elemeket

Ez a cikk frissült

absztrakt

Háttér:

A mikroRNS-ek (miRNS-ek) a génexpresszió kulcsszabályozói. Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy a megváltozott miRNS expresszió fontos szerepet játszik-e a gyulladásos emlőrák (IBC) fenotípusának meghatározásában.

mód:

Kvantitatív PCR technológiát alkalmaztunk 384 miRNS expressziójának értékelésére 20 IBC-ben és 50 nem IBC mintában. Az aberrált miRNS-expresszióval deregulált biológiai funkciók megértése érdekében direkt miRNS-célokat kerestünk, páros korrelációs együttható-elemzést végezve 10 962 messenger RNS (mRNS) expressziós szintjén, és összehasonlítva ezeket az eredményeket a TargetScan5 által előre jelzett miRNS-célokkal. 1.

az eredmények:

13 miRNS-t azonosítottunk, amelyek esetében az expressziós szintek képesek voltak megjósolni az elemzett minta jellegét (IBC vs nem IBC). Ezekhez a miRNS-ekhez összesen 17 295 korrelált miRNS-mRNS párot találtunk, amelyek közül 7012 és 10 283 pár negatív és pozitív korrelációt mutatott. A négy miRNS (miR-29a, miR-30b, miR-342-3p és miR-520a-5p) esetében a korrelált gének összhangban voltak a tervezett célokkal. Ezen gének géndúsításának elemzése jelentős gazdagodást mutatott a sejtproliferációval és a szignáltranszdukcióval kapcsolatos biológiai folyamatokban.

következtetés:

Legjobb tudásunk szerint ez a tanulmány a miRNS-ek és az IBR-ek mRNS-expressziójának első integrált elemzését jelenti. Meghatároztunk egy 13 miRNS-t, amelyek expressziója különbözött az IBC-k és a nem IBC-k között, így ezek a miRNS-ek jelöltek voltak az IBC altípusra.

A fő

A mikroRNS-ek (miRNS-ek) a nem kódoló RNS-ek olyan osztálya, amelyek képesek szabályozni a génexpressziót a poszt-transzkripciós szinten azáltal, hogy részleges szekvencia-homológiával kötődnek a cél-mediátor RNS (mRNS) 3'-nem-transzlált régiójához, és transzlációs blokádot okoznak. és/vagy mRNS lebontása (He és Hannon, 2004). Az írás idején 721 emberi miRNS-gént írtak le (//microrna.sanger.ac.uk/sequences), és becslések szerint mindegyik miRNS körülbelül 100 különböző mRNS-molekulát céloz meg (Brennecke és mtsai, 2005; Lewis és mtsai. al., 2005, Lim és mtsai, 2005). A MiRNA-k fontos szerepet játszanak az olyan alapvető folyamatokban, mint a differenciálódás, a sejtnövekedés, a stresszválasz és a sejthalál (Miska, 2005; Zamore és Haley, 2005). Ennek eredményeként a megváltozott miRNS expresszió valószínűleg hozzájárul az emberi betegségekhez, beleértve a rákot is. Valójában a szilárd rákban expresszált miRNS-ek spektruma nagyon eltér a normál sejtekétől, és a differenciálisan expresszált miRNS-ek előre jelzett célpontjai jelentősen gazdagodnak a fehérjeszuppresszorok és a fehérjét kódoló onkogének szempontjából (Lu és mtsai, 2005; Volinia és mtsai, 2005). 2006).

