elemeket
absztrakt
A preadipocyták aktív proliferációja és differenciálódása röviddel a születés előtt és az élet első éveiben érzékeny ablakot hoz létre az 1., 2., 3. zsírfejlődéshez. Ennek eredményeként az anya étrendje és a méh környezete befolyásolhatja a zsírszövet tárolását és az ebből fakadó elhízás kockázatát. A zsírszövetet olyan fejlesztési programozásnak vetik alá, amelyben a méh expozíció tartósan befolyásolja a szöveti fenotípusokat. Az anyai étrend, az életmód és a környezeti expozíció eltérései a későbbi életkorban megnövekedett zsírbetegséggel társulnak az adipocita növekedésre és az anyagcserére gyakorolt stabil hatások révén 4, 5, 6. A zsírszövet programozása különös jelentőséggel bír a közegészségügy szempontjából, mivel az elhízás - az Egyesült Államokban és az egész világon járvány - korán kezdődik. Az Egyesült Államokban a gyermekek körülbelül 27% -a túlsúlyos vagy elhízott ötéves korában. Az elhízott gyermekek sokkal gyakrabban elhíznak, mint a felnőttek, összehasonlítva a normál 8, 9 súlyú gyermekekkel. Ezért a túlzott zsírfelhalmozódás csökkentése az élet első éveiben fontos eszköz a felnőttkori elhízás megelőzésében. Az a bizonyíték, hogy a születéskori zsírbetegség jósolja a zsírt a későbbi gyermekkorban, hangsúlyozza annak szükségességét, hogy megértsék a zsírszövet fejlődését befolyásoló prenatális tényezőket .
A madarak egy egyedülálló modellt nyújtanak, amelyben az embrióba szállított zsírsavak egy csoportja speciálisan manipulálható és tesztelhető a keltetés (azaz születés) után a zsírlerakódás szempontjából. A sárgája a legtöbb zsírsavat juttatja az embrióban lévő fejlődő szövetekhez, és a kikelés után egy-két nappal az etetés eléréséig. A sárgája zsírsavprofilja módosítható a 22, 23 tyúkok számára biztosított táplálék zsírforrással. Például az EPA-val és DHA-val dúsított kereskedelmi tojásokat úgy állítják elő, hogy a tyúk étrendjét tengeri olajokkal egészítik ki. Ezt a kapcsolatot használtuk annak a hipotézisnek a tesztelésére, hogy a halolajban (FO) táplált EPA és DHA embriódúsítás csökkenti a kölykök zsírtartalmát. A kukoricaolajat (CO) referenciaként használtuk, mivel összehasonlítható mennyiségű PUFA-t (
60%), de különösen az n-6 csoport. Az összes csirkét kikelés után CO-alapú táplálékkal etették, hogy a kísérleti manipulációt az embrionális fejlődés időszakára korlátozzák. Kimutattuk, hogy az anyai FO táplálása jelentősen csökkentette az adipozitást a kikelés után, anélkül, hogy befolyásolta volna a növekedést. Eredményeink azt sugallják, hogy az anyai étrendben lévő zsírsavak hozzájárulnak a zsírszövet fejlődésének programozásához.
az eredmény
Tojástermelés és zsírsavösszetétel csirkeszövetekből
A keltetőtojást, a tojás súlyát és a keltető csirke súlyát használták a tyúktáplálás tojásminőségre gyakorolt hatásának felmérésére, ezek egyike sem különbözött szignifikánsan a CO és FO tyúktojások között (P> 0,05). Az agyban és a májban található zsírsavakban található foszfolipidek összetételét profilizáltuk és kvalitatív módon összehasonlítottuk annak megerősítésével, hogy az EPA és a DHA gazdagodott a FO csirkék szöveteiben a CO csirkékhez képest. Az agyat és a májat a keltetéskor alkalmazott relatív súlyuk miatt használták. Az EPA-t és a DHA-t tartalmazó foszfatidilkolin (PC) fajok gazdagodási szintjeit az 1. táblázat mutatja. Az emelkedés (FO/CO) növekedése -1,2 (az agyban 18: 0/22: 6) és
130, 4 (PC 18: 4)./22: 6 a májban), több mint kétszeres dúsítással a legtöbb faj esetében. Ezek az adatok megerősítik, hogy az anyai táplálkozás zsírsavprofilja a kikeléskor megjelenő kölykök zsírsavszövet-összetételében tükröződött.
