- elemeket
- absztrakt
- bevezetés
- az eredmény
- Az EcSOD expresszió hiányzik a 2D-tenyésztett HMEC-ben
- Kifejezés Az EcSOD gént 3D-ben tenyésztett HMEC-ben aktiváljuk
- A 3D-ben tenyésztett HMEC alacsonyabb DCFH-oxidációs szintet mutat az egyrétegű tenyészet sejtjeihez képest
- Csend A 2D-ben tenyésztett HMEC-ben található EcSOD gén a promoter DNS hipermetilezésével társul
- Az ecSOD expresszió jelentősen csökken a klinikai emlőrák szövetekben, és mRNS expressziós szintje fordítottan korrelál a klinikai stádiummal
- Az EcSOD re-expressziója gátolta az emlőrák sejtjeinek csillagképző kolóniáinak képződését a 3D kultúrában
- Az EcSOD túlexpresszió elnyomta az MDA-MB231 sejtek kísérleti tüdőmetasztázisait és meghosszabbította az állatok túlélését
- Az EcSOD csökkentette az egér emlő adenokarcinóma sejtjeinek spontán metasztázisának sebességét egy szingenikus egér modellben
- vita
- További információ
- Képfájlok
- További 1. ábra
elemeket
- Mellrák
- DNS-metilezés
- áttét
- oxidoreduktáz
absztrakt
Az emberi rákos megbetegedésekben gyakran károsodik a reaktív oxigénfajtákat (ROS) metabolizáló sejtes antioxidáns enzimek expressziója. 1, 2, 3, 4 Ilyen antioxidáns enzimek közé tartozik a SOD (szuperoxid-diszmutázok), amelyek eltávolítják a szuperoxidot (O 2 -) és a katalázokat, valamint a glutation-peroxidázok, amelyek semlegesítik a hidrogén-peroxidot (H 2 O 2). A ROS sérült eltávolítása prooxidatív környezethez vezet, amely kedvez a rákos sejtek fokozott szaporodásának, túlélésének és onkogén progressziójának. 1, 5 Nemrégiben kimutattuk, hogy az extracelluláris szuperoxid-diszmutáz (EcSOD) expresszióját a normál tüdőrákokhoz képest a tüdőrákok mintegy 80% -ában jelentősen elnyomja az aberrált DNS-metiláció. A DNS-metiláció az egyik epigenetikus mechanizmus, amely a tumorszuppresszor gének aberrált gén-expressziójához kapcsolódik. 7 Mivel az EcSOD az egyetlen oxigénmegkötő a tüdőben, az EcSOD expresszió ezen inaktiválása következtében a tumor mikrokörnyezetében bekövetkező oxidatív stressz növekedése várhatóan hozzájárul a tüdőrák kóros és rosszindulatú előrehaladásához.
Összehasonlítva más, mindenütt expresszált emlős SOD-kkal, az EcSOD gén expresszióját szigorúan szabályozza sejttípus és szövet-specifikus módszer. 8 Az EcSOD sejtfelszínének és extracelluláris lokalizációjának, valamint a CuZnSOD és MnSOD citoszolikus és mitokondriális eloszlásának következtében az EcSOD expresszió sajátos mintája hangsúlyozza ezen SOD különböző biológiai szerepét a szövetekben. Korábbi emlőrákos vizsgálatunkban az EcSOD túlzott expressziója az EcSOD-zero mellrákos sejtvonalakban in vitro gyengített rosszindulatú fenotípusokhoz vezetett, beleértve a növekedési sebesség csökkenését, a klonogén túlélést és az inváziót9, ami arra utal, hogy az emlőrákban az EcSOD szuppresszív funkciója van. Ahhoz, hogy jobban megértsük az EcSOD szerepét a normális emlő emlő hámsejtjeinek redox homeosztázisának fenntartásában és az oxidatív közvetített emlő tumorigenesis megelőzésében, értékelni kell ezen antioxidáns enzim expressziós szintjét a normális emlő hámsejtekben, szemben a rosszindulatú sejtekkel. emlő hámsejtek 6 felvetették azt az alapvető kérdést, hogy az EcSOD expresszálódik-e normális emlő hámsejtekben.
