elemeket

Ez a cikk frissült

absztrakt

Az elhízás elérte a járvány világméretét, és évente legalább 2,8 millió ember hal meg túlsúly vagy elhízás miatt (WHO). Az elhízás az inzulinrezisztencia, a szív- és érrendszeri betegségek és a 2-es típusú cukorbetegség (T2D) fő kockázati tényezője is 1. A T2D-ben szenvedő betegek általában hiperglikémiásak és olyan szövődményektől szenvednek, mint a magas vérnyomás, agyvérzés, az érelmeszesedés és a rák 2. Az elhízást csökkentő stratégiák ígéretet tesznek a halálozás csökkentésére és az érintett emberek életminőségének javítására.

Kimutattuk, hogy a bilirubin szisztémás beadása növeli az inzulinérzékenységet azáltal, hogy elnyomja az ER stresszt és a gyulladást DIO egerekben 35. Kiterjesztettük ezeket a megfigyeléseket annak megvizsgálására, hogy a bilirubin szabályozza-e a lipid-anyagcserét, amint azt a Gilbert-kórban szenvedő betegeknél látták 34, és hogy a bilirubin szabályozza-e a szérum adipokin szintjét a DIO egerekben. Kiértékeltük a bilirubin-kezelés hosszabb távú hatását a lipid-anyagcserére és az adipokinszintre 7 héttel a bilirubin-kezelés abbahagyása után.

az eredmény

A bilirubin beadása csökkenti a testtömeget és javítja az inzulinrezisztenciát a DIO egerekben

Asztal teljes méretben

parpák

( a ) A bilirubinnal (DIO + BR) vagy a vivőanyaggal (DIO + V) kezelt DIO egerek testsúlyának változásai a standard étrenddel etetett kontroll egerekhez képest (CHOW). ( b ) A napi éhomi vércukorszint DIO + BR, DIO + V és CHOW egerekben a bilirubin kezelés alatt. ( c ) Átlagosan 24 órás táplálékfelvétel egérenként BR vagy hordozót kapó DIO egerekben. ( d ) Intraperitoneális glükóz tolerancia (GTT) teszt DIO és CHOW egerekben a bilirubin kezelés előtt; e ) területe a GTT görbe alatt. ( f ) DIO egerek és CHOW egerek inzulin tolerancia tesztje (ITT) a bilirubin kezelés előtt; ( g ) az alapvonal alatti fordított terület a görbe felett. ( h ) GTT egerek DIO + BR, DIO + V és CHOW 14 nappal az első bilirubin injekció után; én ) görbe alatti területe. ( j ) ITT egerek DIO + BR, DIO + V és CHOW 14 nappal az első bilirubin injekció után; ( k ) fordítsa meg az alapvonal alatti területet a görbe felett. Legalább 6-8 egeret vettünk fel minden csoportba; ** o

a ) DIO + BR, DIO + V és CHOW egerek májsúlya. ( b ) Mellékhízó tömeg DIO + BR, DIO + V és CHOW egerekben. ( c ) frakciói a sac régióban a DIO + BR, DIO + V vagy CHOW egerek májában. ( d ) A DIO + BR, DIO + V vagy CHOW epididymális zsírsejtek zsírbuborék-átmérője (μm). ( e ) DIO + BR, DIO + V és CHOW egerek májszelvényeinek és zsírszövetének H&E festését reprezentatív fotomikrográfiák. Méret = 200 μm. Legalább 3 egeret elemeztek minden csoportban; * o

TC szérumszint ( a ), LDL ( b ), HDL ( c ), TG ( d ), leptin ( e ), adiponektin ( f ), teljes bilirubin g ) és a közvetlen bilirubin ( h ) DIO + BR, DIO + V vagy CHOW egerekben mértük a szérumot közvetlenül a bilirubin kezelés leállítása után. Minden csoport 3-4 egeret tartalmazott; Az adatok átlag ± szórás; *** o

