elemeket

absztrakt

A Human Genome projekt befejezése és a genom egészére kiterjedő szűrés kidolgozása a mikroarray technológiát a pszichiátriai rendellenességek etiológiájára gyakorolt ​​genetikai hatások tanulmányozásának fontos eszközévé tette 7. Korábbi tanulmányok azt találták, hogy a vérben és az agyszövetekben található gének expressziós mintázata hasonló, 8, 9, és könnyebb mérni a génexpressziót a vérben, mert minimális invazivitással elérhető. A microarray megközelítéseket széles körben alkalmazták olyan neuropszichiátriai rendellenességek vizsgálatára, mint a skizofrénia 10, a bipoláris 11 rendellenesség és a súlyos depressziós rendellenesség (MDD) 12. Ezenkívül mikroszkópos adatokkal olyan új géneket és útvonalakat találtak, amelyek összefüggésben lehetnek a pszichiátriai rendellenességek etiológiájával. Tudomásunk szerint azonban az OCD betegek perifériás vérében a génexpresszió vizsgálatára nem alkalmaztak mikroradiákat. Ebben a tanulmányban az OCD-s betegek és az egészséges kontrollok között differenciáltan expresszálódó gének (mRNS) kimutatására összpontosítottunk microarray technológiával. Elemeztük a gének ontológiai (GO) és a génekhez kapcsolódó gének és genomok (KEGG) útvonalainak kiotói enciklopédiájának elemzését is, hogy megvizsgáljuk a differenciálisan expresszált mRNS-ek funkcióit.

az eredmény

Különböző módon expresszált mRNS

Mikro-sugarakat használtunk 30 OCD-beteg és 30 páros egészséges kontroll perifériás vér mononukleáris sejtjeiből (PBMC) származó mRNS genomiális vizsgálatára.

Összesen 51 differenciálisan expresszált mRNS-t találtunk ≥ 1, 5-szeres változással és hamis pozitív gyakorisággal

betegek

A perifériás vér mononukleáris sejtek teljes genomjának génexpressziós profiljában bekövetkező változások vulkanikus grafikonja OCD és egészséges kontrollok között. Összesen 51 szignifikánsan differenciálisan expresszált mRNS-t találtak ≥1,5-szeres változással és Bonferroni-korrigált p-értékkel

A hőtérkép top 100 különböző módon expresszált gén, amely megkülönbözteti az OCD-s betegeket és a hierarchikus klaszteranalízissel nyert egészséges kontrollokat.

Teljes méretű kép

Funkcionális kommentár

A GO funkcionális dúsításának elemzése azt mutatta, hogy az 51 szignifikánsan differenciálisan expresszált mRNS-ből 23 gazdagodott riboszomális fehérje szempontjából, ideértve a celluláris fehérje metabolikus folyamatát, az endokrin hasnyálmirigy fejlődését, a vírus transzkripcióját, a vírusfertőzés ciklusát, a vírus reprodukcióját, a génexpressziót, az RNS transzlációt és a transzlációt . Az NDUFA4 (NADH dehidrogenáz (ubiquinone) 1alpha szubkomplex), az NDUFA5 és az NDUFA1 kódoló gének jelentősen gazdagodtak mitokondriális elektrontranszferben és a NADH ubiquinonig, és az NDUFA4, COX7C (citokróm) citokróm) transzmembrán hidrogéntranszport.

A szignifikánsan differenciálisan expresszált mRNS-ek KEGG 51-es sávjának elemzése 23 mRNS-t is azonosított, amelyek riboszómára dúsultak; NDUFA4, NDUFA5, COX7C, NDUFA1 és UQCRB, amelyek jelentős mértékben gazdagodtak Parkinson-kórban, Alzheimer-kórban, Huntington-kórban és alkoholmentes zsírmájbetegségben, valamint COX7C, CACNB4 (kalciumcsatorna, feszültségfüggő alegység, béta 4 alegység), béta 4 alegység jelentősen gazdagodott a szívizom összehúzódásával (2. táblázat).

Asztal teljes méretben

Valós idejű PCR validálás (qRT-PCR)

A mikroarray elemzés eredményeinek igazolásához 10 különböző módon expresszált mRNS-transzkriptumot választottunk ki validálásra qRT-PCR-rel, nevezetesen az RPS3A, RPL34, RPS24, RPL23, RPS7, RPL41, RPL7, RPL26, ZNF721 és COMMD6. A qRT-PCR eredmények azt mutatták, hogy az RPL34-et a mikroarray elemzés szerint lefelé szabályozták, míg az RPS3A, az RPS24, az RPL23, az RPS7, az RPL41, az RPL7 és az RPL26-ot (3. táblázat). A ZNF721 és a COMMD6 nem volt kimutatható, hogy qRT-PCR-rel differenciáltan expresszálódjanak az OCD és az egészséges kontrollok között (3. táblázat).

