replikáció

  • elemeket
  • absztrakt
  • Háttér:
  • mód:
  • az eredmények:
  • következtetés:
  • A fő
  • Anyagok és metódusok
  • Betegek, hisztopatológiai értékelés és nyomon követés
  • A HBV DNS és a cccDNS mennyiségi intrahepatikus mérése
  • A génexpresszió elemzése RNS-szekvenciával
  • Statisztikai analízis
  • Tanulmány jóváhagyása
  • az eredmény
  • A HBV vírusterhelésének jellemzése daganatban és párosított, nem neoplasztikus májban
  • Magasabb cccDNS kópiaszám kisebb daganatokban a nagyobb daganatokhoz képest
  • Intrahepatikus vírusterhelés és vírusaktivitás a szérum HBV DNS és HBeAg alapján
  • A tumor és a neoplasztikus máj vírusreplikációs aktivitásának hatása a betegek túlélésére és a HCC visszatérésére
  • A vírus replikációs aktivitásával járó génexpresszió a nem neoplasztikus májban
  • A vírus genotípusa és variánsai a daganatban és a neoplasztikus májszövetben
  • vita
  • A változások története
  • További információ
  • Word dokumentumok
  • Kiegészítő anyagok és módszerek
  • PDF fájlok
  • 1-8. Kiegészítő táblázatok

elemeket

  • DNS replikáció
  • B típusú sárgaság
  • Májtumor
  • Daganat vírusfertőzések

Ez a cikk frissült

absztrakt

Háttér:

A vizsgálat célja meghatározni az intracelluláris hepatitis B vírus (HBV) DNS, a kovalensen lezárt körkörös DNS (cccDNS) és a vírus replikációs aktivitásának hatását mind a daganatos, mind a nem daganatos májban a prognózisra, és meghatározni a vírus replikációs aktivitásának kapcsolatát. és Ishak fibrózis. amikor reszekció után megjósolják az eredményt.

mód:

Összesen 99 potenciálisan beiratkozott beteget kezeltek elsődleges májreszekcióval HBV-HCC miatt. Az intracelluláris HBV DNS-t és a cccDNS-t valós idejű PCR-rel számszerűsítettük. Az RNS-szekvenálást (RNS-seq) 21 beteg egy részcsoportjában hajtották végre, akiknél minimális májfibrózis (Ishak 0–2. Stádium) vagy végstádiumú fibrózis (Ishak 6. stádium) volt.

az eredmények:

A tumorszövet alacsonyabb cccDNS-kópiákat tartalmazott a párosított, nem neoplasztikus májhoz képest, és a nagyobb daganatoknál (> 3 cm) kevesebb volt a cccDNS a kis daganatokhoz képest (-3 cm). A neoplasztikus májban a magas vírusreplikációs aktivitás az Ishak fibrózis stádiumától függetlenül a HCC megismétlődésének magasabb arányával járt. A nem neoplasztikus májban a vírus replikatív aktivitásával korreláló gének (620 gén) különböztek a végstádiumú fibrózishoz kapcsolódó génektől (1226 gén). A vírusreplikatív aktivitással összefüggő gének előnyösen eloszlottak a chr3, chr16 és chr19 régiókban.

következtetés:

A neoplasztikus máj vírusreplikációs aktivitása a HCC megismétlődésével jár együtt olyan mechanizmusok révén, amelyek különböznek az Ishak fibrózis stádiumától és függetlenek az Ishak fibrózis stádiumától.

A fő

A hepatitis B vírus (HBV) egy burkolt DNS vírus, amely elsősorban hepatocitákat fertőz meg. Érett virion esetében a vírus DNS felszabadult kör alakú formában (rcDNS) van jelen, amely részben kettős szálú. A gazdasejtbe jutás után a vírusgenom a sejtmagba szállul, ahol az rcDNS átalakul kovalensen lezárt körkörös DNS-vé (cccDNS) (Levrero és mtsai, 2009). Miután létrejött, a cccDNS-tartalom stabil a nyugalmi hepatocitákban, és csökkenthető sejtosztódással történő hígítással, fertőzött sejtek elpusztításával vagy antivirális citokinek általi szuppresszióval (Belloni és mtsai, 2012).