Az emlőrákra összpontosítanak, a specifikus miRNS-szintek rosszindulatú és normál emlőszövetek között változnak, és képesek a tumorokat olyan klinikopatológiai változók szerint osztályozni, mint a proliferációs index, a szteroid hormon receptorok, valamint a Her2/neu státus, a csomó státusa és a tumor stádiuma (Iorio et al., 2005; Mattie et al., 2006; Lowery et al., 2008). Ezenkívül a miRNS-ek differenciáltan expresszálódnak a molekuláris emlőrák altípusok között, ideértve az A luminalist, a B luminalist, az alapot és a Her2 + -ot (Blenkiron et al, 2007). Ez rámutat a miRNS-aláírások mint új prognosztikai mutatók lehetőségére, amelyek hozzájárulhatnak a betegek adjuváns terápiában való jobb kiválasztásához. Foekens és mtsai. (2008) nemrég négy miRNS-t (miR-7, miR-128a, miR-210 és miR-516-3p) kapcsolt össze rövidebb idővel az ösztrogén receptor (ER) távoli áttétjeivel a nyirokcsomókban. negatív emlőrák.

Anyagok és metódusok

Betegminták

Daganatmintákat a Sint-Augustinus Általános Kórház (Antwerpen, Belgium) szövetbankjából nyertünk. A klinikai és kóros adatokat adatbázisban tárolják a kórház adatvédelmi irányelveinek megfelelően. A mintákat a reszekció után azonnal átadtuk a patológusokhoz, és a szövet egy részét folyékony nitrogénbe helyeztük, majd -180 ° C-on tároltuk. Ebbe a vizsgálatba 20 IBC és 50 nem IBC beteget vontunk be. A gyulladásos emlőrákot az AJCC (American Joint Committee on Cancer) -TMM stádiumrendszer kritériumai szerint diagnosztizálták (Singletary et al, 2002). Minden IBC-ben szenvedő beteg diffúz megnagyobbodását mutatta az érintett hirtelen megjelenő mell. Eritémáról és bőrödémáról számoltak be, amelyek a mell több mint egyharmadát érintik. A dermális nyirokinvázió jelenléte izolált megfigyelésként nem volt elegendő az IBC diagnosztizálásához, és a diagnózishoz nem volt szükséges. A nem IBC-k kontrollcsoportját hasonlítottuk össze a tumor szövettanával, az ER expresszióval és a humán epidermális növekedési faktor 2 (HER2) amplifikációval, de nem a tumor stádiumával, hogy azonosítsuk az igazi IBC determinánsokat. A daganat jellemzőit az 1. táblázat mutatja.

Asztal teljes méretben

Teljes RNS izolálás, komplementer DNS szintézis és miRNS mennyiségi meghatározás

Statisztika és bioinformatika

A technikai variáció csökkentése érdekében az összes miRNS-t, amelynek C kimutatási határa (küszöbciklus) kevesebb, mint 35 PCR-ciklus a minták legalább 25% -ában, leszűrtük, így 322 informatív miRNS-t tartalmazó listát kaptunk. Ezután a minták között normalizálást végeztünk az egyes minták miRNS expressziós szintjeinek eloszlásának medián központosításával (Mestdagh et al, 2009). A relatív miRNS expressziós szintet Att módszerrel számoltuk (Livak és Schmittgen, 2001).

A miRNS expressziós mintázatainak azonosításához hierarchikus, teljes, felügyelet nélküli klaszteranalízist végeztünk, amely az euklideszi távolságot illesztett metrikának használta. A robusztus mintaklaszterek számát a sziluett algoritmus határozta meg. Tovább vizsgáltuk a minta klaszterezés eredményeinek a klinikopatológiai változókkal való összefüggését Pearson-teszt és Goeman globális tesztje segítségével (Goeman és mtsai, 2004).

Az IBC-khez társuló egyedi miRNS-ek azonosításához először nem-parametrikus vizsgálatot alkalmazva választottunk ki minden olyan miRNS-t, amely szignifikánsan túlexpresszálódott vagy nem expresszálódott az IBC-kben a nem IBC-khez képest. Ezután ezeket a miRNS-eket többváltozós regresszióanalízisnek vetették alá N-állapot, M-állapot, tumor stádium és HER2 amplifikációval kovariátorként. Ily módon a miRNS-eket azonosíthatjuk, amelyek kifejezetten az IBC-khez kapcsolódnak, nem pedig az IBC-k és a nem IBC-k közötti klinikopatológiai változók közötti különbségek helyett, amelyekről ismert, hogy az emlőrákban is befolyásolják a miRNS expresszióját.

