolatos betegségek kezelésében.

Az epigenetikus szabályozás, beleértve a DNS-metilezést is, az egyik legfontosabb mechanizmus az eukarióta gén expressziójának szabályozására a DNS szekvencia módosítása nélkül 1. A bizonyítékok felhalmozódása azt mutatta, hogy a DNS-metiláció hidaként szolgál a környezeti változások és a sejtes válaszok között. Nevezetesen, a táplálkozási állapot különböző módon módosítja a DNS-metilációt számos metabolikus génben, beleértve a hepatocita 4α nukleáris faktort, a hasnyálmirigy és a duodenum homeobox 1-jét (Pdx1), a peroxiszóma proliferátor-aktivált receptorát (Ppar) és a coactivaotr -1 α (Pgc-1 α) 2-t, 3 4, 5. Érdekes módon számos jelentés kimutatta, hogy a magas zsírtartalmú étrend (HFD) fogyasztása befolyásolja az inzulinérzékenységgel társuló metabolikus egyensúlyhiányok következő generációjának öröklődésében részt vevő különféle gének epigenetikáját 6, 7 .

Az adiponektin, amely szelektíven expresszálódik az adipocitákban, a glükóz és a lipid anyagcseréjének szabályozásával modulálja az egész testben az energia homeosztázt. Az anyagcsere szövetekben az adiponektin növeli az inzulinérzékenységet, elősegítve a glükóz felhasználását és a zsírsav oxidációt 9, 10. Ezenkívül az adiponektin elnyomja az elhízás által kiváltott immunválaszt és az aterogén kockázati tényezők kialakulását 11, 12. Így az adiponektin vagy egy adiponektin receptor agonista kiegészítése javítja az inzulinérzékenységet és a metabolikus paramétereket elhízott állatmodellekben 13, 14. Érdekes módon az adiponektin expressziója és a szérumszint negatívan korrelál az elhízáshoz és az elhízáshoz kapcsolódó metabolikus betegségekkel, mint például az inzulinrezisztencia, a 2-es típusú cukorbetegség és a szív- és érrendszeri betegségek15.

Általában az adiponektin expresszióját több szabályozási lépésben szabályozzák, például transzkripciós és poszttranszlációs szabályozással, beleértve az oligomer elrendezést és a szekréciót. Elhízás esetén az adiponectin ilyen szabályozó mechanizmusát számos tényező megzavarja, ideértve az adipocita hipertrófiát, a gyulladást és az oxidatív stresszt, ami hypoadiponectinémiához vezet 15, 16, 17. Többek között a növekvő bizonyítékok azt sugallják, hogy az elhízás hipoadiponectinémiája elsősorban transzkripciós kudarcnak tulajdonítható. 19. Fontos, hogy az elhízásban az ilyen diszregulációt közvetítő molekuláris mechanizmust még nem sikerült tisztázni. Különösen azt nem vizsgálták, hogy az epigenetikus változások, például a DNS-metiláció szerepet játszanak-e az elhízás adiponektin-gén expressziójának diszregulálásában.

Ebben a tanulmányban a DNS-metiláció szerepét vizsgáltuk az adiponektin gén expressziójában. Megállapítottuk, hogy az adiponektin promoter hipermetilezése gátolja az adiponectin transzkripcióját. Ezenkívül az adiponektin-promoterben a DNS-metilációt a DNS-metiltranszferáz (DNMT) 1 közvetíti, amelynek expressziója fokozott az adipocytákban elhízott egyéneknél. Ezenkívül az adiponektin expressziójának stimulálása a DNMT1 aktivitás elnyomásával elnyomta a gyulladásos reakciókat és a megnövekedett inzulinérzékenységet elhízott egereknél, ami új betekintést nyújtana az adiponektin gén expressziójának metilációval történő metabolizálási szövődményekben történő átprogramozását támogató mechanizmusokba.

