kísérleti

  • elemeket
  • absztrakt
  • Háttér:
  • mód:
  • az eredmények:
  • következtetés:
  • A fő
  • Anyagok és metódusok
  • Etikai szempontok
  • A betegek kiválasztása és mintavétel
  • Érvényesítés
  • MMP-9 székletmérés
  • Statisztikai analízis
  • az eredmény
  • Érvényesítés
  • Az MMP-9 székletszintje a csoportok között
  • Az MMP-9 székletszintje a CRC helye és stádiuma szerint
  • vita
  • A változások története

elemeket

  • Colorectalis rák
  • Diagnosztikai jelek
  • hidroláz

Ez a cikk frissült

absztrakt

Háttér:

A vastagbélrák (CRC) az egyik vezető rosszindulatú daganat világszerte, és nagyon fontosak az olcsó, olcsó, nem invazív szűrési módszerek. A mátrix metalloproteináz-9 (MMP-9) szerepet játszik a CRC progressziójában, és szintje megemelkedik a tumor biopsziáiban. A fekális MMP-9 szint magas az ulceratív vastagbélgyulladásban szenvedő betegeknél, de CRC-ben szenvedő betegeknél még soha nem mérték. Az MMP-9 székletszintjének meghatározására összpontosítottunk általános kolonoszkópián átesett betegeknél endoszkópos és szövettani diagnózis alapján.

mód:

Százkilenc beteg adott székletmintát az MMP-9 elemzéshez. Általános kolonoszkópiát végeztek; a gyanús elváltozásokat szövettan alapján értékelték. Az MMP-9 székletszintjét ELISA-val mértük.

az eredmények:

A különböző csoportokra osztott betegek száma: negatív/divertikuláris: 34 (kontrollnak nevezzük); hiperplasztikus polipok: 15; adenomák: 32 (22 magas kockázatú); és CRC: 28. A széklet MMP-9 szignifikánsan megnőtt a CRC-ben az összes többi csoporthoz képest (P 400 000 új eset évente (Ferlay et al, 2013).) A betegség magas gyakorisága és az a tény, hogy a prognózis jól korrelál a diagnosztikai szakasz miatt a kolonoszkópia a CRC-szűrés arany standardja, magas érzékenysége és specifitása miatt, de vannak olyan hátrányai is, mint a szövődmények kockázata, a magas költségek és a betegek alacsonyabb elfogadhatósága szűrővizsgálati módszerként, ezért nem invazív módszerekre van szükség a CRC magas kockázatának kitett betegek azonosítása. ahol kolonoszkópia elvégzése szükséges.

A mátrix metalloproteinázok (MMP-k) a Zn 2+ -tartalmú endopeptidázok családja, amelyeket különféle sejttípusok, például tumorsejtek, mezenhimális sejtek, fibroblasztok és gyulladásos sejtek, például monociták, limfociták és neutrofilek szekretálnak. Megnövekedett MMP-9 expressziót találtak rektális karcinóma és vastagbélrák szövetmintákban, ahol ez rossz prognózissal korrelál (Unsal et al., 2008; Araujo et al., 2015; Yang et al., 2014). Nemrégiben kimutattuk, hogy az MMP-9 székletszintje megemelkedik aktív fekélyes vastagbélgyulladásban (UC) szenvedő betegeknél, összehasonlítva funkcionális gyomor-bélrendszeri rendellenességekkel (irritábilis bél szindróma domináns hasmenéssel) vagy egészséges kontrollokkal (Annahazi és mtsai, 2013). A fekális MMP-9 szintről kiderült, hogy előre jelzi a betegség aktivitását UC-ben szenvedő betegeknél (Annahazi et al., 2013), és magas specifitással rendelkezik a pouchitis diagnózisában (Farkas et al., 2014). Azonban az MMP-9 székletszintjét CRC-ben szenvedő betegeknél nem vizsgálták.

Ennek alapján a kórházunkban kolonoszkópos vizsgálaton átesett betegek MMP-9 székletszintjének mérésére és az eredmények elemzésére összpontosítottunk különféle kolonoszkópos és szövettani leletek szerint.

Anyagok és metódusok

Etikai szempontok

A vizsgálati protokollt a Szegedi Tudományegyetem Etikai Bizottsága hagyta jóvá Szegeden. Minden szervezet írásbeli és megalapozott beleegyezést adott a részvételhez.