A tartós HBV-fertőzés a HBV-vel összefüggő hepatocelluláris carcinoma (HCC) kialakulásának fő kockázati tényezője. A vírusfehérjék, a vírusgenom befogadása a gazda genomjába, gyulladás, oxidatív stressz és a krónikus HBV-fertőzéssel összefüggő elhúzódó fibrotikus reakciók fontos szerepet játszhatnak a hepatocarcinogenezisben (Xu és mtsai., 2010; Zhou és mtsai., 2010; Arzumanyan Korábbi vizsgálataink kimutatták, hogy a végstádiumú fibrózis (Ishak 6. fázis) függetlenül összefügg a gyenge teljes túléléssel és a HCC megismétlődésének magasabb arányával (Wang et al., 2013b, 2013c). Ezenkívül korábbi, 1991 és 2008 között kezelt 111 HBV-HCC páciens nem inotlasztikus paraffinba ágyazott májszövet-mintáit használó vizsgálatunk azt mutatta, hogy a vírusreplikációs aktivitás, amelyet a cccDNS aránya mutat a teljes HBV DNS-ben, korrelál a nekrotikus gyulladással és Ishak rostos stádium és a neoplasztikus máj magas vírusreplikációs aktivitása rossz eredménnyel járt HBV-HCC-ben szenvedő betegeknél (Wang et al, 2013c).

A tanulmány célja annak meghatározása, hogy a HBV vírusreplikációs aktivitás kimenetelre gyakorolt ​​hatását a fibrózistól független vagy szekunder mechanizmusok közvetítik-e. Ez a jelentés egy ígéretes betegcsoport eredményeit írja le, amelyek teljesen eltérnek a korábbi retrospektív kohorttól. Csak a 2008 és 2013 között a vizsgálatba bevont primer májreszekcióval rendelkező betegek friss szövetmintáiból származó adatok szerepelnek ebben a vizsgálatban. Az intracelluláris HBV DNS-t és a cccDNS-t, valamint a vírus replikatív aktivitását (cccDNS/HBV DNS arány) standardizált kvalitatív PCR-rel mértük. (Laras és mtsai, 2006; Volz és mtsai, 2007; Pollicino és mtsai, 2011), és HBV-HCC-ben szenvedő betegek 99 páros daganatában és nem daganatos májszövetmintájában hasonlítottak össze. Az intracelluláris vírus DNS és a vírus replikációjának hatása a klinikai eredményre a gyógyulás céljából végzett műtéti reszekció után.

Anyagok és metódusok

Betegek, hisztopatológiai értékelés és nyomon követés

Ez egy 99 olyan HBV-HCC beteg prospektív elemzése, akik 2008 és 2013 között a New York-i Sínai-hegyi Orvosi Központban szándékosan végeztek elsődleges műtéti reszekciót. Ezen betegek 90% -a dokumentált vírusellenes terápiát, és legtöbbjüket rövid ideig kezelték - idő a HCC diagnózisuk előtt. A legtöbb beteg egyfajta vírusellenes kezelést kapott (82%), 17% kétféle vírusellenes kezelést, 1% pedig háromféle vírusellenes kezelést kapott. A leggyakrabban alkalmazott antivirális szerek az entekavir (39%), a tenofovir (34%) és az adefovir (23%) voltak. Más vírusellenes szerek, például a telbivudin, az antivirális kezelés minden típusának 4% -át teszik ki. A műtét előtti szérum HBV DNS-t orvosi dokumentáció alapján határozták meg. Intézményi klinikai laboratóriumunkban a szérum HBV DNS szintjét a HBV AmpliPrep-COBAS TaqMan HBV Assay segítségével számszerűsítettük, a jelentett tartomány 23-2 x 108 NE ml -1 (Faria et al, 2008). A túlélők átlagos követési ideje 30 hónap.

