elemeket

absztrakt

A málna (Rubus ideaus L.) finom gyümölcs, rendkívül rövid eltarthatósággal. Az egészséget elősegítő vegyületek, például az antocianinok gazdag forrása. A gyümölcs minőségének gyors csökkenése jellemzően a bomlás és a fiziológiai lebomlás következtében következik be, amely a membrán integritásának elvesztésével jár, ami az öregedés és a stressz előrehaladásához vezet. 1 A foszfolipáz D (PLD), a foszfolipideket lebontó enzim, kulcsfontosságú enzim a katabolikus események kaszkádjának elindításában, amelyek esetleges membránkárosodáshoz vezetnek, és nagyon aktív más bogyók, például eper gyümölcseiben. 2, 3

A betakarítás utáni tartósság növelésére megfelelő technológiák és módszerek magasak. A hexanal készítményként történő alkalmazása a betakarítás előtt vagy után ígéretes eredményeket hozott számos gyümölcs, zöldség és virág eltarthatóságának növelésében. 4., 5., 6. A gyümölcslágyulás biokémiai és genetikai vizsgálatai kimutatták, hogy a sejtfal-feldolgozás számos, a sejtfal anyagcseréjéhez kapcsolódó fehérjéket kódoló géncsalád - beleértve az expanzinokat, a pektin-metil-észterázokat, a poligalakturonázokat, a pektát-liázokat β-galaktozidázt - összehangolt expressziójából adódik. αL-arabozidáz endo- (1,4) -β-D-glükanázok, p-xilozidázok, xiloglükanázok, endotranszglükozidázok, endo-mannanázok. 7, 8, 9, 10, 11 A sejtfalat lebontó enzimek génsebészeti úton történő expressziójának gátlására tett erőfeszítések azonban nem hoztak kielégítő eredményeket a gyümölcs megpuhulásának hatékony megakadályozására. 12, 13

A kalciumkötő fehérjék közül az anneksinek olyan szerkezeti rokon fehérjék családját alkotják, amelyek kalciumfüggő foszfolipid kötődést mutatnak. Az anneksinok olyan oldható fehérjék, amelyek képesek megkötni a Ca 2+ -ot, vagy függetlenül kapcsolódhatnak a membrán foszfolipidjeihez. A genomszekvenálás azt mutatta, hogy a növények anszeksinjai egy kis, több tagú multigének csoportját tartalmazzák, nyolcat az Arabidopsis thaliana 28 csoportban és kilencet az Oryza sativa csoportban. Bizonyos ancexinok fokozott expressziója specifikus fejlődési vagy környezeti problémákban a Ca 2+ szignálhoz társul a noduláció során, 30 ABA 31, 32 reakció vagy hideg akklimatizáció során. Annak lehetősége, hogy az ancexinok Ca 2+ csatornákat képeznek, a gyökérszőrökben és a gyökér kiterjesztési zónában való jelenlétükkel együtt, szerepet játszik a megnövekedett citoplazmatikus kalciumkoncentráció ([Ca 2+] cyt) előállításában, amely a csúcs növekedéséhez vagy megnyúlásához szükséges. A növényi anneksinekről kiderült, hogy in vitro ATPáz és GTPáz aktivitással rendelkeznek. 22, 34 Az AtANN1-et in vitro ATP-kötő fehérjeként azonosították. 35

Korábbi tanulmányunk elemezte a hexanal hatását számos olyan gén relatív transzkripciós szintjére, amelyek valószínűleg összefüggenek az eper sejtfalát lebontó enzimjeivel. 36 Ebben a tanulmányban arról számolunk be, hogy a hexanal hatásmechanizmusa késik a membrán károsodásának késleltetésében és az eltarthatósági idő meghosszabbításában multidiszciplináris megközelítések alkalmazásával, beleértve a fiziológiai, szövettani és biokémiai jellemzést. A három foszfolipáz-D-gén, öt aneksiin-géntag és négy kalmodulin-kötő transzkripciós aktivátor expressziós mintázatát qRT-PCR-rel számszerűsítettük a gyümölcsfejlődés és az érés során, válaszként a hexanális alkalmazásra. A kezelt és kezeletlen gyümölcsök szerkezeti és összetételi részleteinek elemzésére pásztázó elektronmikroszkópiát, valamint energiadiszperzív röntgenspektrometriát végeztünk. Ezenkívül a foszfolipáz D aktivitást teszteltük a gyümölcs kifejlődése során és hat nappal a betakarítás után a hexanal alkalmazás után.