Asztal teljes méretben

vita

Legjobb tudomásunk szerint ez az első olyan vizsgálat, amely az OCD és egészséges kontrollok között differenciálisan expresszált géneket tárt fel microarray mRNS technológiával. Találtunk 45 mRNS-t, amelyek nem voltak szabályozva, és 6 mRNS-t, amelyek felfelé voltak szabályozva az OCD-ben szenvedő betegeknél.

Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az OCD patofiziológiájában szerepet játszó fontos gének társultak a szerotonin-, dopamin- és glutamátrendszerekkel 13, 14, 15; ebben a vizsgálatban azonban nem detektáltuk ezeket a géneket. Ezek a különbségek az alkalmazott különféle kutatási módszerekkel magyarázhatók. Korábbi vizsgálatokban a 13, 14, 15 jelölt génjelölteket alkalmazták az OCD-vel kapcsolatos gének vizsgálatára, míg a mikro-sávokat az OCD-vel kapcsolatos gének kimutatására 16. A GO és KEGG elemzések 23 különböző módon expresszált mRNS-t tártak fel, amelyek a riboszomális fehérjéhez (RP) kapcsolódó terminusok és utak miatt dúsultak.

A riboszómák két különböző 17 alegységből álló szubcelluláris organellumok, és mindegyik alegység különböző számú riboszomális RNS-t (rRNS-t) és RP-t tartalmaz. A nagy 60S riboszomális alegységek összeállnak a 40S kicsi alegységekkel 80S riboszómákat alkotva. Emlősökben a 80S riboszomális nukleoprotein komplex 4 rRNS-t és körülbelül 80 fehérjét tartalmaz, több mint 150 asszociált fehérjével és körülbelül 70 kis nukleáris RNS-szel 18. A kis 40S alegység közvetíti a tRNS és az mRNS közötti kölcsönhatásokat, és kiválasztja a dekódoló központ számára a megfelelő tRNS-t. A nagy 60S alegység tartalmaz egy peptidil-transzferáz centrumot, és egy kijárati alagutat biztosít a növekvő, kialakulóban lévő polipeptidlánc számára. A riboszómák működése az mRNS fehérjékké történő transzlációjában és a transzlációban határozottan függ a riboszóma (RP) fehérjéktől19. Az RP-k erősen konzerváltak, ezért a mennyiségi hiányosságok csökkent 20 fehérjeszintézishez vezetnek, ami számos kóros folyamatot érinthet, például a rákot 21, a genetikai betegségeket 22 és a vírusfertőzéseket 23. .

A cinkujjfehérje (ZNF) család tagjai DNS- és RNS-kötő motívumokkal rendelkeznek, és az aminosavak egyetlen szerkezeti egységbe állnak össze a cinkatom körül 32. A ZNF fehérjék sokféle funkcióval rendelkeznek, beleértve a DNS transzkripcióját és felismerését 33. A ZNF804A-t a pszichiátriai rendellenességekkel társított egyik legkiemelkedőbb kockázati génként azonosították 34, 35 Ebben a tanulmányban azt találtuk, hogy a ZNF721 mRNS csökkent OCD-s betegeknél.

Körülbelül 10 évvel ezelőtt fedezték fel a fehérjéket (más néven MURR1) tartalmazó COMMD (réz metabolikus domén) fehérjéket, és napjainkig 10 COMMD fehérje ismert. Például részt vesznek a réz homeosztázisában, az NF-KB transzkripciós faktor (nukleáris faktor κB) szabályozásában és a sejtek proliferációjában 36. A COMMD6, mindenütt expresszált kis oldható fehérje és endogén NF-κB inhibitor, megköti a DNS-t és aktiválja a 37, 38 transzkripciót. Az NF-κB aktiválása néhány neurodegeneratív betegséggel társult az NF-κB 39 neurotoxikus szerepének következményeként. A COMMD6 lefelé történő szabályozása vagy egy másik NF-κB inhibitorral, az NFκBIA-val történő kezelés fokozhatja az NF-κB aktivációt, ami károsíthatja a hippokampus működését OCD-ben szenvedő egyéneknél.