Az azonosított miRNS-ek biológiai relevanciájának vizsgálatához elfogadtuk a stratégiát, amelyet Wang és mtsai (2009) nemrégiben írtak le. Először is, mindegyik miRNS-hez, amely függetlenül társult az IBC-khez, Spearman-korrelációs analízissel azonosítottunk egy feltételezett célgén készletet, figyelembe véve a pozitív és a negatív korrelációkat is. Ezt az elemzést 44 minta (20 IBC és 24 nem IBC minta) részhalmazán végeztük, amelyekhez rendelkezésre állt az Affymetrix HGU133 plusz 2.0 génexpressziós profil (Van Laere és mtsai, 2007). A valódi miRNS-célok azonosításához összehasonlítottuk a feltételezett miRNS-célok listáját a miRNS-célok listáival, amelyeket a TargetScan5.1 (//www.targetscan.org) határoz meg, a hiperggeometrikus gének génkészletének gazdagodásának elemzésével. Ezeket a miRNS-eket, amelyek esetében a TargetScan5.1 definiált miRNS-célpontok szignifikánsan gazdagodtak a korrelációval meghatározott miRNS-célok érdekében, további elemzésnek vetettük alá. Ezenkívül az összes többi elemzést csak a miRNS két célcsoport közötti közös géneken végezték. Ezeket a géneket a Gene Ontology (GO) és a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) dúsított kategóriáihoz elemeztük a hiperggeometrikus gének génkészletének gazdagodásának elemzésével.

Annak ellenőrzésére, hogy az azonosított miRNS-ek prognosztikailag relevánsak-e, az Országos Biotechnológiai Központ weboldaláról hat génexpressziós adatsort töltöttünk le (GSE7390, GSE9195, GSE1456, GSE11121, GSE2034 és GSE4922; //www.ncbi.nlm.nih), amelyek nyilvánosan elérhetőek. kormány). Ezenkívül a van de Vijver et al. (2002) a Rosetta weboldaláról (http://www.rii.com) szereztük be. Összesen 1504 emlőrákminta mRNS expressziós adatait elemeztük. Minden egyes mintához kiszámítottuk a kiválasztott miRNS expressziós szintjével arányos pontszámokat, levonva a negatívan korrelált miRNS célok átlagát a pozitívan korrelált miRNS célok átlagából. Ezeket az eredményeket standardizáltuk (medián = 0 és sd = 1), hogy lehetővé tegyük a különböző adatsorok összehasonlítását, és a Cox arányos veszélyek modelljével elemezzük mind egy-, mind többváltozós beállításokban. A kapott változó a távoli metasztázis túlélés (DMFS, N = 1059), a teljes túlélés (OS, N = 652) vagy a relapszusmentes túlélés (RFS, N = 1145), ha lehetséges.

Végül egy 44 minta részhalmazán belül, amelyekhez az Affymetrix HGU133 plusz 2.0 génexpressziós profilok rendelkezésre álltak, összehasonlítottuk a miRNS-feldolgozó gének expresszióját IBC-k és nem IBC-k között. Tovább elemeztük a TargetScan5.1 adatbázisból származó összes miRNS feltételezett szabályozó hatását e 44 minta gén expressziós profiljára. Elfogadtuk Cheng és mtsai által nemrégiben közzétett megközelítést. (2009) a szabályozási hatás pontszámának (RE) kiszámításához a miRNS célpontok átlagos helyzetének kivonásával a nem miRNS célpontok átlagértékéből, a magas RE értékek erős hatást jeleznek. miRNS a cél expressziójához és fordítva. Mivel azonban ez a pontszám csak a negatívan szabályozott miRNS-célokat veszi figyelembe, úgy módosítottuk a RE-pontszámot, hogy mind a gátló, mind az aktiváló hatásokat figyelembe vettük. Ezeket a RE-pontszámokat ezután összehasonlítottuk az IBC-k és a nem IBC-k között egy nem parametrikus teszt alkalmazásával.