az eredmény

Fizikai-kémiai tulajdonságok

A hexanal gyümölcsminőségre gyakorolt ​​hatását és a málna gyümölcs tartóssági tulajdonságait meghatározó élettani paramétereket az 1. táblázat mutatja be. A várakozásoknak megfelelően a TSS növekedett, amikor a gyümölcs éretté vált és az egész tárolási időszak alatt, mind a kezelt, mind a kezeletlen gyümölcsök között (1. táblázat ). ). A TA azonban a betakarításkor viszonylag magasabb volt, és az előzetes tárolással fokozatosan csökkent. A statisztikai elemzés nem mutatta a hexanális alkalmazások szignifikáns hatását a TA-ra vagy a TSS-re. A 6 napos tárolási időszak alatt a súlycsökkenés mértéke a kezelt gyümölcsben a betakarítást követő második és harmadik nap után szignifikánsan alacsonyabb volt, majd a hátralévő tárolási időszakban hasonló arányra tért vissza a kezelt és a kontroll gyümölcsökben (1. táblázat) . Annak ellenére, hogy a hexanal a magzati súlycsökkenésre gyakorolt ​​kismértékű hatást gyakorolt, a tárolás során a teljes fogyás a kezeletlen gyümölcsöknél 30,2% volt, míg a kezelt gyümölcsöké 25,9% (1. táblázat).

Asztal teljes méretben

A gyümölcs szívóerejét, a bogyó tartályból való eltávolításához szükséges húzóerőt megmértük és a gyümölcs megpuhulásának jelzőjeként alkalmaztuk. A hexanal alkalmazása szignifikánsan megnövelte a kezelt bogyók szakítószilárdságát a kontrollhoz képest (2. ábra). Az összes gyümölcs húzószilárdságának folyamatos csökkenését mutatta a 20 ° C-os későbbi tárolás során, de a veszteség mértéke a kezelt gyümölcsöknél szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a tárolás első 4 napjának kontrollja. A betakarítás utáni első négy nap során a gyümölcsnek szignifikánsan nagyobb erőre volt szüksége a gyümölcs eltávolításához a tartályból (1, 96–1, 49 N) a kontrollhoz képest (1, 76–0, 98 N ) (Asztal 1). A begyűjtést követő két napban nem tapasztaltak szignifikáns különbséget. Terepi körülmények között nagyon megfigyelhető volt, hogy a kontrollgyümölcsök a földre hullottak, míg a kezelt hexanal csatolt állapotban maradt, és még mindig minimális erőt igényelt a tartályoktól (1. kiegészítő ábra).

gátlása

Szakítószilárdság a kontrollban és a hexanallal kezelt (HC) málnában a betakarítás után hat napig. Mindegyik érték a húzóerő átlagának huszonöt mérését jelenti, amely a tartályok gyümölcséből történő eltávolításához szükséges. A csillagok jelentős különbségeket jeleznek a kontroll és a hexanal kezelés között azonos tárolási idő alatt (P = 0,05).

Teljes méretű kép

Pásztázó elektronmikroszkóp (SEM) elemzést végeztek a hexanális alkalmazás és a fokozott gyümölcs visszatartás közötti összefüggés alapjául szolgáló mechanizmusok jobb megértése érdekében. Ez az elemzés az epidermális szőrök bőséges felhalmozódását mutatta a kezelt gyümölcsedények csúcsán, míg a kezeletlen állat hegyén nem észleltek epidermális szőrszálakat (3. ábra). Az epidermális szőr hasonló mennyiségben volt jelen a kezelt és ellenőrzött gyümölcstartályok alapján.

A málnaedények szövettani megfigyelései SEM analízissel. ( a, c a e ) ellenőrzést jelentenek, míg ( b, d a f ) hexanallal (HC) kezelt gyümölcsöt jelentenek. ( e a f ): a kezelt hexanalon bőséges hámréteget mutató tartályok csúcsa nagyobb ( f ), epidermális szőrzetet nem észleltek a kontroll gyümölcstartályokban ( e ). A skála 500 μm.

Teljes méretű kép

A gén expresszióját hexanal módosította

Három foszfolipáz-D-gén, öt aneksin-gén és négy kalmodulin-kötő transzkripciós aktivátor expressziós mintázatát számszerűsítettük a gyümölcsfejlődés és az érés során a hexanális alkalmazásra adott válaszként. Az aneksin csoport öt tagja a transzkriptum szintjének folyamatos növekedését mutatta a gyümölcs fejlődésének minden szakaszában. (4a - e ábrák). Az összes annexin gén ugyanazt a tendenciát mutatta, nagyobb méretben Ann2 és Ann5 esetében. Ez a minta gyakori volt a kezelt és kezeletlen magzatok között, de a hexanal szignifikánsan növelte az Ann3 transzkriptum szintjét a fejlődés középső és késői szakaszában (4c. Ábra). A kalmodulinhoz kötődő transzkripciós aktivátor négy tagjának expressziós adatainak elemzése azt mutatta, hogy transzkriptumszintjük a gyümölcsfejlődés középső szakaszában érte el a csúcspontját, majd csökkent (4f-i. Ábra). A hexánnal kezelt gyümölcsök nem mutattak választ, kivéve a közép- és késői stádiumú cAMTA3 és a késői stádiumú cAMTA5 szignifikánsan magasabb növekedését (4g. És i. Ábra).