Asztal teljes méretben
A kiindulási zsírsavforrásnak a zsírszövetben kialakuló zsírsavösszetételre gyakorolt hatását GC-FID segítségével számszerűsítettük. A hasi zsírszövet teljes lipidfrakciójának zsírsavösszetételét 7 és 14 napos korban elemeztük (2. táblázat). Öt zsírsav (palmitoleinsav, γ-linolénsav, eikozénsav, eikozadiénsav és dokozadien-sav) szövetbősége az életkor előrehaladtával nőtt (P életkor 0,05). Mindkét raktár relatív súlya azonban jelentősen csökkent az FO vs. CO (P 
Az adipociták mennyisége és száma CO és FO csirkékben 7 és 14 napos korban. A CO hasi zsírszövet festékének reprezentatív képei ( A, B ) és FO ( C, D ) segítségével meghatároztuk az adipociták térfogatát 7 ( A, C ) és 14. ( B, D ) d. Méret = 40 μm. Diánként két diát és három egymástól független mezőt számoltunk minden korcsoportban három kölyökben. ( E ) Átlagos adipocita térfogat (μm 3 × 104), ± SD; ( F ) átlagos adipocita szám (X106), ± SD. A diéta, az életkor és kölcsönhatásaik (étrend × életkor) fő hatását az adipocita mennyiségére és számára az ANOVA határozta meg. Jelentős F-tesztek (P
A 7 éves CO és FO csirkék adipocita területének (μm 2) frekvenciaeloszlása A ) és 14. ( B ) d. Az adipocita területeket H&E festett képek alapján mértük, és kosárméretekre osztottuk. Az egyes cellák átlagos sejtfrekvenciáit, ± SD, bemutatjuk és összehasonlítjuk T-teszttel. * Eltér a CO-tól, a P # különbözik a CO-tól, a P-től (0,05). A máj a madarakban a de novo lipogenezis elsődleges helye (mint az embereknél) 24, és fontos szerepet játszik a brojlercsirkék 25 zsírtartalmában. Az étrend nem befolyásolta szignifikánsan a májban a CPT1, az ACOX1 és a FASN expresszióját (3C. Ábra), ami megfelel az összehasonlítható máj-trigliceridszintnek FO és CO csirkékben (az adatokat nem mutatjuk be).
A PPARG és koaktivátorának PPARGC1B csökkentett szabályozásával járó megnövekedett kis adipociták irányába történő elmozdulás arra utal, hogy az anyai FO részben csökkentette az adipozitást azáltal, hogy gátolta az progressziót az adipogenezison keresztül. Az EPA és a DHA ligandumokként működhet a PPARG aktiválásában, amelyek várhatóan elősegítik az adipogenezist ezen nukleáris receptor szerepe révén az adipocita differenciálódás megszervezésében. Az in vitro vizsgálatok azonban mind az EPA, mind a DHA pro- és anti-adipogén hatását kimutatták, amelyet a sejtvonal ingadozása, differenciálódási protokollja, referenciakezelése és 30, 31, 32 zsírsavkoncentráció okozhat. Érdekes módon a kis zsírsejtek nagyobb gyakoriságára való áttérést és a megnövekedett PPARG expressziót írták le zsír 1 egerekben, amelyek endogén módon szintetizálták az n-3 PUFA-kat a C. elegans 33 új zsírsav-deszaturázának transzgén expressziója miatt. A mikroszkópos adatok azt mutatták, hogy az n-3 PUFA konstitutív szintézise zsír-1 egerek adipocitáiban jelentősen elnyomta a GATA-kötő fehérje 3 expresszióját, amely általában a PPARG 34 közvetlen szuppressziójával gátolja a preadipociták differenciálódását. .
16-szoros) zsírszövetben FO vs. CO, proteomikai adataink szerint. Ez az enzim egy koordinált DNS-demetiláz rendszer része, amely epigenetikus módosítással szabályozza a sejtek sorsát a fejlődő embrióban 46. Az APOBEC2 expressziója elsősorban a vázizomhoz kapcsolódik, amelyben myoblast differenciálódáshoz kapcsolódik, de a csirkék zsírszövetében is kifejeződik 47. Ha az anyai FO-táplálás epigenetikus mechanizmusok révén csökkenti az adipozitást, amelyek gyakran stabilak, akkor fontos következményei vannak a gyermekkori (és potenciálisan felnőtt) elhízás ellenőrzésének új eszközeivel. Ennek a lehetőségnek a kivizsgálásához utólagos vizsgálatokra van szükség az anyai FO etetés metilációs mintáinak és egyéb epigenomikus jellemzőinek jellemzésére.