Az összes adatelemzést egy Bioconductor in R alkalmazásával végeztük (//www.bioconductor.org). Többszörös korrekciót végeztek Benjamin és Hochberg eljárással a hamis pozitív eredmények gyakoriságának növelése érdekében, és a korrigált P 2 értékek azt mutatták, hogy a minta csoportosulása összefüggésben volt az ER expresszióval (P = 0,011), a tumor szövettani fokozatával (P = 0,004), állapota N (P = 0,014) és tumor stádium (P = 0,010). Nem figyeltek meg összefüggést a minta klaszterezésével a T és M státus, a HER2 amplifikáció vagy a tumor altípus (IBC vagy nem IBC) tekintetében.

gyulladásos

20 IBC és 50 nem IBC minta hierarchikus csoportosítása 50 különböző miRNS expressziós mintája szerint. Ezen 50 miRNS expressziós értékei mátrix formátumban vannak ábrázolva, a sorok jelzik a miRNS-eket, a sávok pedig a mintákat. A magas expressziós értékeket piros színnel, az alacsony kifejezési értékeket kékkel színezik. Három robusztus mintacsoportot azonosítottak, amelyek szignifikánsan összefüggésben voltak az ER expresszióval és a szövettani fokozattal. Különösen a kombinált első két (kék és sárga) mintacsoportot dúsítottuk ER + melldaganatok esetén (a minták 80% -a) a harmadik (piros) mintacsoporthoz (a minták 50% -a) képest (P χ 2 = 0, 028), különösen az első A (kék) mintavételi klaszterben a minták 20% -a rosszul volt differenciálva, szemben a második (sárga) mintavételi fürt mintáinak 60% -ával (P 2 = 0,004), ami a ER + melldaganatok luminal A és luminal B altípusokba. Nem figyelték meg a mintaklaszterek összefüggését az IBC-k és a nem IBC-k közötti különbséggel: az IBC-minták 30, 25 és 45% -a csoportosítva az első (kék), a második (sárga) és a harmadik (piros) mintacsoportba (P = 2 = 0,082). (A kép színes reprodukciója a kézirat teljes html változatában érhető el.)

Teljes méretű kép

Goeman globális vizsgálatát végeztük a miRNS expresszió és a különféle klinikopatológiai tényezők összefüggéseinek meghatározására (2. táblázat) egy 50 különböző miRNS-ből álló redukált adathalmaz esetében. Jelentős összefüggéseket figyeltünk meg a tumor ER expressziója és szövettani fokozata tekintetében, de nem a T, N vagy M státus, a tumor stádium, a HER2 amplifikáció vagy a tumor altípus (IBC vagy nem IBC) vonatkozásában. Így az emlőrákos mintacsomagunkban a miRNS expressziójának legnagyobb különbsége a szteroid hormon receptor expressziójának és a tumor szövettanának különbségeinek volt köszönhető, és nem az IBC-k és a nem IBC-k közötti különbségeknek. Valójában a miRNS expressziós értékeinek eloszlása ​​IBC-kben és nem IBC-kben nagyon hasonlónak tűnik (2. ábra).

Asztal teljes méretben

A miRNS expressziós értékeinek megoszlása ​​( A ) emlő gyulladásos daganatai és ( B ) nem gyulladásos emlődaganatok.

Teljes méretű kép

Az egyes miRNS-ek társulása gyulladásos emlőrákkal

Logisztikai regresszióanalízist végeztünk az IBC-k és a nem IBC-minták közötti miRNS expressziós szintek közötti különbségek azonosítására (3. táblázat). Megfigyelték, hogy kevés miRNS kapcsolódik függetlenül az IBC-k és a nem IBC-k közötti különbséghez. A miR-335, miR-337-5p, miR-451, miR-486-3p, miR-520a-5p és miR-548d-5p fokozott expresszióját figyelték meg az IBC altípusban, míg miR-15a, miR-24, A miR -29a, miR-30b, miR-320, miR-342-5p és miR-432-3p jelentősen csökkent volt a nem IBC-khez képest.

