elemeket

absztrakt

Nagyon kevés tanulmány elemezte, hogy az anya mikrobiómájának összetétele hogyan befolyásolja a csecsemők bél- és szájflórájának fejlődését az élet első hónapjaiban. Itt összehasonlítottuk az anya, a hüvely, az anyatej, a szájüreg és az emlő vénájában lévő mikrobiózist csecsemőik bélével és szájüregi mikrobiózisával a születés utáni első hat hónapban. Mintákat vettek a megjelölt testhelyekről hét anyától és kilenc gyermektől három különböző időpontban, 6 hónapos időtartam alatt. Minden mintát a 16S rRNS gén szekvenálásával elemeztünk. A csecsemők bél mikroflórája különböző mikrobiális közösségeket tartalmazott, amelyek kevéssé hasonlítottak az anyai különböző mikrobaközösségekre. Ezzel szemben a csecsemők orális mikrobiota nagy hasonlóságot mutatott az anyatej, az emlőmirigyek és a száj mikrobiózisával. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a mikrobiális közösségek közötti állandó kapcsolat fokozza hasonlóságukat. A csecsemő belekben és az orális mikrobiózisban a legtöbb operatív taxonómiai egység a bélbélekkel és az orális közösségekkel is közös volt. A csecsemők és az anyák bél mikroflórája közötti hasonlóság és az OTU-k aránya közötti különbség összefüggésben lehet az alacsonyabb diverzitással és ezért a csecsemők bél mikroflórájában folyó versengéssel.

Ennek a tanulmánynak a célja ezért az volt, hogy összehasonlítsa a különböző anyai mikrobaközösségek - bél-, hüvely-, szájüreg, anyatej és emlőmirigy - hatását a csecsemők bél- és szájflórájának fejlődésére a csecsemőpopuláció első hat hónapjában. élet.

Anyag és módszerek

Tanulmányi csoport és mintavétel

Terhes nőket vontak be ebbe a vizsgálatba a vajúdás spontán megindulásának első periódusában, vagy akár 24 órával az intakt magzamembránokkal végzett elektív császármetszés előtt. 2012 májusa és 2013 szeptembere között beiratkoztak a Tartu Egyetemi Kórház női klinikájára. Minden befogadott nőnek komplikáció nélküli terhessége volt, nem voltak olyan fertőző betegségei, amelyek antibiotikum-kezelést igényeltek volna, és korábban nem volt cukorbetegségük. vagy hipertóniás rendellenességek a terhesség második felében. Összesen hét anyát (átlagéletkor: 33,1 ± 4,5 év) fogadtak örökbe újszülöttjeikkel (anya-csecsemő pár). Két pár ikreket tartalmazott, és mind a négy gyermek részt vett ebben a vizsgálatban. Csak egy nő nem volt sokszínű (átlagos paritás, 1,4 ± 0,8). Öt nő császármetszéssel szült, és cefuroxim profilaktikus kezelést kapott a bőr metszése előtt. Valamennyi újszülött átlagos volt (átlagos terhességi életkor, 38,9 ± 1,6 hét), és normális születési súlyuk volt (átlagos súlya 3 379,3 ± 564,1 g). Az anyai és csecsemő párokat leíró klinikai tényezőket az S1. Kiegészítő táblázat tartalmazza.

Hatféle mintát vettek minden anya és csecsemőpárból születés előtt vagy születés után 48–72 órával, 6–8 hét és 6 hónappal a születés után. Ezenkívül minden anyától hüvelyi tamponmintát vettek a szülés előtt. Összesen 139 mintát vettünk (1. ábra). A mintavétel előtt nem használtak hüvelyi vagy bőrfertőtlenítőszert, és a mellmosót sem tisztították. Az összes vett mintát közvetlenül a mintavétel után -20 ° C-on tároltuk.

hatása

Az anya-gyermek párokból vett minták száma és típusa a megjelölt időpontokban.

