A normál fázisú kromatográfia a molekulák szétválasztására használt kifejezés, amely a hidrofil, poláris jellegzetes csoportok és a kromatográfiai oszlop hidrofil mátrixának kölcsönhatását használja, a mozgó fázis nem poláros oldószer, pl. kloroform (HC-Cl3). Ezt a technikát használják a kicsi, szerves analitok szétválasztására, de nem nagyon alkalmas nagy fehérjék szétválasztására.
Másrészt a fordított fázisú kromatográfia (RPC) egy fehérje hidrofób felületeit használja kölcsönhatásba egy hidrofób ligandummal. A fehérje hidrofóbitását főleg az izoleucin, valin, leucin, fenilalanin, cisztein, metionin és triptofán aminosavak oldalláncai képviselik. A mozgófázis erősen poláros oldószer.
| normális fázis | fordított fázis | |
| a ligandum jellegzetes csoportja | hidrofil | hidrofób |
| kölcsönhatás a mátrixszal | hidrofil | hidrofób |
| kezdeti mobil fázis | nem poláris | erősen poláris |
| elúció | poláros oldószer | nem poláros oldószer |
Az RPC mátrixa szilikagél vagy szintetikus kopolimer (polisztirol), amely ellenáll a nagyobb üzemi nyomásnak. A kisebb gömbök jobb felbontást biztosítanak. A ligandum megválasztása a tisztítandó fehérje hidrofób természetétől függ. A hosszú hidrofób oldallánccal rendelkező mátrixok (pl. C18) nagyon szorosan kötik a fehérjéket, míg a C4 láncok, ill. aromás fenilcsoport, lazább kötésben vannak, ezért csak erősen hidrofób fehérjéket kötnek meg. Általában jó, ha egy alacsony hidrofób képességű mátrixból indulunk ki.
A mobil fázis polaritásának csökkentésével - egy nem poláros, szerves oldószerrel történő fokozatos cserével - csökken a fehérjék hidrofób régióinak és a mátrixnak a kölcsönhatása, és bekövetkezik az elúciójuk. Minél hidrofóbabb a fehérje, annál nagyobb mennyiségű szerves oldószert használunk az eluálására. A leggyakrabban alkalmazott oldószer az acetonitril (H3C-C≡N) vagy a metanol (H3C-OH).
Az oszlop kiegyenlítése után alkalmazzuk a fehérjeoldatot. Az oszlopon csak hidrofób molekulákat lehet befogni. A szerves oldószer koncentrációjának fokozatos növelésével (0-100%) elérjük a fehérjék fokozatos kiszorítását a mátrixból. A legerősebb kölcsönhatásokat csak néhány lépéses, 100% -os oldószeres mosással lehet megszakítani. Végül egyensúlyozzuk újra az oszlopot egy poláris jellegű oldattal, vagy nagyon alacsony koncentrációjú szerves oldószer.
A reverz fázisú kromatográfia előnye a molekulák széles körének szétválasztása, ideértve a töltött és a poláris molekulákat, az elválasztási körülmények (oldószer típusa, koncentráció, pH, hőmérséklet) következetes szabályozása, a nagy stabilitás, valamint az oszlop hatékonysága és robusztussága. Ez a módszer alkalmas analitikai célokra, de nem túl alkalmas fehérjetisztításra annak biológiai tulajdonságainak tanulmányozására, mivel szerves oldószer okozhatja denaturációját. Főleg a HPLC technikában alkalmazzák, amely a fehérje elválasztását a mobil fázis nagyobb nyomása alatt végzi. Az RPC alternatívája a hidrofób kromatográfia (HIC).