Ennek a problémának az ecSOD expressziójának további kezelésére normál emlő hámsejtekben immunhisztokémiai festést (IHC) hajtottunk végre, és most megerősítettük az EcSOD expresszióját az emlő hámsejtjeiben normális emberi mellszövetben, ellentétben a korábbi, in vitro vizsgálatunkkal tenyésztett sejtekkel. Ez az eltérés arra utal, hogy az EcSOD expresszió megszakadhat, ha a sejteket egyrétegűként tenyésztik egy hagyományos kétdimenziós (2D) tenyésztési rendszerben. A háromdimenziós (3D) tenyésztési rendszer használata nemrégiben lendületet kapott az emlőrákos vizsgálatokban, mivel fiziológiailag releváns szöveti tenyésztési feltételt biztosít az emlő hámjának számos szövettani jellemzőjének in vivo összefoglalásához. Ezek közé tartozik az üreges lumen acinszerű szferoidok képződése, a sejtek apikális polarizációja és az alapmembrán komponensek bazális lerakódása, valamint a kifejezetten az emlő működéséhez kapcsolódó gének expressziójának képalkotása. 10, 11
Ennek a tanulmánynak a célja tehát az volt, hogy fiziológiailag releváns 3D-s tenyésztőrendszer segítségével meghatározza az EcSOD expresszióját a nem rosszindulatú emlőmell hámsejtekben, és meghatározza az EcSOD gén expressziójának különbségeit az egyrétegű tenyésztésben az acináris tenyészetben, mint klinikailag megszerzett emberi emlőrákban . Megállapítottuk, hogy a szövetszervezés elengedhetetlen az EcSOD gén expressziójához a nem rosszindulatú emlő emlő hámsejtjeiben, és hogy az EcSOD gén expressziójának 3D tenyésztett sejtekben történő újraaktiválása összefüggésben volt az epigenetikus újraprogramozással. Ezenkívül a vizsgált emlődaganatok> 80% -a szignifikánsan csökkent EcSOD expressziós szintet mutatott a normális emlőszövetekhez képest. Megmutattuk továbbá, hogy ezekben a melldaganatokban az EcSOD csökkent expressziója összefüggésbe hozható a DNS hipermetilációjával az EcSOD promoter szabályozó régiójában. In vivo metasztatikus modelljeinkben az emberi EcSOD-ot, AdEcSOD-t túlzott mértékben expresszáló adenovirális vektorral kezelt állatok szignifikáns csökkenést mutattak a kísérleti tüdőmetasztázisokban és a spontán metasztázisokban az üres vektorral kezelt egerekhez képest.
Tudomásunk szerint ez az első olyan tanulmány, amely megmutatja az EcSOD gén expressziójának "plaszticitását" nem rosszindulatú emberi emlő hámsejtekben (HMEC), véges életképességgel 3D tenyésztési körülmények között, szemben a 2D sejtekkel. Az EcSOD géncsendesítés és az emlőszövet-szervezés in vivo elvesztésének összefüggése fontos szerepet játszik az EcSOD-ban, mint emlőrák szupresszor. Ezért a betegség új terápiás beavatkozásainak meghatározása során fontos lesz meghatározni az EcSOD fontosságát és mechanikai szerepét az emlőrák progressziójának elnyomásában.
az eredmény
Az EcSOD expresszió hiányzik a 2D-tenyésztett HMEC-ben
Az EcSOD szerepének meghatározásához az emlőrák kialakulásában megvizsgáltuk az EcSOD expressziós szinteket tenyésztett, nem rosszindulatú emlő hámsejtekben. Amint az 1a. Ábra mutatja, az EcSOD mRNS expresszió sem HMEC, sem MCF-10A sejtekben nem volt kimutatható az emberi tüdő MRC5 fibroblasztjaihoz és az emberi légúti hámsejtek primer tenyészeteihez képest. Az IHC festés azonban az EcSOD végleges pozitív festését mutatta ki a normál emlőszövetekben, konkrétan a mell emlőmirigy hámjában (1b. Ábra). Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy bár a normál emlő hámsejtek erőteljes EcSOD expressziót mutattak in vivo, a sejtek in vitro tenyésztése az EcSOD gén expressziójának elvesztését eredményezte.