Az inzulinreceptor mRNS (Insr) relatív expressziója ( a ), SREBP-1 ( b ), Fasn ( c ) és az ACC ( d ) a DIO + BR, DIO + V és CHOW egerek májában, RT-PCR analízissel mérve. Az értékek a célgén relatív expresszióját képviselik az endogén kontroll expressziójához viszonyítva. ( e ) PPARγ és C/EBPa fehérje expressziója a májban DIO + BR, DIO + V és CHOW egerekből Western blot analízissel. A géleket ugyanazon kísérleti körülmények között hajtottuk végre, és a levágott foltokat mutatjuk be. ( f ) A PPARγ fehérje és ( g ) C/EBPa a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) kontroll (NIH ImageJ szoftver) tekintetében. 3 egyedi egérből vett mintákat elemeztünk. Az adatok átlag ± szórás; *** o

( a ) DIO + BR, DIO + V és CHOW egerek testsúlya a 9 hetes kísérlet során. ( b ) Szérum glükózszint DIO + BR, DIO + V és CHOW egerekben a 9 hetes kísérlet során. Máj ( c ) és az epididymális zsírtömegek ( d ) a kezelés befejezése után 7 héttel mérve. ( e ) (balra) GTT DIO egerek a kezelés befejezése után 7 héttel mértek; az alapvonal feletti görbe alatti terület (jobbra) értékei; ( f ) (balra) az ITT DIO egerek a kezelés befejezése után 7 héttel mértek; (jobbra) a fordított régió értékei az alapvonal alatti görbe felett. Legalább 3 egeret vettünk fel minden csoportba. Az adatok átlag ± szórás; *** o

A vizsgálat legfontosabb megállapítása az, hogy a bilirubin-kezelés csökkentette a teljes koleszterinszintet a DIO egerekben. A csökkenés oka lehet a HDL és az LDL szintjének változása, bár ezen elemek csökkenése nem érte el a statisztikai szignifikanciát. Ezek a megállapítások összhangban vannak a Gilbert-szindrómában szenvedő egyének megfigyeléseivel, amelyekben a kissé megnövekedett bilirubinszint társul az összkoleszterin-, az LDL- és a trigliceridszint csökkenéséhez, valamint a gyulladáscsökkentő állapot csökkenéséhez és az oxidatív körülmények csökkent expozíciójához 31, 34, 37, 38, 39. Noha a bilirubinnal kezelt egereknél 14 nappal a bilirubin-kezelés után nem észleltek változást a trigliceridszintben, a kezelés után 7 héttel csökkenést figyeltek meg, ami arra utal, hogy a bilirubin trigliceridszintre gyakorolt ​​hatása késleltethető. Vizsgálatunk bizonyítékot szolgáltatott arra, hogy az exogén módon beadott bilirubin az elhízott egereknél megváltozott lipidprofilhoz kapcsolódik.

Megállapítottuk, hogy a bilirubin beadása jelentősen csökkentette a leptin szintjét a DIO egerekben. A bilirubinnal kezelt DIO egerek táplálékfelvétele nem látszott tényezőnek a bilirubin kezelés alatt, és a kezelés abbahagyása után nem figyeltek meg különbséget az étkezésben. A bilirubinnal kezelt egerek leptinszintjének csökkenése a zsírszövet csökkenésének tudható be, amelyet a csökkent SREBP-1 expresszió támaszt alá. A másik két megfigyelés releváns: a leptinről ismert, hogy a TNF-α 40 szabályozásával fokozza a gyulladást, és a bilirubin-kezelés csökkenti a TNF-α expresszióját DIO egerekben 35. Ezért ésszerű feltételezni, hogy a bilirubin elhízásra gyakorolt ​​hatása a megváltozott lipidszintézisnek, csökkent leptinszintnek és csökkent TNF-α termelésnek köszönhető. Meg kell vizsgálni a bilirubin klinikai jelentőségét, mint a lipidszintézis csökkentésének lehetséges kezelését, amint azt az emberi vizsgálatok 34 .