A NADH dehidrogenáz alegység (ubiquinone) 1 alfa szubkomplex (NDUFA4) a citokróm c-oxidáz 14. alegysége. Az NDUFA4L2 gátolja az oxidatív foszforilációs I komplexet, a végső oxigén komplexet, amely a mitokondriális légzési lánc enzim komplexet kapja, hogy közvetítse a glikolízishez való elmozdulást a növekvő sejtekben és a rákos szövetekben 40. A tüdőrákos sejtekben megfigyelt NDUFA4 túlzott expressziója ellentétben áll az Alzheimer-kór lefelé történő szabályozásával. Egy korábbi teljes genomvizsgálat szerint az NDUFA4 összefügg az Alzheimer-kórral, és a betegség potenciális biomarkerként azonosították 41. Az ubiquinol citokróm c reduktázt kötő fehérje (UQCRB) fontos a mitokondriális komplex III stabilitása, az elektron transzport, a sejt oxigénérzékelés és az angiogenezis szempontjából. Az NDUFA, a COX7C és az UQCRB részt vesz a mitokondriális légzőszervi láncban, és mind a hármat nem szabályozták OCD-ben szenvedő betegeknél. A mitokondriális diszfunkció és az OCD kapcsolatáról azonban korlátozott ismeretek állnak rendelkezésre.

A 2. típusú forró ízű receptorokat kódoló géneket (TAS2R30 és TAS2R46) az OCD-ben fokozottan szabályozták. A TAS2R-ek széles körben expresszálódnak az agyon kívül, de kapcsolatuk az OCD-vel nem ismert.

A CACNB4 egyike a feszültség által vezérelt feszültség által vezérelt béta csatorna alegységeknek, amelyekről a közelmúltban kiderült, hogy működnek az idegsejtek ingerelhetőségében és a génátírásban 42. A CACNB4 túlzottan expresszálódott skizofrénia esetén, és a gerincvelő képződését és stabilizálását szabályozó kalciumáramok depressziójával társult, és a fokozott CACNB4 expresszió alacsony gerincveszteséghez vezetett 43. Feltételezik, hogy a tanulmányunkban talált CACNB4 upregulációja összefüggésben lehet az OCD patogenezisével.

Vizsgálatunkban néhány korlátozást kell megjegyezni. Először is, a minta mérete viszonylag kicsi volt, ami csökkentheti az OCD és az egészséges kontrollok közötti génexpresszió összehasonlításának statisztikai erejét. A génváltozások irányában eltérések voltak a mikroarray elemzés és a qRT-PCR validálás között, valószínűleg azért, mert az érvényesítéshez különböző mintákat használtak, és a betegek a rendellenesség különböző stádiumaiban és különböző kezelési rendekben voltak.

Végül megváltozott gén-expressziós mintákat találtunk OCD-s betegeknél, és hangsúlyoztuk az RP-gének szerepét az OCD patogenezisében.

Anyagok és metódusok

Résztvevői profilok

Ezt a vizsgálatot a Wuxi Mentálhigiénés Központban végezték a Nanjing Orvostudományi Egyetemen, Wuxi, Jiangsu tartomány, Kína. Harminc OCD-s beteget és 30 szexuális és életkor-egészséges kontrollt vettek fel. Mindkét csoportban 20 férfi és 10 nő volt. A betegek és a kontrollcsoport átlagéletkora 28,8 ± 12,0 év (15–60 év közötti tartomány) és 28,8 ± 11,1 év (17–56 év közötti) volt. Az OCD diagnózisát strukturált klinikai interjúval igazolták a DSM-IV rendellenességekről (SCID). Skizofrénia, MDD, komorbid I. tengely rendellenesség vagy anamnézisében neurológiai betegségben szenvedő betegeket kizárták. Egészséges, pszichiátriai betegségektől és súlyos egészségi állapottól mentes ellenőrzéseket a helyi közösség kapott.

Ezt a tanulmányt a Wuxi Mentális Egészségügyi Központ Humánetikai Bizottsága hagyta jóvá a Nanjing Orvostudományi Egyetemen. Minden résztvevő írásos tájékozott beleegyezést adott. Minden vizsgálati eljárás összhangban volt az 1975-ös helsinki nyilatkozattal.

Vérminta és PBMC izolálás

A perifériás vért 10 ml EDTA-t tartalmazó vakutainer csövekbe gyűjtöttük, és azonnal 4 ° C-on tároltuk. A teljes vért a gyűjtéstől számított 2 órán belül feldolgoztuk.

A perifériás vér mononukleáris sejtjeinek (PBMC) szétválasztására Ficoll-sűrűség-gradiens centrifugálást alkalmaztunk. Röviden: a sóoldattal hígított vért rétegeztük a Ficoll-on keresztül, majd centrifugáltuk a vörösvérsejtek, a PBMC-k és a plazma elválasztására. A PBMC-ket óvatosan és teljesen leszívtuk a Ficoll rétegből, és új csőbe helyeztük, amelyet kétszer mostunk.

A teljes RNS izolálása

Az összes RNS-t a PBMC-kből TRIzol reagenssel (Invitrogen, USA) extraháltuk a gyártó utasításai szerint, és a NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific) alkalmazásával számszerűsítettük. Az RNS integritását (RIN) egy Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) alkalmazásával értékeltük.