Az EcSOD expresszió normál emlőszövetben kimutatható, de egyrétegű tenyészetekben nem rosszindulatú tejhámsejtekben. a ) A teljes RNS-t kivontuk és elemeztük a redukáló mammoplasztokból származó poszt-stasis HMEC-ből származó EcSOD mRNS transzkripcióját és az MCF-10A spontán transzformált, nem rosszindulatú emlő hámsejtvonalából. A normál humán tüdő fibroblasztokhoz (MRC5) és a normális humán légúti epithel sejtekhez képest a HMEC és MCF-10A sejtek kimutathatatlan EcSOD mRNS expressziót mutattak, valós idejű RT-PCR analízissel meghatározva. 18S-t használtunk terhelés-kontrollként. Hibasávok jelentik itt, n = három külön kísérlet. b ) Az IHC elemzés az EcSOD pozitív festését mutatja a normál emlőszövetben (jobb oldali panel). A bal oldali panel H és E festését mutatja ugyanazon normál emlőszövetben.
Teljes méretű kép
Az EcSOD génexpressziót 3D-ben tenyésztett HMEC-ben aktiváljuk
Teljes méretű kép
A 3D-ben tenyésztett HMEC alacsonyabb DCFH-oxidációs szintet mutat az egyrétegű tenyészet sejtjeihez képest
Annak eldöntésére, hogy az oxidatív stressz szintje változik-e, ha a HMEC-ket 2D körülmények között tenyésztjük a 3D kultúrához képest, a sejteket egy oxidációra érzékeny fluoreszcens szondával (DCFH) jelöltük. Megnövekedett DCFH-oxidációt figyeltek meg a 2D-vel tenyésztett HMEC-ben a 3D-vel tenyésztett sejtekhez képest, amint azt a 3a. Ábrán bemutatott áramlási citometriás elemzés mutatja (210D átlagos fluoreszcenciaintenzitás 2D HMEC-ben, szemben 189-vel 3D HMEC-ben). Ennek a szondának az oxidáció-érzéketlen változata, amely szabályozza a festékfelvételt, az észteráz hasítását és a kiáramlást, nem mutatott különbséget a jel intenzitásában, jelezve, hogy a 2D és 3D kultúrák között megfigyelt jelkülönbségek kifejezetten a szonda oxidációjának voltak köszönhetők (az adatokat nem mutatjuk be). Ez arra utal, hogy a nem rosszindulatú emlő hámsejtjeinek elszaporodása egyrétegű tenyészetként megnövekedett oxidatív stresszhez vezetett, ami részben az EcSOD expresszió elvesztésének tudható be.
Teljes méretű kép
Az EcSOD gén elnémítása 2D-vel tenyésztett HMEC-ben a promoter DNS hipermetilezésével jár
Az ecSOD expresszió jelentősen csökken a klinikai emlőrák szövetekben, és mRNS expressziós szintje fordítottan korrelál a klinikai stádiummal
Arra is törekedtünk, hogy meghatározzuk az EcSOD expressziós szinteket a klinikai emlőrák mintáiban. Amint azt az EcSOD IHC festés reprezentatív képein a 4a. Ábra mutatja, az EcSOD fehérje erős és határozott expresszióját detektáltuk a jóindulatú lebeny emlősejtjeinek sejtjeiben. Ezzel szemben az EcSOD immunreaktivitása jelentősen csökken az in situ nagymértékben duktális carcinomában és az invazív emlőrákban. Az EcSOD esetében az IHC festés intenzitását a normál versus neoplasztikus emlőszövetekben részben kvantifikáltuk, és az 1. táblázatban bemutattuk. Annak további vizsgálatához, hogy a károsodott EcSOD expresszió gyakori esemény-e az emlőrákban, TissueScan mellrák cDNS mezőt hajtottunk végre (Origene, Inc., Rockville, MD, USA). Amint a 4b. Ábra mutatja, az I. stádiumú EcSOD mRNS expresszió szintje és a II. - IV.
