hiánya

  • elemeket
  • absztrakt
  • A fő
  • az eredmény
  • A terhességi MDD megváltoztatja a patkány agy morfometriai tulajdonságait és tulajdonságait
  • Az MDD csökkenti az agy expresszióját és a Stat3 foszforilációját
  • Az MDD befolyásolja az aktív kulcsfehérje-kinázok expresszióját
  • A csökkent Stat3 jelátvitel fokozott apoptózissal és a kapcsolódó fehérjék egyidejű megváltozott expressziójával társul in vivo aj in vitro
  • A Stat3 jelátvitel csökkenése a miR-124 fokozott expressziójával jár együtt az agyban
  • A miR-124 elnémítása fokozza a Stat3 jelátvitelt és legalább részben megmenti a foláthiánynak kitett sejteket
  • vita
  • További információ
  • Képfájlok
  • További 1. ábra
  • További 2. ábra
  • További 3. ábra
  • További 4. ábra
  • Word dokumentumok
  • További kép jelmagyarázat
  • szójegyzék

elemeket

  • Sejtjelzés
  • Az idegrendszer fejlődése
  • DNS-metilezés
  • miRNS

absztrakt

A fő

Kísérleti vizsgálatok során a metil donorok, például a folát és a B12 hiánya egyensúlyhiányos idegsejtek proliferációjával/differenciálódásával, endoplazmatikus retikulum stresszel és apoptózissal társult. 11, 12, 13, 14, 15 Ezenkívül rágcsálóknál jelentettek hippocampus atrófiát, mikrovaszkuláris ritkaságot és kognitív károsodást. 12, 16, 17 Bár a homocisztein embriotoxikusnak bizonyult, úgy tűnik, hogy nem volt közvetlenül felelős a fejlődési rendellenességekért, 18, 19 és az anyai B-vitamin státusának az idegcsőre és az agy fejlődésére gyakorolt ​​mechanizmusai megmaradtak rosszul értett.

Az embriophetális agyi fejlődés nagyon összetett folyamat, amely megköveteli a specifikus génkészletek időbeli kifejezését számos pontosan szervezett lépéssel. 20 Annak meghatározásához, hogy az idegi fejlődési faktorok genetikai szabályozása miért lehet felelős a folát/B12-vitamin kimerülésével összefüggő agyi hibákért, mikroarray megközelítést alkalmaztunk (patkány patkány neurogenezise és idegi őssejt PCR tömb, RT 2 Profiler PCR tömb, SABiosciences, Qiagen SA .) Mivel a 3 transzkripció jelátalakítója és aktivátora (Stat3) egyetlen génként jelent meg, amely a B-vitamin-hiány miatt nagyon redukálódott, tovább vizsgáltuk annak szerepét az MDD in vivo következményeiben egy validált 12, 17 és in vitro hippokampus ős patkány patkányban modell. 14

A Stat3, elsősorban a citokinekhez és a növekedési faktorokhoz kapcsolódó jelekhez társul, foszforilezéssel aktiválódik, és szabályozza a sok fiziológiai válaszban részt vevő célgének transzkripcióját. A Stat3 valóban többször részt vesz az alapvető biológiai folyamatokban, például a sejtek szaporodásában, differenciálódásában, apoptózisában és túlélésében (22, 23), és kimutatták, hogy részt vesz különböző fejlődési eseményekben, mint például a motoros idegsejtek kötése és vezetése 24, valamint a neuritok kinövése., 25 Ez az első bizonyíték arra, hogy a korai MDD a miR-124 túlexpresszióval járó Stat3 jelátveszettség elvesztését okozza az agy fejlődésének károsodásával.

az eredmény

Korábbi in vivo és in vitro vizsgálatok igazolták kísérleti körülményeink hatékonyságát a metil donor hozzáférhetőségének csökkentésében a 12, 26 patkány utódaiban és a hippocampus H19-7 sejtekben. 14 Mindkét kísérleti modellben a globális DNS-metiláció csökkent az alacsony metil-alkohol-kísérlet körülményei között, azaz 23,2% -kal a magzati agyszövetben (n = 4) és 40,4% -kal a tenyésztett hippocampus sejtekben 13 órával a differenciálódásuk indukciója után ( n = 4).

