elemeket
absztrakt
Az izolált mitokondriális IV komplex (citokróm c-oxidáz) fontos oka a mitokondriális betegségnek gyermekeknél és felnőtteknél. Genetikailag heterogén, mivel az mtDNS és a nukleáris kódolású géntermékek egyaránt hozzájárulnak a szerkezeti összetevőkhöz és az összeállítási tényezőkhöz. Az ezen fehérjéken belüli patogén változatok klinikai variabilitással társulnak, az izolált szervek bevonásától a multisystemusos betegségek megjelenéséig. Több mint 10 komplex IV komplex tényező defektusait írták le, köztük a libanoni alapító legutóbbi mutációját a PET100-ban Leigh-szindrómás betegeknél. Bemutatunk egy olyan beteg klinikai és molekuláris vizsgálatát, akinek halálos, újszülöttkori kezdete van egy izolált komplex IV-hiányban, amely többszervi érintettséggel jár, és aki rokonságban lévő brit ázsiai családok családjában született az első családból. Az exomóma szekvenálás homozigóta csonkvariált (c.142C> T, p. (Gln48 *)) tárt fel a PET100 génben, ami az enzimaktivitás és a holokomplex összeállítás teljes elvesztését eredményezi. Jelentésünk megerősíti, hogy a PET100 mutáció az izolált komplex IV hiányának fontos oka a libanoni populáción kívül, ezáltal bővítve a gén rendellenességeivel járó fenotípus spektrumot.
A mitokondriális oxidatív foszforiláció (OXPHOS) az elsődleges út az adenozin-trifoszfát (ATP) előállításához az eukarióta sejtekben. Ez az OXPHOS rendszer öt transzmembrán komplexet (I-V) tartalmaz, amelyek a következőkből állnak:
Itt a teljes exoma szekvenálás alkalmazásáról számolunk be az izolált COX-hiány alapjának tisztázása érdekében olyan gyermekbetegben, akinek súlyos és végzetes újszülöttkori mitokondriális betegsége van a PET100 gén csonkolásának homozigóta változata miatt. Élesztőben végzett korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a PET100 gén a COX biogenezisében szerepet játszik, 21, 22, 23, és a Le100-szindrómában szenvedő 10 egyénnél egy újabb libanoni mutációt írtak le a PET100 alapítójában. Betegünk fibroblasztjai és vázizmai károsodott komplex IV aktivitást mutattak, ami a COX összeállításának mély rendellenességével és a komplex IV fehérjék egyensúlyi állapotában csökkent szinttel társult. Ezek az adatok további bizonyítékokat szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy a PET100 alapvető tényező a IV komplex érlelésében és összeállításában.
Tantárgyak és módszerek
1. beteg
Betegünk (ID 73387) egy 34 hetes terhesség alatt az Imperial Resortban született gyermek, az első unokatestvér brit pakisztáni testvérének családjában. Az antenatalis vizsgálatok azt mutatták, hogy terhessége kicsi, születése idején 1,19 kg-os, a fej kerülete 26, 7 cm, jóval 0,4 centil alatt van. A növekedés visszamaradása miatt beindult a munka, de nem sikerült, ami sürgősségi császármetszéshez vezetett. Az Apgar-pontszám 1 perc alatt 4, 5 perc alatt 7 és 10 perc alatt 9 lett. Az újszülött intenzív osztályára került a légutak folyamatos pozitív nyomású szellőztetése céljából.
Molekuláris genetika
A teljes genomi DNS-t standard módszerekkel állítottuk elő, és számos COX együttes (SURF1, SCO1, SCO2, COX10, COX14, COX15, COA5, LRPPRC, TACO1, FAM37A) és strukturális (NDUFA4) gének kódoló régióját, valamint intron és exon határait amplifikáltuk. lokusz-specifikus primerek alkalmazásával (szekvenciák külön kérésre rendelkezésre állnak), szekvenálva a BigDye v3.1 kit alkalmazásával és kapilláris elektroforézissel az ABI3130xl fluoreszcencia szekvenáló platformon (Life Technologies, Warrington, Egyesült Királyság).