az eredmény

Az adiponektin-promóter elhízott egyéneknél hipermetilezett

A korábbi, 15., 18., 19. jelentésekkel összhangban az elhízott egerek HFD-vel táplált adipocytáiban az adiponektin mRNS szintje szignifikánsan csökkent, míg a legfontosabb adiponektint szabályozó transzkripciós faktorok, köztük a Ppary2 vagy CCAAT/enhancer-kötő fehérje a (C/ebp) mRNS-szintje ) nem módosultak jelentősen (további 1a. ábra). Ez a megfigyelés arra késztetett bennünket, hogy az elhízás esetén az adiponektin transzkripciós repressziójában részt vevő alternatív utak lehetőségére spekuláljunk. A különféle biológiai folyamatok közül a DNS-metiláció az egyik legfontosabb transzkripciós szabályozó mechanizmus, amely a kromatinszerkezet modulálásával ellenőrzi a transzkripciós mechanizmus célhelyekhez való hozzáférését. Ezenkívül a legújabb eredmények azt mutatták, hogy a DNS-metiláció egy aktív szabályozó mechanizmus, amely reagál a táplálkozási címkék változásaira, és többszörös hatással van a szisztémás energia homeosztázisának szabályozására 2, 3, 4, 5, 6, 7 .

okozta

A differenciált 3T3-L1 adipocitákat TNFa-val (10 ng ml-1) vagy IL-1β-val (10 ng ml-1) inkubáltuk 24 órán át vagy anélkül. ( a, b ) az adiponektin, Dnmt1 és Mcp-1 mRNS-szintje. ( c ) a DNMT relatív enzimatikus aktivitása. ( d, e ) R2-biszulfit-szekvencia elemzése és az 5-mC mennyiségi meghatározása. ( f ) Korlátozó enzim hozzáférhetőségi teszt. Az mRNS szinteket qPCR segítségével mértük. ( g ) R2 ChIP elemzés. Az eredményeket ± 3 független minta átlagaként fejezzük ki (n = 3). Hasonló eredményeket értek el legalább háromnál több független kísérlettel. * P

Az egerekhez db/db vagy adiponektint és leptin receptor DKO-t vivőanyaggal (1% DMSO; Veh, n = 4-5) vagy RG108-mal (n = 4-5) injektáltunk. ( a ) A szérum adiponektin szintjét ELISA-val határoztuk meg. b ) Az éhomi glükóz- és inzulinszintek. c ) a szérum TG szintje. d ) OGTT. 16 órás éhezés után az egereknek intraperitoneálisan injektáltunk 1 g testtömeg-kg testtömegű glükózt, és monitoroztuk a vércukorszintet. A vértisztítás és az AUC időbeli alakulását mutatjuk be. ( e ) A gyulladásos gén mRNS szintjét az eWAT-ban vizsgáltuk. Az mRNS szinteket qPCR segítségével mértük. ( f ) A máj szövettani elemzése (H&E festés). Méret, 50 μm. g ) Máj-TG-tartalom. Az eredményeket átlag ± sem * P-ben fejezzük ki

Elhízás esetén a megnövekedett DNMT1 DNS hipermetilációt indukál az adiponektin promoter egy bizonyos régiójában (R2), ami az adiponectin gén expressziójának elnyomásához vezet az adipocytákban.

Teljes méretű kép

Mivel a zsírszövet egyszerre néz szembe egymással összefüggő metabolikus szövődményekkel, beleértve a krónikus gyulladást, az endoplazmatikus retikulum stresszt, a mitokondriális diszfunkciót és az elhízás hipoxiáját 31, 32-ben, megvizsgáltuk, hogy mely tényezők játszanak kritikus szerepet az adiponektin gén expressziójának elnyomásában a DNMT1 által közvetített adipocytákban. a gyulladásos szignálok, mint például a TNFa és az IL-1β, stimulálta a DNMT1 expresszióját/aktivitását és javította az adipociták R2 metilációját R2-ben, ami elnyomja az adiponektin expresszióját. Másrészt a tunicamicin, rotenon vagy hipoxia akut kezelése erősen elnyomta az adiponektin gén expresszióját, függetlenül a DNMT1 expressziójától és az azt követő DNS metilezéstől. Ezeket a kóros fiziológiai állapotokat azonban sok játékos és kereszt-halláspont megosztja, ami végső soron a zsírszövet diszregulációjához vezet31. Így az R2 elhízás által kiváltott in vivo hipermetilációja valószínűleg a zsírszövet diszregulációjában szerepet játszó számos tényező gyulladásgátló válaszainak felhalmozódásának köszönhető.