Asztal teljes méretben

Hasonló elemzést végeztek a minták miRNS-expressziójának különbségeinek azonosítására a T állapot (alacsony vs magas), N állapot (pozitív vs negatív), M állapot, tumor stádium (alacsony vs magas), tumor fokozat (magas vs alacsony), ER szerint. expresszió és HER2 amplifikáció. A miRNS-ek társulása ezekkel a klinikopatológiai faktorokkal szintén a 3. táblázatban található.

A miRNS célpontok előrejelzése és részvételük a biológiai folyamatokban

Wang és mtsai (2009) által nemrégiben leírt stratégia elfogadásával tovább vizsgáltuk a miRNS célgének részvételét különféle biológiai folyamatokban, amelyek utalhatnak a miRNS működésére. Először korrelációs együttható elemzést végeztünk a 13 IBC-hez kapcsolódó miRNS expressziós szintje közötti potenciális korreláció értékelésére (miR-335, miR-337-5p, miR-451, miR-486-3p, miR-520a-5p, miR -548d -5p, miR-15a, miR-24, miR-29a, miR-30b, miR-320, miR-342-5p és miR-342-3p) és 10 961 ismert gén mRNS expressziós szintje 44 rák csökkentett csoportjában minta mell, ebből 20 volt IBC és 24 nem IBC. A hamis felfedezés mértéke

A miR-520a-5p célgén expressziójának túlélésének Kaplan-Meier elemzése távoli metasztatikus emlőrákban ( A a C ) és az általános túlélés ( B a D ) eredményeképpen. Kaplan-Meier görbéket adunk van de Vijver és mtsai (2002) ( A a B ) és Desmedta és mtsai (2007) ( C a D ).

Teljes méretű kép

Asztal teljes méretben

A miRNS-feldolgozó gének kifejeződése mellrákban

Mivel az IBC-t az emlőrák agresszivitásának modelljének tekintik, arra voltunk kíváncsiak, hogy meghatározzuk, hogy az IBC-specifikus miRNS-ek összefüggenek-e semleges prognózissal IBC nélküli betegeknél. Klinikai mintáink korlátozott száma miatt indirekt megközelítést alkalmaztunk, és összefüggésbe hoztuk a megcélzott miRNS gén expresszióját a beteg eredményeivel, felhasználva a génexpressziós adatbázisból kinyerhető, mikroarray vizsgálatokból származó, nyilvánosan elérhető információkat. Ez az elemzés kimutatta, hogy a miR-520a-5p célgén expresszió szoros összefüggésben van a rövidebb DMFS, RFS vagy OS-vel a vizsgált emlőrák-adatállomány többségében. Ez az eredmény bemutatja a miR-520a-5p lehetséges szerepét prognosztikai tényezőként az emlőrákban. Miközben elismerik a közvetett megközelítés korlátozásait, az ilyen típusú vizsgálatok segíthetnek a jövőbeni nagyszabású vizsgálatokban a miRNS-ek prognosztikai értékének emlőrákos megbetegedéseiben.

Összefoglalva, ez a tanulmány a legjobb tudásunk szerint a miRNS és az mRNS expressziójának első integrált elemzését mutatja az IBC-kben. Meghatároztuk az IBC-k és a nem IBC-k között differenciáltan expresszálódó miRNS-ek számát. Továbbá beszámoltunk a miRNS-feldolgozó gének megváltozott expressziójáról IBC-ben a nem IBC-khez képest. Az IBC-hez kapcsolódó miRNS-ek közül négy esetében különféle biológiai folyamatokat tudtunk kimutatni, amelyek célgénjeik expressziós szintje alapján jelezhetik ezeknek a miRNS-eknek a működését, és jelezhetik azok lehetséges kapcsolatát az emlőrák prognózisával.