A teljes exoma szekvenálást végeztük a gyermek mitokondriális betegségének bemutatásához szükséges genetikai alap meghatározása céljából, a fentiek szerint. A SureSelect Human All Exon 50 Mb V5 készletet (Agilent, Santa Clara, Kalifornia, USA) használtuk a kódoló DNS-fragmensek gazdagítására, és a szekvenálást HiSeq2000 rendszeren (Illumina, San Diego, CA, USA) hajtottuk végre. A BWA-t (0.5.8 verzió) alkalmaztuk az olvasás összehangolásához a humán referenciakészlettel (hg19) és az egy nukleotid variánsokkal (SNV), és kis inszerciókat és deléciókat detektáltunk SAMtools (0.1.7 verzió) alkalmazásával. Az átlagos lefedettség 128-szoros volt, és a célterület> 97% -a legalább 20-szoros volt lefedve, ami lehetővé teszi a nagy megbízhatóságú hívásokat. A részletes szekvenálási statisztikákat az 1. táblázat mutatja.
Asztal teljes méretben
Sejtlízis és western blotolás
A tenyésztett fibroblasztokat összegyűjtöttük és 50 mM Tris-HCl-ban (pH 7,5), 130 mM NaCl-ban, 2 mM MgCl2-ban, 1 mM fenil-metánszulfonil-fluoridban (PMSF), 1% Nonidet P-40-ben (v/v) és 1x EDTA-gátló mentes inhibitorban lizáltuk. proteázok (Pierce, Rockford, IL, USA). A protein-lizátumokat (40 μg) méret szerint elválasztottuk 12% -os géleken nátrium-dodecil-szulfát - poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) és elektroforetikusan PVDF membránra helyeztük (Immobilon-P, Millipore Corporation, Darmstadt, Németország). Az immunblottot primer és HRP-konjugált szekunder antitestek alkalmazásával végeztük.
Mitokondriális készítmény és kék natív elektroforézis
A tenyésztett fibroblasztokat összegyűjtöttük, homogenizációs pufferben (HB) (0,6 M mannit, 1 mM etilén-glikol-tetraecetsav, 10 mM Tris-HCl, pH 7, 4,1 mM PMSF és 0,1% (v/v)) szuszpendáltuk. ) és 3x15 homogenizációs átmenetnek vetjük alá, teflonüveg Dounce homogenizátor alkalmazásával, 4 ° C-on. A magok eltávolításához standard differenciál centrifugálást (400 g 10 percig) használtunk, a sejtek törmelékét és a mitokondriumokat végül 11 ° C-on pelletáltuk. 000 g 10 percig 4 ° C-on. A mitokondriumokat HB-ban BSA nélkül mossuk, és a végső pelletet n-dodecil-β-D-maltozidban (DDM) (Sigma) oldjuk 2 mg/mg fehérjében jégen 20 percig. percek. Centrifugálás után (100 000 g 15 percig, 4 ° C-on) a felülúszót összegyűjtöttük és Coomassie Blue G-250-t (AMS Biotechnology (Europe) Ltd, Abingdon, Egyesült Királyság) adtunk hozzá. A mitokondriális membránfehérjéket (50 μg) egy NativePAGE 4-16% BisTris gélre (Life Technologies) töltöttük, elektroforetikusan elválasztottuk és PVDF membránra helyeztük. A membránt ezután immunblotolták OXPHOS-komplexek elleni antitestekkel.