A betegek kiválasztása és mintavétel

Összesen 109 beteget (férfi/nő: 58/51, életkor: 29-91 év, átlag: 66,0 év) vontunk be vizsgálatunkba, akiket a colorectalis részlegünkre írattak be az első orvosi osztályon Szegeden, akit mindenki számára kolonoszkópián vetettek át. Egyik betegnek sem volt korábban UC-je vagy egyéb rákja. Egy betegnek, akiről később kiderült, hogy rektális adenokarcinóma van, májáttétek voltak. A székletmintákat minden betegtől 2–4 nappal a kolonoszkópia előtt összegyűjtöttük, és a székletürítést követően 1 órán belül -20 ° C-on lefagyasztottuk. Az összes kolonoszkópia befejeződött, amíg a terminális ileum el nem ér. A kolonoszkópia során minden gyanús elváltozásból biopsziát vettünk, és szövettani vizsgálatot végeztünk. A kolonoszkópos és szövettani eredmények alapján a betegeket öt csoportba osztották: negatív, divertikulózis, hiperplasztikus polip, adenoma és CRC. Úgy ítélték meg, hogy az adenomák fokozottan rosszindulatúak, amikor a következő feltételek egyike teljesül: polipméret> 10 mm; villous adenoma vagy tubulovillous adenoma, legalább 20% villi komponenssel; kiváló minőségű dysplasia; vagy multiplex adenoma (> 3).

Érvényesítés

Csoportunk elsőként használt kereskedelmi immunvizsgálatot az R&D Systems humán kvantitatív enzimjeihez (Abingdon, Egyesült Királyság, Kat. DMP900) a széklet MMP-9 szintjének mérésére. Ezért validációs tesztet hajtottunk végre annak tesztelésére, hogy a székletmátrix maga befolyásolja-e az MMP-9 meghatározását, és hogy az R&D Systems kitje képes-e meghatározni az emberi ürülékkivonatokból az MMP-9-et.

Aktív emberi teljes fehérjét, az MMP-9-et (Abcam LTD, Cambridge, Egyesült Királyság; Kat. Sz .: ab157344; LOT-szám: GR218764-1) adtunk az extrakciós tápközeghez. A kontroll székletmintákat lemértük, és 1 ml extrakciós táptalajt MMP-9 hozzáadásával vagy anélkül 0,25 mg mintát adtunk be (a minta és az extrakciós tápközeg aránya 1: 4 volt). A mintákat 2x30 másodpercig azonnal homogenizáltuk, és szobahőmérsékleten 10 percig inkubáltuk. Ezt követően az összes homogenizátumot 1500 ° C-on centrifugáltuk g 10 percig, majd a felülúszók második centrifugálása az első centrifugálási lépésből 10 000-nél g 10 percig. A végső felülúszókat egy linearitási teszthez (párhuzamosság) dolgoztuk fel. A hozzáadott MMP-9-et tartalmazó kivonatot sorozatosan hígítottuk 1 + 1-vel, hogy az eredeti MMP-9 tartalom 50, 25, 12, 5 és 6, 25% -át kapjuk kivonattal ugyanabból a székletből, amely nem tartalmazott hozzáadott MMP-9-et. 9. Ezután az összes mintát, beleértve a 100% -ban hozzáadott MMP-9 kivonatot és az MMP-9 hozzáadása nélküli natív kontroll kivonatot, MMP-9 mérésnek vetettük alá, a fent említett ELISA kit alkalmazásával a humán MMP-9 esetében. A készlet képes az emberi 92 kDa-os Pro-MMP-9 és az MMP-9 82 kDa aktív formájának kimutatására, a gyártó leírása szerint. Az értékeléshez kapott hozzáadott MMP-9 fehérje 92 kDa Pro-MMP-9 volt.

MMP-9 székletmérés

A mintákat -20 ° C-on tároltuk legfeljebb 3 hónapig, majd 1 napig 4 ° C-on hagytuk megolvadni. Mindegyik székletmintából 1,0 g-ot hígítottunk, összekevertünk és homogenizáltunk 4 ml jéghideg Tris-pufferben (0,15 M NaCl + 20 mM Tris-HCl, pH: 8,3). Centrifugálás után (10 perc, 4500 fordulat/perc, 4 ° C) a pelleteket eltávolítottuk, és a felülúszókat nemrég centrifugáltuk (10 perc, 10 000 g; 4 ° C). A végső felülúszókat 0,8 μm pórusméretű fecskendőszűrőkkel szűrtük, és az alikvot részeket -20 ° C-on tároltuk az elemzésig. Az MMP-9-et a fent leírt kvantitatív enzimhez kapcsolt immunszorbens teszttel mértük.