Teljes méretű kép

A bakterioszkópos keneteket külön hüvelyi tamponmintából készítették, amelyet minden anyától a szülés előtt vettek. A mintákat Gram szerint festettük és a Nugent 7. módszerével értékeltük: 0-3 (normál), 4-6 (közepes) és 7-10 (bakteriális vaginosis (BV)).

Baktériumközösség profilozása

A DNS-t a MoBio PowerFecal DNS izoláló készlettel (Mo Bio, Carlsbad, Kalifornia) extraháltuk a gyártó utasításainak megfelelően. A különböző mintatípusokhoz azonban további lépéseket vezettek be. Röviden: az összes tamponmintát először körülbelül 10 percig vortexeltük 750 μl steril foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS). Minden száraz gyöngycsőbe 400 μl tamponmintát PBS-ben és 800 μl anyavizet adunk. 1 ml anyatejet először 20 percig 6000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltunk. A felülúszókat eltávolítottuk, és az egyes üledékeket 400 μl PBS-ben reszuszpendáltuk, mielőtt az egyes száraz gyöngycsövekbe átvittük őket. A csöveket ezután 30 percig 13 200 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A felülúszókat eltávolítottuk, és a 2. lépésben követtük a MoBio PowerFecal DNS izoláló készlet eljárását. A székletmintákból a DNS-t a gyártó protokolljának megfelelően extraháltuk. Az azonos mikrobiális közösségtípust képviselő minták egyetlen extrakciós DNS-t alkottak. A kivont DNS-t az elemzés előtt -20 ° C-on tároltuk.

A 16S rRNS V1-V2 hipervariábilis régiójának amplifikációját univerzális 27F-YM és 357 R primerek 8 vonalkódjaival hajtottuk végre. Az alapozó szekvenciák a következők voltak: 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNNNNNN AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3 '(Illumina TruSeq. 3 végű adapter) és 5-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC TGC TGC CTY CCG TA-3 '(a TruSeq univerzális adapter szekvenciája a 3' végén). Az amplifikációs feltételek magukban foglalják: 10 perc 98 ° C-on, majd 5 ciklus 30 másodpercig 98 ° C-on, 30 másodperc 55 ° C-on és 45 másodperc 72 ° C-on, 30 ciklus 30 másodpercig 98 ° C-on és 60 másodpercig 72 ° C-on és egy utolsó hosszabbítási lépéssel 72 ° C-on 10 percig.

A PCR-reakciók össztérfogata 20 μl volt, 10 μl Phusion High-Fidelity PCR Master Mix-szel (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA), 5 μl DNS-templáttal és minden primer 0,2 μM koncentrációval. A PCR-termékeket Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, Kalifornia, USA) alkalmazásával tisztítottuk, és az Illumina MiSeq rendszerrel szekvenáltuk az észtországi Tartu Egyetem Genom Központjában (egyvégű szekvenálás a MiSeq v2 készlet és 300 ciklus segítségével).

A bifidobaktériumok valós idejű elemzését DGGE-vel és PCR-rel a kiegészítő módszerekben leírt módszertan alkalmazásával végeztük.

Adatok és statisztikai elemzés

A kapott szekvenciák módosítására, csillapítására és összehangolására a MOTHUR 1.27.0 szoftvert használták, hogy működési rendszertani egységeket (OTU-kat) hozzanak létre és rendszertani rendszert hozzanak létre. A szekvenciákat kivágtuk és eldobtuk 225 bp minőségi pontszám alapján. Az OTU-kat egy átlagos összefüggő hierarchikus klaszterező algoritmus segítségével állítottuk elő, 97% -os azonossági küszöbértékkel. Az egyeztetett 16S rRNS génszekvenciák referenciaszekvenciáit a SILVA riboszomális RNS adatbázisából nyertük, és egy taxonómiai hozzárendelésekkel összehasonlítottunk egy élő Bayes-osztályozóval, 90% -os konfidenciahatárral. A kettőnél kevesebb szekvenciával rendelkező OTU-kat és a kevesebb mint két mintában lévő OTU-kat is elvetették. A Lactobacillus nemzetségbe leképezett sarkalatos OTU-k legvalószínűbb fajnevének meghatározásához újabb taxonómiai hozzárendelést hajtottak végre az NCBI 16S riboszomális RNS szekvencia adatbázisához BLASTN segítségével.