A terhességi MDD megváltoztatja a patkány agy morfometriai tulajdonságait és tulajdonságait

Amint az az 1. ábrán látható, a testtömeg és a testhossz jelentősen csökkent (-20,5% és -15%) a késői vemhesség alatt (20. embrió, E20. Nap) a magzati patkányokkal etetett étrendben, amint azt az intrauterin retardáció előfordulása jelzi. Ezt megerősítette a combcsont hosszúságának jelentős csökkenése (-14%). Míg az agy súlya is hatással volt (-14,6%), a szelektív agyrétegek vastagsága, például a CA1 hippocampalis piramisréteg, a fogászati ​​gyrus granulátum sejtrétege és a neurogén subventricularis zóna (-40, -22% és -26 %). A legérdekesebb, hogy ezek az agyterületek 450 napos korban is atrófiák maradtak, bár a patkánykölykök csak elválasztásból kaptak szokásos, hiányos étrendet (1e-h. Ábra).

A metil donorhiány hatása a patkány magzatának morfometriai tulajdonságaira. a - d ) Általános morfometriai mérések a kontroll- és MDD-magzatokban az embrió (ED) napján 20, 33≤ n ≤37. Az adatokat átlag ± SD-ként mutatjuk be. Statisztikailag szignifikáns különbségek a kontroll és MDD patkányok között: ** P 705 és foszfo-Stat3 Ser 727 (2b. Ábra). A fehérjeszint mennyiségi változását a kiegészítő információk mutatják (1. ábra). Western-blot elemzéseink szerint a Stat3 fehérje teljes mennyisége 62% -kal csökkent a magzati nélkülözött középagyban. Amint azt a 2c. Ábra mutatja a foszfo-Stat3 Tyr 705 esetében, ezeket a megfigyeléseket in situ immunhisztokémia igazolta az agykéregben, az SVZ-ben és a hippocampus CA1-rétegében.

A metil donorhiány hatása a Stat3 és a foszfo-Stat3 (Tyr 705 és Ser 727) agy expressziójára patkánymagzatokban E20-nál. a ) A teljes Stat3 mRNS szint kvantitatív valós idejű RT-PCR-rel mérve. Az adatokat tetszőleges egységekben (AU) jelentjük átlag ± SD (n = 5), * P 705 és foszfo-Stat3 Ser 727 értékek között a középagyban és a kéregben a kontroll magzatokból (C) és az MDD E20-ból. Hasonló profilokat kaptunk további öt kísérletből. c ) A Stat3 és a foszfo-Stat3 Tyr 705 immunhisztokémiai festése az agykéregben, az SVZ és a CA1 hippokampusos rétegében a kontroll és az MDD E20 magzatoktól

Teljes méretű kép

Hasonló eredményeket kaptunk a tenyésztett hippokampusos progenitor sejtekben, csökkent mRNS-szinttel (-54%) és fehérje-expresszióval 6 és 13 órával a differenciálódás indukálása után folátmentes sejtekben (3. ábra és 1. további ábra). Az összes Stat3 fehérje mennyisége 48% -kal csökkent 13 órával a sejtdifferenciálódás kiváltása után. Ezenkívül a konfokális mikroszkóppal végzett immunocitokémiai elemzések nyilvánvaló csökkenést mutattak ki a Stat3 jelenlétében a sejtmagokban (3c. Ábra).

A folsavhiány hatása a Stat3 és a foszfo-Stat3 expressziójára (Tyr 705 és Ser 727) H19-7 hippocampalis progenitor sejtekben. a ) Összes Stat3 mRNS-szint kvantitatív valós idejű RT-PCR-rel mért a kontroll és B9-hiányos sejtekben 13 órával a differenciálódásuk indukciója után. Az adatokat AU-ban átlag ± SD (n = 5), * P 705 és foszfo-Stat3 Ser 727 értékek jelentik a kontroll (C) és a B9-hiányos (D) H19-7 sejtekben 6 és 13 órával a differenciálódás indukciója után. további öt kísérletből nyertük. c ) Stat3, foszfo-Stat3 Tyr 705 és foszfo-Stat3 Ser 727 immunocitokémiai jelölése kontroll sejtekben és B9-hiányos H19-7 sejtekben 13 órával a differenciálódásuk indukciója után