Ebben a tanulmányban számos jelöltet azonosítottunk, amelyek R2-hez vagy R2-hez kötött fehérjékhez kapcsolódnak a pro-gyulladásos stimulációra válaszul. Növekedett bizonyos típusú transzkripciós szabályozó fehérjék kötődése, amelyek szerepet játszanak a hisztonok R2-n történő módosításában. Például a prolinban és a glutaminban gazdag faktor splicing faktor (SFPQ) és a delta 3-szerű ubiquitin ligáz (DTX3L), amelyek a TNFα-n R2-hez kapcsolódnak, közreműködnek a kromatatin 33, 34 transzkripciós repressziójában és átalakításában. . Ezenkívül, amint azt a 35., 36., 37. további jelentés is sugallja, a DNMT1 képes szelektív DNS-szekvenciákat metilezni úgy, hogy specifikus transzkripciós faktorokkal rendelkező komplexeket képez. Így valószínű, hogy a DNMT1 R2-hez vezet egy adott transzkripciós faktor (ok) val való kölcsönhatás révén, amelynek az R2-hez való kötődését az elhízás megváltoztatná. Ezért egyértelműen fontos a jövőbeni vizsgálatok során tisztázni ezen újonnan azonosított fehérjék szerepét az elhízás által közvetített adiponektin szuppresszióban.

Korábbi tanulmányok foglalkoztak a humán adiponektin egy nukleotid polimorfizmusa (SNP) és a szérum adiponektin 38, 39, 40, 41, 42 szintje közötti összefüggéssel. Érdekes módon két SNP (rs17300539 és rs266729), amelyek szignifikáns összefüggést mutatnak a 43, 44, 45, 46, 46 szérum adiponektin szinttel, az emberi adiponektin promoter R2-jében találhatók, és CpG dinukleotidként szolgálhatnak, mivel C minden SNP (2. kiegészítő ábra). Például a G-A szubsztitúcióval rendelkező humán alanyok (rs17300539 A/A genotípus) magasabb plazma adiponektinszintet mutatnak a plazmában, mint az rs17300539 G/G genotípusú egyének. Hasonlóképpen, a C-től G-ig szubsztitúciós (rs266729 G/G genotípus) embereknél is alacsonyabb az adiponektin plazmakoncentrációja a C/C genotípusú egyénekhez képest. Ezért eredményeink és humán SNP-adatok erőteljesen alátámasztják a DNS-hipermetiláció kritikus szerepét az adiponektin-expresszió elnyomásában.

Összességében ez a tanulmány az egyik legfontosabb szabályozó régiót szemlélteti az adiponectin génben, amelynek DNS-módosítása és a kromatin átalakítása fontos az elhízás által kiváltott adiponectin expressziójának elnyomásában. Ezek az adatok különösen azt mutatják be, hogy az adiponektin expresszióját DNMT-gátlóval lehet stimulálni az elhízással kapcsolatos betegségek elleni potenciális terápiában.

mód

Állatkísérletek

Szérumfehérjék és lipidek mérése

A szérum inzulinszintet enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA) mértük (Shibayagi Co. Ltd., AKRIN-001T). A szérum alanin-aminotranszferáz és az aszpartát-aminotranszferáz aktivitását aktivitás vizsgálati készlet alkalmazásával mértük (Biovision, K752-100, K753-100 és Sigma Aldrich, MAK052-1KT, MAK055-1KT). Vizsgálati készleteket használtunk a szérum TG (Thermo Fischer Scientific Inc., TR22321 és Sigma Aldrich, T2449-10ML) és az FFA mérésére (Roche, 11 383 174 001). A szérum adiponektin szintjét házi ELISA kit segítségével (University of Hong Kong) mértük. Az adiponektin oligomerizálásának elemzését és mennyiségi meghatározását gélszűréssel végeztük, a fentiek szerint 47. Röviden: 10 μl szérumot hígítottunk 1 ml PBS-sel. A hígított szérumokat egy AKTA explorer flash protein kromatográf rendszerre vittük fel, Hiload 16/60 Superdex 200 oszlopon frakcionáltuk (GE Healthcare, 28-9893-35) és PBS-sel eluáltuk 1 ml/perc áramlási sebességgel. Minden 0,5 ml-es frakciót összegyűjtöttünk és ELISA-elemzésnek vetettük alá.