Az átlagos (SD) RIN az összes minta esetében 9,29 (0,48). A 28S és 18S rRNS aránya 2,79 (0,35), a RIN pedig ≥7. A 28S: 18S esetében a 0,7-nél nagyobb RIN-értéket a gyártó utasításai szerint az elfogadható RNS-minőségen belül tartották.

mRNS mikroray, jelölés, hibridizáció és szkennelés

A teljes RNS-t komplett mRNS-sel és Hyb Kit-kel (Agilent Technologies) jelöltük, és hibridizáltuk humán lncRNS Microarray 4-gyel, 04 x 180 K (Agilent Technologies). A mikrochip 30 656 próbát tartalmaz az emberi mRNS-hez, amelyek mindegyike hiteles adatbázisokból származott, beleértve a RefSeq Build, Ensemble Release, GenBank és Unigene Build. A teljes RNS-t (egyenként 200 ng) reverz átírjuk kettős szálú cDNS-be, majd szintetizáljuk cRNS-be és cianin-3-CTP-nek jelöljük. A jelölt cRNS-eket hibridizáltuk egy mikroarray-vel. Mosás után a forgácsokat egy Agilent Microarray Scanner (G2505C, Agilent Technologies) segítségével szkennelték be.

Validálás qRT-PCR-rel

Teljes RNS-t izoláltunk PBMC-ből további 26 pár OCD és egészséges kontrollból TRIzol reagens (Invitrogen) alkalmazásával, DNase I oszlopkezeléssel, a gyártó leírása szerint. A cDNS-t nagy kapacitású RNS-cDNS készlet (Invitrogen) segítségével szintetizáltuk a gyártó utasításainak megfelelően. A QRT-PCR-eket a 4. táblázatban felsorolt ​​primerek és a SYBR® Select Master Mix (Invitrogen) felhasználásával hajtottuk végre egy 7900HT valós idejű PCR gépen (Applied Biosystems, USA) a következő ciklusokkal: 2 perc 50 ° C-on, 2 perc 95 ° C, majd 40 ciklus 15 másodpercig 95 ° C-on, 60 másodperc 60 ° C-on, majd standard disszociációs protokoll követi annak biztosítását, hogy minden amplikon egyetlen termék legyen. Minden kvantifikációt normalizáltunk ACTB-re. A QRT-PCR-eket három párhuzamosan végeztük minden független minta esetében.

Asztal teljes méretben

Adatelemzés

Az Agilent Feature Extraction szoftvert (10.7.1.1 verzió; Agilent Technologies) alkalmazták a képképek elemzéséhez nyers adatok megszerzéséhez. A nyers adatok elemzéséhez a GeneSpring-t (GX v11.5.1; Agilent Technologies szoftvercsomag) használtuk. A nyers adatokat először kvantilis algoritmus segítségével normalizálták, majd differenciál expressziós elemzést végeztek egy hallgatói t-teszttel. A további adatok elemzéséhez azokat a szondákat választottuk ki, amelyek a 2 állapotból legalább 1-nél jelentkeztek, és a "P" -ben 75% -os tünetek voltak. A differenciálisan expresszált géneket a hajtásváltozás, valamint a hallgató t-tesztje alapján kiszámított p-érték alapján azonosítottuk. A felfelé és lefelé szabályozott gének küszöbértéke ≥ 1, 5-szeres változás volt, és a hamis felfedezési arány ≤ 0,05.

Az OCD betegek és az egészséges kontrollok közötti MRNA expressziós szinteket Mann-Whitney U assay segítségével elemeztük.

A differenciálisan expresszált mRNS-ek és a biológiai folyamatok közötti korrelációhoz az mRNS-eket GO kifejezések és KEGG útvonalak segítségével (//www.genome.ad.jp/kegg/) használtuk, hogy meghatározzuk lehetséges szerepeiket. Ezután hierarchikus klaszteranalízist végeztünk az OCD és az egészséges csoportok közötti megkülönböztethető gén expressziós minták bemutatására. Minél alacsonyabb a p értéke, annál jelentősebb a korreláció; az ajánlott p-értékhatár 0,05 volt.

Az adatok elérhetősége

Az összes mikrorajz adatot az NIH Nemzeti Biotechnológiai Információs Központjának Gene Expression Omnibus-jában (GEO) tároltuk, GSE78104 sorszám alatt.

köszönöm

Őszintén köszönjük a betegek és egészséges önkéntesek részvételét, valamint a mintagyűjtésben részt vevő egészségügyi személyzetnek. Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Tudományos Alapítvány (81101008) és a Jiangsu tartományi Nemzeti Tudományos Alapítvány (13K2012546) támogatta.

Hozzászólások

Megjegyzés beküldésével vállalja, hogy betartja Általános Szerződési Feltételeinket és közösségi irányelveinket. Ha ezt sértő cselekedetnek találja, amely nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.