Teljes méretű kép

Az MDD befolyásolja az aktív kulcsfehérje-kinázok expresszióját

A Stat3 jelátviteli útvonalakhoz több kinázra van szükség, például Erk1/2 MAP kinázokra, p38, c-Jun N-terminális kinázra (JNK) és Src, amelyek részt vesznek a Stat3 dimerizálásában és aktiválásában. 27, 28

MDD-expozíció után a megfelelő kinázok aktív foszforilezett formáinak expressziós mintázatát különböző módon befolyásolták (4. ábra). A foszfo-Erk1/2, a foszfo-Src és a foszfo-p38 expressziós szintje szignifikánsan csökkent, míg a foszfo-JNK expressziója növekedett és a foszfo-Akt expressziója nem változott szignifikánsan. Fontos, hogy a rögzített profilok hasonlóak voltak a magzati agyszövetben és a H19-7 sejtek differenciálódásában. A fehérje mennyiségének mennyiségi változását a kiegészítő információ tartalmazza (2. ábra).

A kontroll (C) és az MDD E20 magzatok agykéregében, valamint a kontroll (C) és B9-hiányos (D) H19-7 sejtekben a Stat3 jelátviteli utakban részt vevő, upstream foszfo-kinázok Western blot-analízise az indukció után 6 és 13 órával megkülönböztetésük. Hasonló profilokat kaptunk további öt kísérletből

Teljes méretű kép

A csökkent Stat3 jelátvitel fokozott apoptózissal és a kapcsolódó fehérjék egyidejű megváltozott expressziójával jár együtt in vivo és in vitro

A Stat3 aktivációról ismert, hogy pozitívan befolyásolja az antiapoptotikus, valamint a Bcl-2 és Bcl-xL túlélési fehérjék expresszióját. 29., 30. Ezért megvizsgáltuk expressziós szintjüket, valamint az MDD utáni apoptózis egyéb kulcsfontosságú tényezőinek szintjét.

A várakozásoknak megfelelően a Bcl-2 és a Bcl-xL mennyisége jelentősen csökkent az étrendben hiányos E20 magzatok agyában, míg a Bax és a hasított kaszpáz-3 proapoptotikus fehérjék expressziós szintje mind a középagyban, mind az agyban növekedett. kéreg, a hasított kaszpáz-9 csak az agy közepén fejeződik ki túlzott mértékben (5a. ábra). A fehérje mennyiségének mennyiségi változását a kiegészítő információk adják meg (2. ábra). Ezenkívül jelentősen megnőtt a hiányos magzatok hippocampusában, SVZ-jében és az agykéregében a TUNEL-pozitív sejtek száma (5c. Ábra, 3. kiegészítő ábra). Ezt megerősítette az aktív kaszpáz-3 és a kaszpáz-9 jelölése a magzati agyban, amint azt a CA1 hippokampus régiójában és az SVZ-ben bemutatjuk, nagyszámú elhalt sejt jelenlétével az oldalsó kamrában (3. kiegészítő ábra) ).,

A TaqMan RT-qPCR alkalmazásával végzett vizsgálatban a miR-124a ncRNS expressziós mintázatai az indukció után 13 órával szignifikáns (kétszeres) növekedést mutattak az MDD-nek kitett E20 magzatok agyában, valamint a B9-hiányos H19-7 neuroprogenitorokban. differenciálódásuk (1,7-szeres) (6a. ábra). Ezt megerősítették in vivo hibridizációval különböző agyi régiókban, beleértve a hippocampust, az SVZ-t (6c. Ábra) és a kisagyat (nem ábrázolták), valamint in vitro a differenciálódási sejtekben (6d. Ábra).

A metil donorhiány hatása a miR-124 expressziójára. a ) A miR-124 expressziós szintje AU-ban a kontroll agyában és az E20-hiányos magzatokban. ( b ) Az expresszió szintje a kontroll (C) és a B9-hiányos (D) H19-7 sejtekben 13 órával a differenciálódásuk kiváltása után. Az összes adatot átlag ± SD értékként adjuk meg (n = 9 és n = 7 E20 agyszövet és H19-7 tenyésztett sejtek esetében),