Az EcSOD túlzott expressziója gátolta az MDA-MB231 sejtek csillagképes telepeinek képződését a 3D kultúrában. A kétdimenziós tenyésztett MDA-MB231-et AdEmpty-vel, AdEcSOD-tal vagy AdAHBD-vel fertőztük 24 órán át moi = 50 PFU/sejt koncentrációban, majd a sejteket újra vetettük 3D kultúrába. 5 napos 3D-tenyésztés után az MDA-MB231 sejtek nagyméretű kolóniákat képeztek kiterjedt csillagképes szerkezetekkel, ami az "invazív" emlőrák háromdimenziós fenotípusának fémjelzi. Bár az AdEmpty nem befolyásolta ennek a sejtvonalnak a 3D-s morfológiáját, az EcSOD túlexpressziója, mind a teljes hosszúságú, mind a csonka formában (AdEcSOD és AdAHBD adenovírus fertőzéssel, moi = 50 PFU/sejt), sokkal kisebb telepeket eredményezett, így nem alakult ki hasonló 3D morfológiai változást figyeltünk meg, amikor MDA-MB231 sejteket állítottunk elő az EcSOD stabil expresszálására Ec.20 (teljes hosszúság) és AHBD.3 (deléció a HBD-ben) értékeken, ahol a sejtek csillag megnyúlás hiányában kis telepeket képeztek. = 3. Oszlop skála = 100 μm.
Teljes méretű kép
Az EcSOD túlexpresszió elnyomta az MDA-MB231 sejtek kísérleti tüdőmetasztázisait és meghosszabbította az állatok túlélését
A tüdőáttétek elnyomása az MDA-MB231.luc sejtek által az EcSOD segítségével. Tüdőmetasztázisok kiváltására athxiás meztelen egerekben 2x106 MDA-MB231.luc sejtet injektáltunk az oldalsó farokvénába. Az EcSOD túlexpressziót AdEcSOD vagy AdAHBD (1 x 1010 PFU) alkalmazásával érjük el intramuszkulárisan 3 nappal az emlőrák sejtjeinek injekciózása előtt. Az AdEmptyt használtuk vektor kontrollként. ( a, Felső panel) Az egerek reprezentatív biolumineszcens képei, amelyeket közvetlenül az MDA-MB231.luc sejtek injekciója után készítettek. ( a, Alsó panel) Az egereket háton és ventrálisan hetente képalkotással figyeltük meg az emlőrákos sejtek metasztázisának megfigyelésére. Az EcSOD-val kezelt csoportok a tüdőáttétek fejlődésének csökkenését mutatták az AdEmpty-fertőzött csoporthoz képest. Itt vannak képek az idő lefutásáról ugyanazon állattól minden csoportban. ( b ) A metasztatikus MDA-MB231.luc sejtek lumineszcens jelét (fotonfluxusát) idővel ábrázoltuk, amely az AdEcSOD és az AdAHHD által az AdEmpty (P
Az emlőrák sejtvonal spontán metasztázisainak gátlása az EcSOD segítségével. a ) Reprezentatív biolumineszcencia képek, amelyek a 4T1.luc egér emlő karcinóma sejtek progresszióját mutatják be BALB/c egerekben a tumor beültetését követő 10. napon (1), a tumor eltávolítását követő 7 napon (2), valamint a tüdő és a nyirokcsomó áttétjét a tumor után 4 héttel. eltávolítás (3).). b ) A 4T1.luc sejtek metasztázisának előfordulását a másodlagos helyekig (tüdő és nyirokcsomók) értékelték és mutatták ki az áttétek százalékában. ( c ) Az AdEmpty, AdEcSOD és AdAHBD módszerrel transzdukált Kaplan-Meier állatok túlélési arányát Prism statisztika segítségével ábrázoltuk, a primer 4T1.luc daganatok műtéti eltávolítása után eltelt napokkal. Az AdEcSOD és az AdAHBD túlélési görbéje jelentősen különbözött egymástól (P 15, aki később azt javasolta, hogy a szekretált SOD fontos szerepet játszhat a tejfehérje stabilitásának fenntartásában az oxidatív fehérje károsodásának megakadályozása révén. 16 Itt meggyőzően bemutattuk az EcSOD expresszióját normál emberi emlőmirigyben és az a luminalis a hámsejtek valószínűleg az enzim kiválasztódásának forrása a tejben.