Emberi minták

Az emberi zsírszövetmintákat 12 alanyból nyertük a Szaúd-Arábiai Rijád King Saud Egyetem Orvostudományi Főiskolájának Elhízáskutató Központjából. A protokollt az Orvostudományi Főiskola Etikai Bizottsága, a Szaúd-King Egyetem jóváhagyta, és minden résztvevő írásos tájékozott beleegyezését kapta a vizsgálatba való részvételhez. Az adipocita frakcionálása és a genomi DNS kivonása után az R2 régió adiponektin promóterének metilációs szintjét biszulfit szekvenálással elemeztük. Az RNS kivonása után az RNS-t reverz transzkripcióval komplementer DNS-be (cDNS) írták át, majd kvantitatív valós idejű PCR-ben (qPCR) használták fel.

A zsírszövet frakcionálása és áramlási citometria

Genom DNS tisztítás és biszulfit szekvenálás

A DNS-t fenollal és kloroformos extrakcióval tisztítottuk. A sejteket 1 órán át lízispufferben (50 mM Tris-Cl (pH 8,0), 50 mM etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA; pH 8,0), 100 mM NaCl, 2% SDS és 20 μg ml-1 RNáz) 37 ° C-on lizáltuk. és 10 μg ml-1 proteináz K-val emésztettük 3 órán át 50 ° C-on. A biszulfit konverziót az EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, 59104) segítségével hajtottuk végre. A konvertált DNS-t PCR-rel amplifikáltuk, Methprimer szoftverrel tervezett primerek alkalmazásával (www.urogene.org/methprimer/index1.html). A PCR-körülmények 7 percig 95 ° C-on, 1 percig 95 ° C-on 35 cikluson, 1 percen át 55 ° C-on 30 és 72 ° C-on, majd 10 percig 72 ° C-on. A TOPO TA alkalmazásával baktériumokba klónozott PCR-termékek klónozó készlet (Invitrogen, 450641). Minden mintához nyolc klónt szekvenáltunk a kereskedelmi COSMO Genetech szolgáltatásokkal. A PCR-hez használt primer szekvenciákat a 2. kiegészítő táblázat tartalmazza.

Sejtkultúra és tranziens transzfekció

A 3T3-L1 sejteket az ATCC-től nyertük (CL-173). A 3T3-L1 sejteket összefolyásig tenyésztettük Dulbecco módosított Eagle táptalajában (DMEM; Hyclone, SH30243.01), 10% szarvasmarha borjúszérummal kiegészítve (Gibco, 26010-074). Az adipocita differenciálódás kiváltása érdekében a 3T3-L1 sejteket 10% magzati szarvasmarha-szérumot (FBS; Hyclone, SH30919.03), 0,55 mM 3-izobutil-1-metilxantint (Sigma Aldrich, I5879) tartalmazó DMEM-mel inkubáltuk 2 nappal az összefolyás után. ΜM dexametazon (Sigma Aldrich, D1756) és 1 μg ml-1 inzulin (Roche, 11 376 497 001) 2 napig. Ezután a táptalajt 10% FBS-t és 1 μg ml-1 inzulint tartalmazó DMEM-re cseréltük, és a sejteket további 2 napig tenyésztettük. A táptalajt 2 naponta cseréltük 10% FBS-t tartalmazó DMEM-mel.

Kis interferáló RNS duplexeket terveztek és vásároltak a Bioneer-tól (DNMT1, 1350629; DNMT3a, 1350650). A pcDNA3-DNMT1 vektort dr. Francois Fuks (Brüsszeli Szabadegyetem, Belgium). Mindegyik kis interferáló RNS-t (20 μM), pcDNA3.1-myc-His és pcDNA3.1-DNMT1-et egy Microporator (Digital Bio Technology Co. Ltd.) segítségével juttattuk el a 3T3-L1 sejtekhez.

Különböző, a környezetet utánzó kóros kísérletekben differenciált 3T3-L1 adipocitákat inkubáltunk 10 ng ml-1 TNFa-val vagy anélkül (R&D Systems, 210-TA), 10 ng ml-1 IL-1β-t (R&D Systems, 201-LB) 1 ug ml-1 tunicamicin (Calbiochem, 654080), 1 μM rotenon (Sigma Aldrich, R8875) vagy normál vagy hipoxiás körülmények között (1% O 2 koncentráció) inkubáljuk 24 órán át. A DNMT1 aktivitás gátlásához a 3T3-L1 adipocitákat 24 órával a TNFα kezelés előtt preinkubáltuk RG108-mal (100 μM).