Az aneksiin gén öt tagjának qRT-PCR-rel mért transzkripciós expressziós mintája ( a - e ), négy kalmodulin-kötő transzkripciós aktivátor ( f - én ) és három foszfolipáz D gén ( j - l ) a málna gyümölcs fejlődése során. Az expressziót három hazai génhez (His3, GPDH és Actin) viszonyítva határoztuk meg. Az adatok négy biológiai ismétlés átlagát (± szórás, sd) képviselik, mindegyik három technikai ismétléssel. A kontroll (Cont) és a hexanal (HC) statisztikailag szignifikáns különbségeket mutatnak a gyümölcs fejlődésének azonos szakaszában (*) a valószínűségi szintek (P

A hexanális alkalmazások megváltoztatták a málna gyümölcs érésében szerepet játszó több gén transzkriptumszintjét. Az átiratokat qRT-PCR-rel értékeltük az öt aneksin géntag ( a - e ), négy kalmodulin-kötő transzkripciós aktivátor ( f - én ) és három foszfolipáz D gén ( j - l ) a begyűjtést követően hat napig. Az összes gyümölcsöt 20 ° C-on tároltuk a mintavételig. Az adatok négy biológiai replikátum átlagát (± sd) képviselik, mindegyik három technikai ismétléssel rendelkezik. Az expressziós adatokat három fenntartó gén (His3, GAPDH és Actin) segítségével normalizáltuk. A kontroll (Cont) és a hexanal (HC) statisztikailag szignifikáns különbségeket a gyűjtés után ugyanazon a napon (*) és (**) jelzik a valószínűségi szintek (P

A málna csonthéjasok szerkezeti megfigyelései SEM-EDS analízissel. A hexanallal kezelt gyümölcspépek epidermális szőrének összehasonlítása ( a ) és az ellenőrző gyümölcsök ( b ) fejlődésük középső szakaszában. ( c ) nagyobb, nagyított képet mutat a kezelt részeg epidermális szőrszálaknál megfigyelt erősen lokalizált kristálylerakódási szerkezetekről. d ) az eredeti EVS elemzési spektrum grafikonjaiból generált adatok kimenetét jeleníti meg. Mindegyik érték tizenkét minta átlagát jelenti. Az EDS-elemzést kezeletlen gyümölcsön (kontroll), HC- ( d ): lerakódási szerkezetű hexanállal kezeljük, HC-ND: hexanállal kezeljük a nem kristályos régióban. A csillagok jelentős eltéréseket jeleznek a kalciumszintben (P ⩽ 0, 01).

Teljes méretű kép

SEM elemzés, amely bemutatja a málna gyümölcscsontok belső szerkezetét. a) ab ): kontroll gyümölcs, c a d ): hexanallal kezelt gyümölcs. A képeket közepes stádiumú magzatokban készítették. A hexanális alkalmazás miatt a gyümölcsök belső felépítésében nem tapasztaltunk különbséget. A vetőmagok és a csonthéjak közötti helyzetek az ábrákon láthatók ( ac ).

Teljes méretű kép

Összefoglalva, a hexanal hatása a gyümölcsszerkezet változására a fejlődési stádiumtól függött, és kizárólag az exocarpáktól és az epidermális szőrtől függ.

A PLD aktivitásának változásai a gyümölcs kifejlődése alatt és után

A hexanal potenciális szerepének értékeléséhez a foszfolipáz D gátlásában és az eltarthatóság meghosszabbításában a PLD aktivitást teszteltük a málna gyümölcsének különböző szakaszaiban. Ebben a kolorimetriás vizsgálatban a foszfatidil-kolint kolinná alakítja a PLD, ahol a kolint ezután a kolin-oxidáz oxidálja. A színezett reakciótermék intenzitása egyenesen arányos a minta PLD aktivitásával.