Minden elemzést Holm-Bonferroni korrekcióval végeztünk. A 0,05 alatti P-értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Etikai szempontok

Ezt a tanulmányt a Tartu Egyetem Kutatási Etikai Bizottsága hagyta jóvá (210T-7. Sz.), És minden résztvevő írásos tájékozott beleegyezést kapott a kézbesítési osztályra való felvételkor. Valamennyi módszert a vonatkozó irányelveknek és előírásoknak megfelelően hajtottuk végre.

az eredmény

Baktériumközösség profilozása 16S rRNS szekvenálással

Ebben a vizsgálatban összesen 1 106 448 kiváló minőségű szekvenciaolvasást generáltunk. A mintákhoz rendelt csonka szekvenciák minimális számának korlátja a közösség típusától függően 200 és 1400 között mozgott (S2. Kiegészítő táblázat). Ezen határértékeknél a minták legalább 90% -ának hígítási görbéi elérték az 5% -os fennsíkot. Ezen mintákból összesen 135 és 1530 OTU meghaladta ezeket a határértékeket, és tovább elemezték őket (GenBank csatlakozási számok a reprezentatív OTU szekvenciákhoz: KP117311-KP118840). Egy anyatej, egy anya és két csecsemő orális mintája nem lépte túl ezeket a határértékeket. A kapott OTU-kat 12 törzs, 89 család és 170 nemzetség között osztottuk fel.

A Shannon sokféleségi index legmagasabb értékeit az anya és az orális mikrobiosis belében figyeltük meg, és ezek a közösségek szignifikánsan különböztek a csecsemők belében és orális mikrobiosisában, amelyeknél lényegesen alacsonyabb a mikrobiális diverzitás (p

A koszinusz-hasonlósági index értékeit ábrázoló korrelációs grafikon a vizsgált mikrobaközösségek között Az idõpontok a csecsemõk születésével kapcsolatos mintavételi idõket jelentik.

Teljes méretű kép

A nem metrikus többdimenziós méretezés (NMDS) ábrázolja a Jaccard-távolság vizualizációját az elemzett mikrobaközösségek típusai mintái között.

Teljes méretű kép

Az elemzett közösségtípusokat gyarmatosító legfontosabb OTU-k relatív száma.

Teljes méretű kép

A csecsemők bél mikroflórája a vizsgálat során nem mutatott hasonlóságot az anyák közösségének egyik elemzett típusával sem, de nagy hasonlóságot figyeltek meg a csecsemők orális mikrobiózisa és az anyatejet, az emlőt és a szájüreget kolonizáló mikrobiózis között. üregek (2. ábra). Ez a négy típusú közösség a domináns OTU-k kombinációját tartalmazta, amelyek túlnyomórészt a Streptococcus nemzetséghez tartoztak, és amelyek minden populációban hasonlóan magas relatív gyakorisággal voltak jelen (4. ábra). Kivételt képeztek az OTU-k, amelyek feltérképezték a Staphylococcus és a Propionibacterium nemzetségeket. Ezeknek az OTU-knak alacsony volt a relatív bőségük (

A bél aggregátumokban megfigyelt OTU aránya ( A ) és szóbeli ( B ) az anyai típusokkal közös gyermek mikroorganizmusok. * A csecsemők béljét és mikrobiózisát minden elemzett időpontban összehasonlítottuk az anyáknál a szülés előtt megfigyelt hüvelyi mikrobiózissal.