Amint azt más, 43, 44 kutató is beszámolt róla, azt találtuk, hogy a DIO egerek teljes és közvetlen bilirubinszintet mutattak, mint a Chow kontrollok vagy az exogén bilirubinnal kezelt DIO egerek. A DIO állatokban a megemelkedett bilirubin tükrözheti a bilirubin szekréciójának blokkolását ezen egerek májfunkciójának károsodása miatt. A bilirubinszint csökkentésének egyik lehetséges magyarázata a bilirubinnal kezelt DIO egerekben az, hogy a csökkenés oka lehet az exogén bilirubin P450-szabályozó képessége. A P450-ek a hem-tartalmú monooxigenáz-enzimek szupercsaládjai, amelyek mind endogén, mind exogén eredetű vegyületek sokféle anyagát metabolizálják. Vizsgálatok kimutatták, hogy a P450 két különböző izoformája, a CTP1A1 és a CYP1A2 közvetíti a bilirubin lebomlásának alternatív útját 45, 46, 47. Ezenkívül a bilirubin közvetlenül szabályozhatja a CYP1A1 enzim aktivitását egy aril-szénhidrát receptor 48 függő módon, ezáltal elősegítve a bilirubin szekrécióját. Így lehetségesnek tűnik, hogy ez a mechanizmus javítja a bilirubin szekréciót (és így alacsonyabb bilirubin szintet önmagában a DIO-hoz képest) exogén bilirubinnal kezelt DIO egereinkben. Ennek a hipotézisnek az igazolásához további tanulmányokra lesz szükség a jelenlegi kéziraton túl.

Ebben a tanulmányban azt találtuk, hogy a rövid távú bilirubin-kezelés az összkoleszterinszint csökkenésével, valamint a PPARγ és az adipokinek növekedésével járt. Ezek az eredmények mechanisztikus bizonyítékokat szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy a bilirubin vagy a megváltozott bilirubin metabolizmus (pl. UGT1A1 49 parciális inhibitorok) hasznosak lehetnek terápiás megközelítésként az elhízás csökkentésére, az inzulinrezisztencia és a glükóz tolerancia javítására.

mód

A hím C57BL/6 egereket (6 hetesek) a Kínai Tudományos Akadémia Genetikai és Fejlődésbiológiai Intézetéből (Peking, Kína) vásároltuk. Az egereket vagy magas zsírtartalmú étrenddel (1. táblázat), vagy standard CHOW-zsíros étrendet (10% kalória a zsírból) táplálták 24 hétig a kezelés előtt. A Qingdao Mezőgazdasági Egyetem Állatgondozási Bizottsága minden állatkísérletet jóváhagyott. A módszereket a jóváhagyott irányelveknek megfelelően hajtottuk végre.

Bilirubin előállítása és beadása

A bilirubint (Frontier Scientific, Logan, UT) 0,1 N NaOH-ban oldottuk, és a pH-t HCl-re állítottuk 7,4-re. A bilirubint intraperitoneálisan adták 20 μmol/kg (11,7 mg/kg) adagban naponta kétszer, 14 napig. A DIO vagy CHOW kontroll egerek vivőanyagot kaptak ugyanabban az injekcióban.

Az egerek monitorozása a kezelés után

Az éhomi vércukorszintet és az egerek testtömegét naponta 9: 00-kor mértük. Az egér farka végének minimális farokrészéből egy csepp teljes vért (kb. 5-10 μl) vettünk, és egy Sannuo glükométerrel (San Nuo Inc., Changsha, Kína) elemeztük. Az egerek fizikai aktivitását (beleértve a viselkedést, a táplálékfelvételt, az ivást és a nyalást) naponta figyelték meg, a 35. szakaszban leírtak szerint. A táplálékfelvételt (a kiömlés nélkül) a kezelés után 7 napig 24 órán át, a bilirubin-kezelés után hetente 7 hétig mértük.