Statisztikai analízis

A folyamatos adatokat a Kruskal-Wallis-teszt átlag ± sd-ként adtuk meg, amelyet a különböző csoportok (kontroll, hiperplasztikus polip, adenoma és CRC) MMP-9 székletszintjének összehasonlítására használtunk. A magas és alacsony kockázatú adenoma alcsoportok MMP-9 szintjét Mann-Whitney teszttel elemeztük. A daganat elhelyezkedése vagy stádiuma szerint különböző alcsoportokat hasonlítottunk össze a Kruskal-Wallis teszttel. A különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük, amikor P 0, 8 (Baker és Kramer, 2007). A határértéket a Youden-index maximális értéke (érzékenység + specifitás - 1) határozta meg. A statisztikai elemzéseket az R statisztikai szoftverrel (3.1.2 verzió) végeztük (//www.r-project.org/).

az eredmény

Érvényesítés

Az ng ml -1 -ben mért koncentrációkat az 1. ábra mutatja. Az ábra egyértelműen mutatja a hígításnak megfelelő lineáris koncentrációváltozást. Vagyis (i) a székletmátrix önmagában nincs hatással az MMP-9 meghatározására; és (ii) az R&D Systems kitje képes meghatározni az MMP-9-et emberi ürülékkivonatokból.

MMP-9 koncentrációs szintek különböző hígításokban az validációs vizsgálatban.

Teljes méretű kép

Az MMP-9 székletszintje a csoportok között

Különböző csoportok MMP-9 székletszintje (kolonoszkópia és szövettan alapján). Rövidítés: CRC = vastagbélrák.

Teljes méretű kép

ROC CRC kontra kontroll görbe.

Teljes méretű kép

Az MMP-9 székletszintje az adenonokban.

Teljes méretű kép

Az MMP-9 székletszintje a CRC helye és stádiuma szerint

A CRC helyén a betegek száma a következő volt: végbél: 14, szigmoid vastagbél: 6, lineáris hajlítás: 1, keresztirányú vastagbél: 2, májhajlítás: 2, emelkedő vastagbél: 1 és coecum: 2 beteg. Amikor az MMP-9 székletszintjét CRC-helyekkel elemeztük, nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget (P = 0, 146), bár a rektális daganatok esetében a magasabb szint felé mutató tendenciát figyeltünk meg (átlag: 12, 33 ± 7, 274 ng ml 1) a bal vastagbélhez (vastagbél-flexo-sigmoid vastagbél; átlag: 1619 ± 0,978 ng ml -1) és a keresztirányú jobb vastagbélhez (coecumból transzverz vastagbélig; átlag: 1830 ± 0,656 ng ml -1; 5A) A Dukes-osztályozás szerint nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget a csoportok között (5B. Ábra; P = 0,236).

Az MMP-9 székletszintje CRC-ben szenvedő betegeknél. Értékek ( A ) helye és ( B ) A CRC hercegi szakaszai.

Teljes méretű kép

vita

Legjobb tudásunk szerint először számoltunk be arról, hogy az MMP-9 szint megemelkedik a CRC-s betegek székletmintáiban, összehasonlítva a polipoid elváltozás nélküli betegekkel. Ezenkívül a széklet MMP-9 felhasználható a CRC-ben szenvedő betegek megkülönböztetésére a magas érzékenységű és specifitású polipoid elváltozások nélküli betegektől. Ezenkívül a széklet MMP-9 képes azonosítani a magas kockázatú, alacsonyabb cut-off szinttel rendelkező adenómában szenvedő betegek csaknem 60% -át.

Nem találtunk szignifikáns különbséget az MMP-9 székletszintjei között a különböző tumoros helyeken. A végbél adenokarcinómában szenvedő betegeknél azonban megfigyelhető volt a tendencia a legmagasabb MMP-9 szintre a székletben. Ez valószínűleg nem kapcsolódik a rektális daganatok természetéhez, de a FIT-hez hasonlóan az intumen lumenében a marker degradációjának rövidebb idejével magyarázható (Morikawa et al., 2005).

Ennek ellenére tanulmányunk alkalmas volt egy új marker, az MMP-9 széklet azonosítására, amely képes megkülönböztetni a CRC-t a polipmentes kontrollaktól. A széklet MMP-9-et a FIT számos előnye, valamint a molekuláris markerek jellemzik magas költségek nélkül. További, nagyobb és általánosabb populációra vonatkozó vizsgálatokra van szükség annak igazolására, hogy ez az ígéretes módszer alkalmas-e CRC-szűrésre kiegészítő tesztként.

A változások története

Ez a munka a szerződés közzétételére vonatkozó szabványos licenc alapján jelenik meg. 12 hónap elteltével a munka szabadon elérhetővé válik, és a licencfeltételek nem nyilvános Creative Commons Nevezd meg-Nem-kereskedeled-Oszd meg 4.0-s licencre váltanak.