A miR-124 csendesítésének hatása a H19-7 sejtek differenciálódására. ( a ) A miR-124 siRNS hatása a Stat3 és a kapcsolódó fehérjék expressziós szintjére a kontroll (C) és a foláthiányos (D) sejtekben 13 órával a differenciálódás kiváltása után (si = nem célzott siRNS, siM = miR-124 célzott siRNS) . Az expressziós minták a Western blot három különálló sorozatára vonatkoznak. ( b ) A miR-124 siRNS hatása a sejtmorfológiára 13 órával a differenciálódás kiváltása után. ( c ) Az apoptotikus sejtek százalékos aránya a TUNEL assay szerint. d ) Sejtfolyamatok száma cellánként. For ( c ) a ( d ): statisztikailag szignifikáns különbség megfelelő kontroll mellett: * P •• P 14 Ebben a vizsgálatban a miR-124 siRNS alacsony szintű szabályozása e folyamatok jelentős újrakezdéséhez vezetett. Bár a miR-124 siRNS-kezelés kissé befolyásolta a kontroll tulajdonságait a kontroll progenitorokban, a miR-124 siRNS-sel kezelt foláthiányos sejtekben az egy sejtre jutó neuritok száma ∼-szeresére nőtt a nem célzott siRNS-sel kezelt sejtekhez képest (7d, P

Az MDD következményeivel kapcsolatos főbb események összefoglalása a patkányagyban. Felhívjuk figyelmét, hogy miR-124 által az Src aktivitás csökkentésére vonatkozó első bizonyítékot szolgáltattuk, amely a Stat3 foszforilezését mutatja a Tyr 705 maradéknál.

Teljes méretű kép

Az MDD közvetlen hatásait az egyszeres szén-anyagcserére és annak különféle kulcsfontosságú tényezőit egy állatmodellben, valamint a folsavhiánynak a tenyésztett H19-7 hippocampalis progenitorokra gyakorolt ​​hatásait részletesen leírják a korábbi jelentések. Az ilyen kezelés különösen a homocisztein felhalmozódását és a SAM/SAH aránynak megfelelő metilációs képesség index csökkenését eredményezi. Ezt tükrözi tanulmányunk, különösen a metilált DNS mennyiségének csökkenése az MDD-re válaszul két kísérleti modellünkben.

Meglepő módon, míg az siR miR-124a siRNS kezelése kissé csökkentette a kontroll sejtek neuritjeinek számát, a hiányos progenitorokban szignifikánsan javította a sejtek morfológiáját.

Habár a mechanizmusok, amelyek révén a B-vitamin állapota befolyásolhatja a miR-124 expresszióját, még mindig teljesen tisztázottak, a folát és a miR közötti kapcsolat fennállását korábban már dokumentálták. A folátpótlás jótékony hatással lenne a magzati agyban az etanol által kiváltott teratogenezisre, mivel részben csökkentené a miR-10a, 43 szabályozását, míg a különféle miR-ek expressziója az idegcső mutáns egérmodelljének fejlődő agyában (Splotch -/- ) folsav-kiegészítéssel megváltoztatta. 44 Végül Marsit és mtsai. 45 azt mutatta, hogy a foláthiány számos miR expressziós profiljának szignifikáns növekedését okozta a tenyésztett humán lymphoblastoid sejtekben. A folsav/B12-vitamin státusának csökkenése a SAM rendelkezésre állásának csökkenéséhez vezet, ami a sejtmetilezési reakciókhoz szükséges. Dokumentálták, hogy a miR-ket epigenetikus események szabályozzák, és a közelmúltban bebizonyosodott a miR-124 gének metiláció által közvetített csendesítése. 47 Ezért a miR-124 megváltozott expressziója társulhat alacsony metilcsoportú donorok ellátásával, csökkentett DNS-metilációval együtt, amint azt modelljeink megfigyelték, és végső soron a Stat3 expressziójának változásához vezethet.

Összegzésképpen megmutattuk, hogy az MDD a miR-124 fokozott expressziójával járt, ami két különböző szinten érintette a Stat3 jelátvitelt; Először az expresszió szintjén a Stat3 mRNS megcélzásával, másodszor pedig az aktiválását célozzuk meg az Erk1/2 és Src kinázok gátlásán keresztül, anélkül, hogy a miR-124 hatással lenne a Stat3 szignalizációban részt vevő más kinázokra. Az agy nagyon sérülékeny a fejlődés során, és a Stat3 jelátvitel károsodása csökkent sejtproliferációhoz és fokozott apoptózishoz vezethet, ami specifikus agyrétegek végleges atrófiájához vezethet, amint azt a B-vitamin-hiányos patkányoknál megfigyelték.