Intraperitoneális glükóz tolerancia (IPGTT) és inzulin tolerancia teszt (ITT)

Az IPGTT esetében az egereket egy éjszakán át éheztettük, majd 2 g/kg glükózoldattal (ip) injektáltuk őket. Az ITT esetében az egereket 5 órán át éheztettük, majd 0,75 E/kg inzulint injektáltunk (ip; Eli Lili, Indianapolis, IN). A szérum glükózszintet 0, 15, 30, 60, 90 és 120 perccel mértük glükóz vagy inzulin injekció után.

Szövetgyűjtés, szérumkészítés és vérbiokémia

Minden kísérlet végén az egereket altattuk, és a retorbitális vérzéssel heparinált csőbe vettük a vért. A plazmát centrifugálással nyertük, és további elemzés céljából -80 ° C-on tároltuk. Ezután az egereket feláldoztuk, a májat és az epididymális zsírszöveteket elválasztottuk, lemértük és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk későbbi elemzés céljából. A szérum TC, TG, HDL, LDL és bilirubin szintjét specifikus reagenskészletek (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO) alkalmazásával mértük. A leptin, inzulin és adiponektin szintjét ELISA módszerrel mértük (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Valós idejű (RT) -PCR elemzés

Az inzulinreceptor, a leptinreceptor, az apolipoprotein A-IV (Apoa4) és az SREBP-1 expresszióját a májban RT-PCR analízissel számszerűsítettük, a fentiek szerint 50. Az aktin β expresszióját minden mintában RT-PCR-rel számszerűsítettük, és endogén kontrollként használtuk. A valós idejű RT-PCR primereket a Life Technologies-től (Invitrogen Trading Co., Ltd., Shanghai, Kína) vásároltuk.

Western blot elemzés

A teljes sejtlizátumok fehérjetartalmát BCA vizsgálattal számszerűsítettük, és mindegyik mintából 30 μg fehérjét elválasztottunk egy 4-12% Bis-Tris gélen (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Kína). A fehérjéket egy Hybond-P membránra (GE health, Piscataway, NJ) vittük át, 5% zsírmentes tejjel blokkoltuk, és a következő primer antitestekkel inkubáltuk: PPARγ, C/EBPa (Abcam, USA) és GAPDH (Santa Cruz Biotechnology Inc.). (USA), éjszakán át 4 ° C-on. A blotokat torma-peroxidázzal jelölt másodlagos antitestekkel (Sangon Biotech Ltd., Shanghai, Kína) 45 percig szobahőmérsékleten szondáztuk, és ECL detektáló készlet segítségével (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Egyesült Királyság). Az egyes jelek erősségét Image J (NIH) szoftverrel határoztuk meg.

Hematoxilin és eozin festés (H&E)

Az egér májának és az epididymális zsírnak immunhisztokémiáját a leírtak szerint végeztük 35. Röviden: a máj vagy a zsírszövet szakaszait egy éjszakán át fixáltuk 10% pufferolt formalinban, paraffinba ágyazva és metszettük. A tárgylemezeket 6 percig szűrt hematoxilinbe merítjük, vízzel leöblítjük és további 1-2 percig Eosinnal festjük. A metszeteket vízzel öblítettük és növekvő alkoholtartalmú oldatokban dehidratáltuk, xilollal megtisztítottuk és fedőlappal helyeztük a címkézett tárgylemezre. A tárgylemezeket kettős felhasználású Olympus BX51 mikroszkóppal (Olympus, Tokió, Japán) vizsgáltuk, és a képeket Olympus DP72 digitális fényképezőgéppel rögzítettük. A vakcina területét a májszövet teljes területén Image-Pro Plus analitikai szoftverrel határoztuk meg a májban. Az egyes zsírsejtek átlagát (n = 75 minden csoportban) CellSens Standard szoftverrel (Olympus) mértük.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SD-ként fejezzük ki. A két csoport közötti különbségeket statisztikai szignifikancia szempontjából összehasonlítottuk Bonferroni-korrekcióval végzett nem párosított Student-féle t tesztekkel. A különbségeket akkor tekintettük jelentősnek, amikor p