A gyümölcsvisszatartás növekedésének magyarázatának egy részét SEM-elemzéssel találták meg, amely a kezelt gyümölcstartályok hegyén rengeteg epidermális szőrt mutat, ezáltal növelve a gyümölcs és tartályai közötti kapcsolatot, ezáltal növelve a gyümölcstartály eltávolításához szükséges erőt. .

Megállapították, hogy a kalodulinoknak nevezett kalcium-érzékeny fehérjék szabályozzák a paradicsom megnagyobbodását és érését. 50, 51 Yang és munkatársai tanulmányának egyik fontos megállapítása. 51 szerint a kalmodulin gének elnyomása kritikus lehet az etilénfüggetlen érlelési folyamat megindításához. Ebben a tanulmányban a három kalmodulin-kötő transzkripciós aktivátor (cAMTA1, cAMTA4 és cAMTA5) expresszióját eltérően megváltoztatták a hexanális alkalmazásra adott válaszként, ami fokozza a hexanal potenciális hatásának nyomát a kalcium-kötő fehérjékre, amelyek jelző szenzorként működnek.

Vizsgálataink egyértelmű összefüggést mutatnak a PLD aktivitás és a PLD gén expresszió között a málna gyümölcsének fejlődésének különböző szakaszaiban, valamint a tárolás során is. Hasonló elemzést végeztek normál és antiszensz PLD alkalmazásával a „Celebrity” paradicsomban. Ezek az eredmények meggyőzően azt mutatták, hogy a PLD expresszió csökkent a gyümölcs érése során az antiszensz PLD alfa cDNS bevezetésével a „Celebrity” paradicsomban. A hexanális kezelés a PLD-aktivitás egyértelmű gátlását okozta a málna gyümölcsében, hasonlóan a paradicsom antiszensz PLD-vonalaihoz, amelyek csökkent PLD-aktivitást mutattak. Ugyanebben a jelentésben kiderült, hogy az eper gyümölcsmembránjaiban lévő mikroszómális PLD aktivitást kalcium stimulálja. Ezek az eredmények az eredményeinkkel együtt egyértelmű összefüggést mutatnak a hexanális adagolás, a sejt kalciumstimuláció és a PLD aktivitás gátlása között. Az ezzel kapcsolatos jelátviteli események teljes szekvenciája azonban további vizsgálatot igényel.

Bár úgy tűnik, hogy a málna nagyon érzékeny rendszer a hexanal alkalmazásakor, a bőr előtti hexanal-kezelés jelensége nagyon fontosnak tűnik a PLD gátlásának modulálása és az optimális hatás elérése érdekében. Például a szövettani megfigyelések azt mutatják, hogy a kalcium lerakódása csak akkor következik be, ha a gyümölcsöket a közepes fejlődési szakaszban kezelik. Misran és mtsai. A 39 azt is jelezte, hogy a gyümölcs alkalmazásának szakasza döntő, mert a PLD gátlásának csak csekély hatása van, amikor a membrán romlani kezd, és megkezdődnek a katabolikus lipid kaszkádok. Például a paradicsom gyümölcseit érett zöld fázisban kezelik, hogy a szín és az íz fejlődésében a legjobb eredményt érjék el. Mivel a bogyókat, például a cseresznyét, körülbelül 15 nappal a betakarítás előtt kell kezelni, hogy 4 ° C-on maximalizálható legyen a 30 napos eltarthatóságuk. 5

Összefoglalva: ez a munka egyértelműen megmutatta, hogy a hexanal milyen fontos szerepet játszhat a transzkriptum szintjének és a PLD aktivitásának csökkentésében, valamint néhány kalciumkötő fehérje megváltoztatásában, amelyek jelző szenzorként működnek. Így a hexanal alkalmazása kívánatos és megfelelő technológia lehet a málna eltarthatóságának növelésére a rendkívül romlandó fénybe való hajtogatás után. A kémiailag hajlamos neve ellenére a Hexanal természetes vegyület, amelyet minden növény illékony védekező mechanizmusként termel. Ez egy olyan GRAS (általában biztonságosnak tekintett) vegyület is, amelyet az FDA étrend-kiegészítőként hagyott jóvá. 52 E két tulajdonságnak enyhítenie kell a fogyasztók azon aggályait, amelyek ehető termékeken, például málnán történő felhasználáskor jelentkezhetnek. Érdekes lenne meghatározni azt is, hogy a hexanal alkalmazása miatt a kalcium felhalmozódása befolyásolja-e a gyümölcs ehető minőségét és ízét. További vizsgálatok felhasználhatók a hexanal és a sejtek közötti kalcium kölcsönhatásának biokémiai mechanizmusának megértésére a PLD általános szabályozásában a gyümölcs eltarthatóságának meghosszabbításában.