Összefoglalva, adataink azt mutatják, hogy az anyai halolaj fogyasztása csökkenti a zsírszövet lerakódását az utódokban. Vizsgálatunk az élet első két hetére korlátozódott, és további kísérletekre van szükség annak megállapításához, hogy ez a hatás meddig tart a kölykök érésével. Ezek az eredmények kiegészítik a legutóbbi emberen végzett vizsgálatokat, amelyek összekapcsolják az anyai étrendben lévő LC n-3 PUFA-kat a gyermekek csökkent zsírtartalmával. Ezért hangsúlyozzák a zsírfelhalmozódás csökkentésének lehetőségét és a gyermekkori elhízás kockázatát a szülés előtti étrendi beavatkozás révén.
mód
Diéták és tenyésztés
Vér- és szövetgyűjtés
A csirkéket CO2-elfojtással eutanizálták. Mindkét csoportból két kölyköt feláldoztunk, amikor a májat és az agyat kikeltük lipidanalízishez. Az egyes szövetek mintáit fagyasztva lefagyasztottuk és -80 ° C-on tároltuk. A fennmaradó csirkéket 7 és 14 napos korukban felöltük. Az eutanázia idején a vért szív vénapunkcióval vettük fel, és 10 ml-es szérum elválasztó csövekbe helyeztük (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). A szérumot centrifugálással elválasztottuk és -80 ° C-on tároltuk a keringő metabolitok elemzéséig. A hasi és femorális (szubkután) zsírraktár helyeket boncoltuk és adipozitási indexként lemértük. Az egyes raktárakból és májból származó mintákat ezután folyékony nitrogénben gyorsfagyasztottuk, és -80 ° C-on tároltuk. A hasi zsírszövet mintákat 24 órán át 4 ° C-on paraformaldehidben (4%) rögzítettük, hogy az adipocita méretét szövettanilag meghatározzuk.
A szérum metabolitjai
Kereskedelemben kapható kolorimetriás tesztkészleteket használtak a szérum glükózszint (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) és a nem észterezett zsírsav (NEFA) szintek (Wako Chemicals, Neuss, Németország) mérésére.
Zsírsav-elemzés
Foszfolipid elemzés
A kikeléskor összegyűjtött agyban és a májban a foszfatidilkolin fajok zsírsavösszetételét (n = 2/diéta) és a hasi zsírszövetben, 7 napos korban összegyűjtve (n = 5/diéta) egy UltraHigh Performance Liquid Chromatograph (UHPLC) alkalmazásával elemeztük. ) -KISASSZONY. (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA). A szövetmintákat (100 mg) habarcs segítségével folyékony nitrogénben porrá őröltük. A foszfolipideket egy módosított Bligh és Dyer 65 protokoll alkalmazásával extraháltuk. A szárított extraktumokat 300 μl metanol/kloroform (9: 1) elegyben szuszpendáljuk az UHPLC-MS elemzéshez, a fentiek szerint 66. A lipid fajokat pontos m/z és retenciós idők alkalmazásával azonosítottuk. Az egyes foszfolipidosztályok lipid standardjait (Avanti Polar Lipids, Alabaster AL) alkalmaztuk a retenciós idők ellenőrzésére. Az összes ionfragmentumot arra használtuk fel, hogy megerősítsük, hogy a foszfatidilkolinok DHA-t és EPA-t tartalmaznak acil-láncként. Valamennyi ionfragmentálási pásztázás esetén a felbontás 140 000 volt, a letapogatási tartomány 100-1500 m/z volt. A normalizált ütközési energia 30 eV volt, 50% -os ütközési energiával. A lipideket fragmenseikkel azonosítottuk Xcalibur szoftverrel (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). Az adatok elemzését a Maven szoftver 67 segítségével végeztük .
Adipocita mérete
A két korcsoportba tartozó három diétás madár hasi zsírmintáit beágyazottuk, metszettük és hematoxilinnal és eozinnal (H&E; két tárgylemez/madár) festettük, hogy meghatározzuk az adipocita méretet a fent leírtak szerint. Három olyan madarat használtunk, amelyek zsírtartalma a legközelebb állt az átlagos zsírtartalomhoz minden étrendben/korcsoportban. Röviden, minden egyes dián három független mező képét rögzítettük 20-szoros nagyítással, egy Advanced Microscopy Group EVOS XL Core Microcope (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) alkalmazásával. A konzisztencia érdekében ugyanaz a személy végzett minden mérést. A J ábrát (1.48. Verzió, National Institutes of Health) használtuk az adipociták (μm 2) területének meghatározására 2,8 μm/pixel mikroszkóp beállítással, és azzal a korlátozással, hogy a méréseknek meghaladják az 500 μm 2 értéket. A frekvenciaeloszlásokat úgy hoztuk létre, hogy az adipocitákat a terület alapján üregekbe csoportosítottuk, és megszámoltuk az egyes üregek sejtjeinek gyakoriságát. Az adipocita térfogatának és a 68. számának kiszámításához standard módszert alkalmaztunk.