Teljes méretű kép

A bélben megfigyelt átlagos arány 95% OTU konfidencia intervallummal ( A ) csecsemők és szájon át ( B ) mikrobiózist, amelyet az anyja közösségének típusaival osztottak meg (a megoszlást meghatározott anya-gyermek párok osztották meg). * A csecsemők béljét és mikrobiózisát minden elemzett időpontban összehasonlítottuk az anyáknál a szülés előtt megfigyelt hüvelyi mikrobiózissal.

Teljes méretű kép

A csecsemők belek és mikrobiózisa nem mutatott szignifikánsan nagyobb hasonlóságot anyjuk mikrobaközösségeivel, mint más anyák mikrobaközösségeivel, és a hasonlóság a vizsgálat során nem változott szignifikánsan (7. ábra és S2.

Átlagos hasonlósági index a kecskék között ( A ) és szóbeli ( B ) a mikrobiózis és a saját anyjuk mikrobaközösségének típusai (piros pontok), valamint a többi anya által megfigyelt közösségtípusok (Tukey boxplot) alapján.

Teljes méretű kép

Csecsemő bélösszetétele és orális mikrobiota

A vizsgálat során a firmutató hatások szignifikánsak voltak a csecsemők orális mikrobiotájában is (átlagos relatív abszociáció [0, 8] [0, 16]) (S3 kiegészítő ábra). Az alacsonyabb rendszertani szinteket a Streptococcaceae (0, 7 [0, 18]), majd a Pasteurellaceae (0, 08 [0, 09]) uralta. A csecsemők orális mikrobiája viszonylag stabil volt a vizsgálati időszak alatt (S6-C kiegészítő ábra), és nagyon hasonló volt a csecsemőknél.

Ebben a vizsgálatban az ebben a vizsgálatban szereplő ikrek bél- és orális mikrobiózisa nem mutatott nagyobb hasonlóságot e páros testvérek között, mint más gyermekeknél megfigyelték (átlag [SD] CSI: 0,35 [0,38 vs. 0,32 [0,34] és 0,76 [0,24 ]). vs. 0,75 [0,22] a bél mikroflóra és az ikrek közötti szájüregi mikrobiózis esetében, összehasonlítva más gyermekekkel). A vaginálisan és császármetszéssel szemben született csecsemők belek és orális mikrobiota nem mutattak nagyobb hasonlóságot (0,22 [0,16] szemben 0,35 [0,38] és 0,8 [0,82 vs. 0,73 [0,24].] A hüvelyileg született gyermekek császármetszés).

Az anyákat gyarmatosító mikrobaközösségek összetétele

vita

Legjobb tudomásunk szerint ez az első olyan tanulmány, amelyben elemzik az anyai mikrobiózis testének különböző részeire gyakorolt ​​hatását a csecsemők belében és az orális mikrobiózisban. Az általunk vizsgált anya és csecsemő pár alapján úgy tűnik, hogy a csecsemő mikrobiózisa erős mikrobaközösséget tartalmaz, amely alig hasonlít az anya belét, hüvelyszövetét, bőrét, anyatejét és szájüregét kolonizáló mikrobiózissal az élet első hat hónapjában. a gyermek élete. Ezzel szemben a csecsemők orális mikrobiája, valamint az anyatej mikrobiózisa, az emlőmirigy mikrobiózisa és a szájüreg mikrobiózisa nagyon hasonló volt egymáshoz.

Az anyatejet és az emlőrákot gyarmatosító közösségekben megfigyelt magas Streptococcus OTU-mennyiség, valamint az emberi tej tipikus kolonizálóinak számító Staphylococcus és Propionibacterium bőséges jelenléte az anyatej mikrobiomjában (S6. a szoptatás alatt, ahogy Ansicar és mtsai előre láthatták. 9. Mivel a mell areoláit a mintavétel előtt nem sikerült megtisztítani, a vizsgálat túlbecsülheti a csecsemők orális mikrobiózisa és a mell areoláit kolonizáló mikrobiózis közötti hasonlóságot.