A májreszekciós mintákat egy májpatológus értékelte. A nem faggyú májszövetben a májfibrózis mértékét módosított Ishak-módszerrel (0–6. Szakasz) értékeltük a következőképpen: 0. fokozat (normális máj); 1. fokozat (több portáltraktus kiterjesztése fibrózis révén); 2. szakasz (az összes portál traktus fibrózisa); 3. szakasz (a portál legtöbb területének rostos kiterjesztése, a portál időnként áthidalásával a portálra); 4. szakasz (a portális területek rostos kiterjesztése jelentős áthidalással); 5. szakasz (alkalmi csomópontok áthidalásával jelölve); és a 6. stádium (noduláris szövetekkel igazolt cirrhosis) (Goodman, 2007; Wang és mtsai, 2013b). A többszörös daganatos betegeket nem zárták ki ebből a vizsgálatból. A patológus értékelte a szövettani aktivitási indexet (HAI, 0–18. Pont), amely a nem gyulladásos fokozat mértékét, a tumor differenciálódását és az érinvaziót képviseli.

A diagnosztika részletes módszertanát és a beteg későbbi intézkedéseit kiegészítő anyagok és módszerek adják meg.

A HBV DNS és a cccDNS mennyiségi intrahepatikus mérése

A HBV DNS-t és a cccDNS-t genomi DNS-ből amplifikáltuk a QIAamp DNS extrakciós készlet alkalmazásával, a korábban leírtak szerint (Qiagen, Valencia, CA, USA) (Kuang et al., 2010; Schrader és Iredale, 2011; Wang et al., 2013c). A részletes módszereket a kiegészítő anyagok és módszerek tartalmazzák.

A génexpresszió elemzése RNS-szekvenciával

A génexpressziót 21 beteg egy részében értékelték RNS-seq technológiával a nem neoplasztikus májban (3. kiegészítő táblázat). Valamennyi, 5 cm-nél kisebb daganatméretű beteg bekerült, vagy minimális májfibrózisban (Ishak 0–2. Stádium, n = 10), vagy valószínű vagy végleges cirrhosisban (Ishak 6. fokozat, n = 11). Teljes RNS-t (mintánként 1-3 μg) juttattak el a Sínai-hegyi Genomika Alaplétesítménybe minőség-ellenőrzési elemzés céljából. Az RNS-szekvencia részletes módszertanát a kiegészítő anyagok és módszerek tartalmazzák.

A génexpresszió szintjét RPKM (az exon-modell kilobázisára eső értékek millió leképezett leolvasás) segítségével becsültük meg, amelyeket egy génhosszra és a teljes leképezett leolvasásra normalizáltunk. A vírus replikatív aktivitásával korreláló géneket Spearman korrelációs esszével azonosítottunk. P-értéknél 100-szoros, 6607 × 103 példányról 46 × 103 példányra, ami a DNáz kezelés hatékonyságát jelzi. A HBV DNS-kópiák száma ugyanabban a mintacsoportban 22x103 kópiáról 3x103 kópiára csökkent, ami hétszeres csökkenést tükröz. A cccDNS példányszáma 1x103 példányról 0,3x103 példányra csökkent, ami háromszoros csökkenést tükröz. Ezért a PCR-alapú vizsgálat mind a vírusgenomot, mind az integrált vírus DNS-t amplifikálta.

Magasabb cccDNS kópiaszám kisebb daganatokban a nagyobb daganatokhoz képest

A kezdeti daganatoknál (közepesnél kisebb, -3 cm) nagyobb volt a cccDNS kópia száma sejtenként a tumorban, mint a nagyobb daganatokban (> 3 cm) (átlag: 0 0004 kópia sejtenként, n = 57, szemben a 0 példány per sejt) sejt, n = 42) (1A. ábra). Ezzel szemben a kicsi vagy nagy daganattal rendelkező betegek nem daganatos májában a cccDNS kópiaszáma nem különbözött. Kis daganatos betegeknél a cccDNS kópia száma nem különbözött a daganat és a párosított daganatos máj között, míg nagyobb daganatos betegeknél a tumor cccDNS kópia szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a párosított neopinetikus máj. Hasonló eredményeket figyeltek meg az intrahepatikus HBV DNS esetében is (1B. Ábra). A kis daganatok és a nagy daganatok nem különböztek a vírus replikációs aktivitásában (átlagos cccDNS/HBV DNS arány: kicsi daganatban 0,09, nagyobb daganatokban 0,06).