Megmutattuk továbbá, hogy a HMEC elveszíti az EcSOD expresszióját, ha egyrétegűként tenyésztjük, és ezt a változást egy olyan epigenetikai mechanizmus szabályozza, ahol az EcSOD promoter DNS régió metilációja 2D tenyésztett HMEC-ben történik (3d. Ábra). A CpG-szigetek hipermetilezését a gén promoter régiójában a tumor szabályozó génjeinek, sok esetben a tumor szuppresszor gének transzkripciós elhallgatásának fontos epigenetikai mechanizmusaként ismerik el a rák kialakulása során. Az a tény, hogy az EcSOD gén expresszióját szigorúan kontrollálják egy 8-as típusú sejtspecifikus módon, és promótere CpG-szerkezetet mutat, mint egy másik, aberráns citozin-18-metilációval elnémított gén, az epigenetikus szabályozás lehetséges összefüggését javasolja a DNS-metiláció révén az EcSOD-val gén. expresszió a tej hámsejtjeiben. A DNS-metilációval történő EcSOD géncsillapítás reverzibilis folyamat, például az lrECM HMEC által közvetített akr morfogenézis indukálta az EcSOD gén expressziójának reaktiválását 3D-ben tenyésztett HMEC-ben.
Fontos megjegyezni, hogy az ebben a tanulmányban használt HMEC modellt olyan kereskedelmi forrásból nyertük, amely stasis vagy stressz okozta öregedésen ment keresztül. 19 Bár ezeknek a HMEC poszt-stádiumoknak az élettartama még korlátozott és nem rosszindulatúak, kimutatták, hogy szelekciós folyamatuk során több száz transzkripciós és epigenetikai változást értek el. 20, 21 Ez arra utal, hogy a 2D tenyésztett HMEC-ben megfigyelt EcSOD expresszióvesztés a sejtek progressziója során elindulhatott ezen a sztázisos kihíváson keresztül, és hogy az előstádiumú sejtek továbbra is megtarthatják az EcSOD expressziót.
Azt a megfigyelést, miszerint a tejszövet elvesztése (mint a HMEC egyrétegű tenyészetben) elősegítette az EcSOD epigenetikus elhallgattatását, szintén erősen alátámasztja, és ezt szorosan tükrözi klinikai adataink is, a legtöbb emlődaganatban szignifikánsan csökkent az EcSOD expresszió szintje a normális emlőszövethez képest. A COBRA-analízissel elemzett régió (4c. Ábra) megfelel az SP1/SP3 transzkripciós faktorok szabályozási helyének, amelyekről kimutatták, hogy az EcSOD expressziót hajtják végre, és amelyeket a közelmúltban tüdőrákos vizsgálataink során hipermetiláltak. A CpG-helyek metilezése ebben a régióban megzavarja ezen transzkripciós faktorok megkötését, és zártabb kromatinszerkezetet hoz létre, ami az EcSOD expresszió represszív állapotához vezet.
Összességében ez a tanulmány egyértelműen bizonyítja az EcSOD expressziót normális emlő emlő hámsejtekben in vivo és 3D tenyésztett HMEC-ekben. Ha azonban a lobuláris architektúra megszakad, például melldaganatokban és a HMEC-sel tenyésztett egyrétegűekben, akkor az EcSOD gént aberráns citozin-metilációval elnémítják. Ezek az izgalmas megfigyelések azt is sugallják, hogy a megnövekedett ROS-felvételi aktivitás, például SOD-utánzó szerekkel, terápiás stratégiaként vizsgálható az áttétes emlőrák kezelésére. Az EcSOD géncsendesítés oksági szerepének további megerősítése az emlőrák progressziójának és az áttétek elősegítésében ezért kritikus fontosságú lesz az EcSOD expresszió elvesztésének, mint a korai diagnózis és az új kezelések prediktív biomarkereinek azonosításában.