immunblotta
A következő elsődleges antitesteket használtuk az immunblotoláshoz: NDUFA9 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA, A21344), NDUFB8 (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság, ab110242), SDHA (MitoSciences, Eugene, OR, USA, MS204), UQCRC2 (Abcam, ab14745), COX1 (Abcam, ab14705) és COX2 (Molecular Probes, A6404), ATP5A (Abcam, ab14748), ATPB (Abcam, ab14730) és TOM20 (Santa Cruz, Heidelberg, Németország, sc11415). HRP-konjugált anti-egér vagy nyúlellenes szekunder antitesteket (P0260 és P0399; Dako, Glostrup, Dánia) használtunk. A jel detektálására az ECL Prime Kit kemilumineszcens készletet (Amersham, Little Chalfont, Egyesült Királyság) és a ChemiDocMP képalkotó rendszert (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Egyesült Királyság), az elemzéshez pedig az Image lab 4.0.1 szoftvert (Bio-Rad) használtuk.
az eredmény
Izom hisztokémia és légzési lánc elemzés
A páciens izombiopsziás elemzése a COX hisztokémiai aktivitásának súlyos és globális elvesztését mutatta (nem látható), amit a légzési lánc aktivitásának spektrofotometriás vizsgálata is megerősített, amely súlyos és izolált IV komplex hiányt mutatott ki az izomhomogenátokban (1a. Ábra). ). Ezt a megfigyelést fibroblasztos betegeknél igazolták, akiknél a IV komplex aktivitása jelentősen csökkent (1b. Ábra).
A IV komplex izolált mitokondriális légzési láncának hiányának azonosítása az izmokban és a fibroblasztokban, valamint a PET100 variáns elemzése. Az egyes légzési lánc enzimek aktivitásának értékelése az izmokban ( a ) és fibroblasztok ( b ) egy súlyos OXPHOS komplexet azonosított a komplex IV-ben a betegek izolálásában (kék sávok) a kontrollokhoz képest (piros sávok); az izomkontroll (n = 25) és a fibroblaszt kontroll (n = 10) átlagos enzimaktivitása 100%. ( c ) Családi törzskönyv, amely megerősíti a hordozó állapotát p. (Gln48 *) klinikailag nem érintett szülőknél, míg a proband homozigóta a csonkvariánsra.
Teljes méretű kép
A molekuláris genetikai vizsgálatok a PET100 új csonka változatát azonosítják
A PET100 mutáció a IV komplex károsodásához vezet
A PET100 variánshoz kapcsolódó biokémiai hiba jellegének további jellemzését a beteg fibroblasztjaiban végeztük. Az OXPHOS komplex egyes alegységeinek egyensúlyi szintjét és az azt követő mitokondriális légzési lánc komplexekbe való beépülését kék-natív PAGE (BN-PAGE) és SDS-PAGE elemzéssel elemeztük.
Az OXPHOS komplex komponensek egyensúlyi állapotának elemzése megerősítette a COXI és a COXII szignifikáns csökkenését a betegeknél a kontroll fibroblasztokhoz képest (2a. Ábra). Az összes többi elemzett komplex (I, II, III és V) egyensúlyi állapotának egyikében sem találtunk szignifikáns változást, bár a III komplex szintje a légzési lánc enzimnek megfelelően emelkedett.
A densitometrikus elemzés alapján 1,6-szoros (2a. Ábra). Korábban hasonló megfigyelést végeztek a COX kit másik génjében, a SURF1-ben található patogén variánsokkal rendelkező betegeknél. 28 TOM20-at használtunk mitokondriális bevezető markerként, és megerősítettük a kontroll és a beteg mitokondriális fehérjeinek azonos terhelését.
Az OXPHOS komponensek és komplexek egyensúlyi szintjei. ( a ) A kontroll (C1 és C2) és a beteg (P) fibroblasztok (40 μg) sejtlizátumát SDS-PAGE-val (12%) és immunblottozással elemeztük. Alegység-specifikus antitesteket alkalmaztunk CI (NDUFA9, NDUFB8), CII (SDHA), CIII (UQCRC2), CIV (COX1, COX2) és CV (ATPB) ellen. Terhelés kontrollként a külső mitokondriális membrán markert, a TOM20-at használtuk. ( b ) A betegekből (P) és a kontroll (C1) fibroblasztokból izolált mitokondriális fehérjéket (50 μg) egydimenziós BN-PAGE-val (4-16% gradiens) elemeztük alegység-specifikus antitestek alkalmazásával (CI (NDUFA9)). CII (SDHA), CIII (UQCRC2), CIV (COX1) és CV (ATP5A)) az egyes OXPHOS-komplexek összeállításának értékelésére. A Complex II-t (SDHA) használtuk terhelés-kontrollként.