Valós idejű PCR teszt
Körülbelül 200 mg hasi zsírszövetből és öt kölyök májából izoláltuk a teljes RNS-t minden táplálkozási csoportban 14 napon az InvitrogenTM TRIzolTM (Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával. Öt olyan madarat használtunk, amelyek zsírtartalma a legközelebb állt az egyes táplálékok átlagos zsírtartalmához. CDNA-t szintetizáltunk 500 ng teljes RNS-ből 20 μl-es reakciókban az iScript cDNS Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) alkalmazásával. A kvantitatív valós idejű PCR (QPCR) előre jelzett és validált primereit a Qiagen-től (Quantitect; Germantown, MD) szereztük be. A QPCR-t három mintában hajtottuk végre minden mintán az iQ SYBR Green Master Mix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) alkalmazásával, a fentiek szerint 53. A kívánt gének expressziós szintjét normalizáltuk a háziasszonyként használt TBC1 doméncsalád 8. tagjának (TBC1D8) expressziójához.
proteomika
A táplálékonként a három kölyök mindegyikéből kb. 1 g hasi zsírszövetet folyékony nitrogénben lévő porrá őröltek, amelyből kb. 60 mg-ot használtak fel a fehérje extrakciójához. A fehérjéket fehérje-extrakciós protokoll alkalmazásával extraháltuk metanol, kloroform és kloroform (2: 1) nélkül, amelyet lipidekben gazdag szövetek számára terveztek, és Bligh and Dyer 70 módszer alapján. A fehérjéket a vizes frakcióból triklór-ecetsavval kicsapjuk és tripszin lépésekkel emésztjük. Körülbelül 2 mg proteolitikus peptidet kapunk tisztítás után mindegyik mintából. Ezen peptidek 50 μg alikvot részeit használtuk 2D-LC-MS/MS proteom mérésekhez LTQ Orbitrap tömegspektrométeren (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a fent leírtak szerint 71. A MyriMatch v2.1.111 72-et alkalmazták a nyers tömegspektrum megkeresésére az előre jelzett fehérje adatbázisban, hogy azonosítsák a teljesen triptikus peptideket, amelyeket azután a megfelelő fehérjékbe csoportosítottak az IDPicker v.37-gyel. A további elemzéshez csak a legalább két azonosított peptidspektrummal és q 0,02 maximális értékkel rendelkező fehérje-azonosításokat vettük figyelembe. A peptid-fragmenseket a Gallus gallus genomban (V3.0) lévő fehérjékhez térképeztük fel Uniprot alkalmazásával.
Statisztikai analízis
A statisztikai elemzéseket SAS (V 9.4) alkalmazásával végeztük. A statisztikai tesztelés előtt az adatokat Shapiro-Wilks segítségével igazoltuk a normalitás szempontjából. A test- és zsírsúlyokat, a szérum metabolitokat, a szöveti zsírsavösszetételt, az átlagos adipocita méretet és az adipocyta számot kevert ANOVA modell alkalmazásával elemeztük, diétára, életkorra és kölcsönhatásukra (X életkor) vonatkozó kifejezésekkel. Jelentős F-tesztek után (P 74 az adatok eloszlásának normalizálására. Különböző bőséges fehérjék funkcionális elemzését az Annotation, Visualization and Integrated Discovery adatbázisban található Functional Annotation and Pathway Mapping opciókkal végeztük (DAVID, V 6.8) 75. Minden statisztikai adat a vizsgálatokat a P-értékek ≤ 0,05 alkalmazásával végeztük a statisztikai szignifikancia kritériumaként.
Az adatok elérhetősége
A jelenlegi vizsgálat során létrehozott adatkészletek ésszerű kérésre a megfelelő szerzőtől elérhetőek
Változástörténet
köszönöm
Ezt a munkát a BHV támogatásával támogatta az Állattenyésztési Betegségek és Emberi Egészség Kiválósági Központja, a Tennessee Egyetem Állatorvostudományi Főiskolája és az AgResearch, a Tennessee Egyetem Mezőgazdasági Intézete. A szerzők szeretnék elismerni az Iowa Állami Egyetem WM Keck Metabolomikai Kutatólaboratóriumát a zsírsav-elemzésekért és köszönetet mondani Dr. Michael O. Smith és Dr. Jay Whelan a projektbe való hozzájárulásukért.
Elektronikus kiegészítő anyag
Kiegészítő információk és adatok
Hozzászólások
Megjegyzés beküldésével vállalja, hogy betartja Általános Szerződési Feltételeinket és közösségi irányelveinket. Ha ezt sértő cselekedetnek találja, amely nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.