Más anyákkal összehasonlítva nem tapasztaltunk nagyobb hasonlóságot a csecsemők és anyjuk mikrobiális közösségei között (7. ábra). Ez meglepőnek tűnhet, tekintettel arra, hogy számos korábbi tanulmány megfigyelte a 9, 10 baktériumtörzsek anyától a gyermekig terjedő átvitelét, de eredményeink nagy valószínűséggel a 16S rRNS génszekvenálás hiányára utalnak a taxonok alacsonyabb szintű azonosításában, mint a 14 nemzetség. Így a törzsek szintjén a közösségek összetételének elemzésében elért eredményeink nem zárják ki az egyes anya- és csecsemőpárok közötti jelentős hasonlóságot (és a közösség más mintáját más anyáktól).

A vizsgálat másik korlátja a kis mintanagyság volt, valószínűleg ez az oka annak, hogy nem figyeltük meg az adagolás típusának és az etetési rendnek a gyermekek belek és mikrobák összetételére gyakorolt ​​hatását. Ezeket a hatásokat számos korábbi tanulmány jól leírja [pl. Hivatkozások 6, 10]. A legtöbb bifidobaktériumos taxont azonban az ikrek bél mikroflórájában figyelték meg, akik rövidebb ideig szoptattak és helyette prebiotikus tápszert kaptak. Ez az eredmény összhangban áll Barrett és munkatársai tanulmányával. 15, ahol a legnagyobb számú bifidobaktérium törzset és változatosságot a (III) általános képletű prebiotikumokat (pl. Galaktooligoszacharidokat és polifruktózt) kapó csecsemőknél figyelték meg. .

Összegzésképpen megállapítható, hogy a csecsemők bél mikroflórája eltér az ebben a vizsgálatban elemzett anyai közösség minden típusától, míg a csecsemők orális mikrobiota nagy hasonlóságot mutatott az anyatej és az emlőmirigy mikrobiózisával. Ezek az eredmények rávilágítanak a mikrobaközösségek közötti folyamatos kapcsolat jelentős hatására. Megállapították azonban, hogy mind a gyermekkori bélrendszeri, mind az orális mikrobiotában a legnagyobb az OTU aránya a megfelelő típusú anyai közösséggel. A csecsemők és az anyák bél mikroflórájában megfigyelt OTU hasonlósága és aránya közötti különbség összefüggésben lehet a fajok alacsonyabb diverzitásával, és így a csecsemők bél mikroflórájában alacsonyabb versengéssel, ami a megosztott OTU-k bőségének különbségéhez vezethet.,

köszönöm

Köszönjük Heili Varendi és Anneli Aus, a Tartu Egyetemi Gyermekklinika technikai segítségét. Ezt a tanulmányt az Észt Kutatási Tanács (IUT34-19 és IUT34-16 támogatások), az észt Oktatási és Kutatási Minisztérium (KOGU-HUMB támogatás sz. Támogatás), az Európai Unió támogatta az Európai Regionális Fejlesztési Alapon (SFOS reg.) 3.2.0701.11-0023), az Enterprise Estonia (támogatás száma: EU48695) és a Horizont 2020 innovációs program (WIDENLIFE, EU692065). Jaak Simm finanszírozza a KU Leuveni Kutatási Tanácsot (GOA/10/09 MaNet, CoE PFV/10/016 SymBioSys) és PhD/Postdoc támogatásokat a flamand kormánytól (IOF, Hercules Stitching, iMinds Medical Information Technologies SBO 2014). A finanszírozást az Intel, a Janssen Pharmaceutica és a Flamand Tudományos és Technológiai Intézet (IWT) is biztosította.

Elektronikus kiegészítő anyag

További információ

Hozzászólások

Megjegyzés beküldésével vállalja, hogy betartja Általános Szerződési Feltételeinket és közösségi irányelveinket. Ha ezt sértő cselekedetnek találja, amely nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.