Teljes méretű kép
Az egyensúlyi állapotú CIV fehérjeszint csökkentésével és a légzési lánc komplex aktivitásának biokémiai mérésével (1b. Ábra) összhangban a BN-PAGE elemzés szignifikánsan csökkent komplex IV komplex mennyiséget mutatott ki a betegek sejtjeiben az életkorhoz illeszkedő kontrollokhoz képest (2b. Ábra). Az OXPHOS komplex ezen vesztesége azért volt specifikus, mert az I, II, III és V komplexek összeszerelési profilja normális volt.
Ezek az adatok azt mutatják, hogy a p100 (Gln48 *) PET100 homozigóta variáns a COX alegységek és egy teljesen összeállított IV komplex specifikus és súlyos veszteségét eredményezi.
vita
Noha az izolált COX-hiányt az energia-anyagcsere egyik leggyakoribb rendellenességének tekintették, változatos genetikai etiológiája van, amely tükrözi az mtDNS-komponensek és a nukleárisan kódolt komponensek biogenezisének és érett holoenzimbe történő összeállításának összetett természetét; sok chaperone fehérje által elősegített folyamat. A patogén variánsokat számos olyan összeállítási tényezőben írták le, amely szükséges a funkcionális COX enzim kialakulásához. 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 A magasan konzervált PET100 COX-összeállítási faktor alapmutációját a közelmúltban 10 libanoni egyénnél azonosították, akiknek CO-hiánya volt elszigetelt, és akiknek Leigh-szindróma és rohama volt. 24.
Itt arról számolunk be, hogy a csonka PET100 új változata végzetes infantiilis tejsavas acidózist és izolált COX-hiányt okoz egy bennszülött brit pakisztáni szülőtől született csecsemőben. A PET100 génben a patogén nonszensz (kb. 142C> T, o. (Gln48 *)) változatát a teljes exoma szekvenálásával azonosítottuk, ami a komplex IV enzimaktivitás károsodásához és rendellenes COX-összeállításhoz vezetett. Eredményeink összhangban vannak a korábban publikált adatokkal, amelyek arra utalnak, hogy a PET100 konzervált biogenezis faktor, amely részt vesz a IV komplex érlelésében emberben 24 és élesztőben. 21., 22., 23. Az PET100 élesztő homológ nem elengedhetetlen a COX polipeptidek lokalizálásához a belső 21 mitokondriális membránhoz, de fontos szerepet játszik a későbbi összeszerelési folyamatokban, ahol megkönnyíti a COX intermedierek összeszerelését. Ezzel szemben úgy tűnik, hogy a humán PET100-ra korábban szükség van a mitokondriálisan kódolt COX alegységek összeállításának folyamatában. Eredményeink bemutatják a PET100 fontosságát az OXPHOS működésében, és alátámasztják a korábbi vizsgálatokat; A 21, 22, 23, 24 azonban további vizsgálatot igényel, hogy teljes mértékben megértsük ennek az enzimnek a COX-holoenzim érlelésében betöltött pontos szerepét.
A teljes exoma szekvenálás gyors és hatékony megközelítés a mitokondriális légzőszervi rendellenességek molekuláris bázisainak tisztázására, beleértve az izolált COX hiányt is. Eredményeink megerősítik, hogy a PET100 fontos jelölt betegség gén az izolált COX-hiányban szenvedő betegeknél. A következő generációs szekvenálás legújabb fejleményei lehetővé tették az egyszerű mitokondriális betegségben szenvedő betegek gyors és pontos diagnosztizálását kis családokban, megkönnyítve a megfelelő tanácsadást és olyan megelőző stratégiák biztosítását, mint a prenatális diagnózis és a preimplantációs genetikai profilalkotás.