RNS és qPCR izolálása

Az RNS izolálását és a cDNS szintézisét a korábban leírt módon hajtottuk végre. Röviden, az összes RNS-t izoláltuk egérsejtekből vagy sejtvonalakból TRIzol-reagenssel (Ambion, 15596-018), és cDNS-szintézisnek vetettük alá a qPCR-hez használt Maxima First Strand cPNS-szintézis készlet segítségével (Thermo Scientific, K1642). A megtisztított humán adipocitákból származó RNS-t az RNeasy Lipid Tissue Kit (Qiagen, 74804) alkalmazásával extraháltuk, és nagy kapacitású RNS-cDNS kit alkalmazásával cDNS-szintézisnek vetettük alá (Applied Biosystems, 4387406). A relatív mRNS-szinteket CFX96 Real-Time System (Bio-Rad Laboratories Inc.) alkalmazásával mértük, és a ciklofilin mRNS-szintekre (egérsejtek vagy sejtvonalak) vagy a GAPDH mRNS-szintekre (emberi sejtek) történő normalizálással számítottuk. A valós idejű kvantitatív analízishez használt primer szekvenciákat a 3. kiegészítő táblázat sorolja fel.

Korlátozó enzim hozzáférhetőségi teszt

A restrikciós enzim hozzáférhetőségi vizsgálatot korábban leírták 50. Röviden: az epididymális zsírszövet-adipocitákat és a 3T3-L1 sejteket RSB pufferrel (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1% Nonidet P-40 (NP-40), 5 mM) gyűjtöttük be. butirát, 10 mM NaF és 1 mM NaVO 7, proteáz inhibitorokkal kiegészítve), és 20 percig inkubáljuk jégen. A sejtpelleteket 27 g fecskendővel homogenizáltuk, 2000 fordulat/perc sebességgel 4 ° C-on 5 percig centrifugáltuk, és 100 μl friss RSB pufferben újraszuszpendáltuk. Az újraszuszpendált gDNS-t 100 NE AluI, EcoRI és BamHI-gyel emésztettük (TaKaRa, 1004A, 1040A és 1010A). A reakciókat proteináz K és 2% SDS hozzáadásával állítottuk le 6 órán át 45 ° C-on. A kromoszómális DNS-t ezután fenol-kloroformmal kétszer extraháltuk, izopropanollal kicsaptuk és desztillált vízben szuszpendáltuk. A kicsapódott DNS-t PCR-rel amplifikáltuk. A PCR-termék relatív mennyiségét a CFX96 Real-Time System (Bio-Rad Laboratories Inc.) alkalmazásával mértük. A PCR-hez használt primer szekvenciákat a 2. kiegészítő táblázat tartalmazza.

Chromatin immuncsapódás

Western blot

DNMT enzimatikus aktivitás vizsgálata

A magkivonatok tisztításához a sejteket hipotóniás pufferben (50 mM KCl, 25 mM HEPES (pH 7,8), proteázinhibitor-koktél (GeneDEPOT, P3100)) 0,5% NP-40-gyel gyűjtöttük össze. Az összegyűjtött sejteket jégen 10 percig inkubáltuk, és kétszer NP-40 nélküli hipotonikus pufferrel mostuk. A felülúszó eltávolítása után az üledéket mag-extrakciós pufferrel (500 mM KCl, 10% glicerin, 25 mM HEPES (pH 7,8), proteáz inhibitor koktél) szuszpendáljuk és 5 percig inkubáljuk. A felülúszót centrifugálás után összegyűjtöttük a nukleáris fehérje értékeléséhez. A DNMT enzimatikus vizsgálatot az EpiQuik DNS metiltranszferáz aktivitás/gátlás vizsgálati készlet (Epigentek Group Inc., P-3001) alkalmazásával végeztük nukleáris kivonattal.

Az R2-kötő fehérje tisztítása és jellemzése

Statisztikai analízis

Az összes eredményt átlag ± félként adjuk meg. A statisztikai szignifikanciát a kétfarkú Student t-tesztjével értékeltük GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software) alkalmazásával. Az F-teszt során nem volt különbség az összes összehasonlításban. Amikor sejteket használtunk kísérletekhez, csoportonként három ismétlést választottunk. A leírásban meghatározott n érték biológiai replikátumokra vonatkozik, hacsak másként nem jelezzük. Technikai manipulációt igénylő egérkísérletekben csoportonként legalább öt egeret alkalmaztak. Ha olyan technikai hibák léptek fel, mint az orális szondázás és az intraperitoneális injekció meghibásodása, ezeket a mintákat kizártuk a végső elemzésből. A különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük P esetében