A kis HCC-k (-3 cm) magasabb cccDNS- és HBV DNS-kópiákkal rendelkeznek, mint a nagy HCC-k (> 3 cm). Dobozdiagram a cccDNS sejtenkénti másolatát mutatja ( A ) vagy sejtenként HBV DNS másolata ( B ) a tumorban (szilárd rudak) vagy a nem neoplasztikus májban (nyitott rudak) kis HCC-vel (-3 cm) vagy nagy HCC-vel (> 3 cm) szenvedő betegeknél.

Teljes méretű kép

A tumor cccDNS kópiaszámai nem különböztek a tumor differenciálódásával, az érrendszeri invázióval vagy az α-fetoprotein termeléssel összehasonlítva (az adatokat nem közöljük).

Intrahepatikus vírusterhelés és vírusaktivitás a szérum HBV DNS és HBeAg alapján

A vizsgálatban részt vevő betegek 90% -a dokumentálta az antivirális terápiát. A vírusellenes kezelés ellenére a betegek 49% -ánál volt kimutatható szérum HBV DNS, és a kimutatott HBV DNS 96% -ánál a májszövetben a máj reszekciója során. A HBV DNS, a cccDNS és a cccDNS/HBV DNS aránya a tumoros vagy nem daganatos májban nem különbözött a kimutathatatlan betegek között a kimutatható szérum HBV DNS-ben szenvedőktől (2. kiegészítő táblázat).

A HBeAg státus közvetlenül a műtét előtt 67 beteg számára volt elérhető (76% HBeAg negatív, míg 24% HBeAg pozitív) (2. kiegészítő táblázat). A nem neoplasztikus májban a cccDNS/HBV DNS arány szignifikánsan magasabb volt a HBeAg-negatív betegeknél, ami alacsonyabb replikációs aktivitást jelzett a májszövetben, míg az összes többi vírus tulajdonság nem különbözött. Ezenkívül a HBeAg negatív betegek aránya szignifikánsan magasabb volt azoknál a betegeknél, akiknek alacsony a HBV replikatív aktivitása a neoplasztikus májban, összehasonlítva a magas HBV replikatív aktivitású betegekével (93% vs. 62%, P = 0,004) (3. kiegészítő táblázat). Ezért csak a neoplasztikus májban a HBV replikációs aktivitása korrelált a szérum HBeAg státuszával.

A tumor és a neoplasztikus máj vírusreplikációs aktivitásának hatása a betegek túlélésére és a HCC visszatérésére

99 beteg teljes 5 éves túlélési aránya 72%, a HCC megismétlődésének aránya 44% volt a Kaplan-Meier-elemzés szerint. A legtöbb kiújulás a műtéti reszekciót követő 24 hónapon belül következett be. A teljes intracelluláris HBV DNS, cccDNS és a replikációs aktivitás hatását mind a tumoros, mind a nem neoplasztikus májszövetben az eredményre úgy vizsgáltuk, hogy összehasonlítottuk a csoportokat átlagos cut-off értékekkel (2. táblázat, valamint 2A és B ábra). A tumor vagy a neoplasztikus máj vírusjellemzői nem jártak a teljes túléléssel.

Asztal teljes méretben

A vírusreplikációs aktivitás (cccDNS/HBV DNS arány) hatása a máj reszekciójának idején a teljes túlélésre és a reszekció utáni kiújulási arányra. Teljes túlélés ( A ) és megismétlődési arány ( B ) a cccDNS/HBV DNS arányának átlagos határértékével rétegezve a daganatban vagy a daganatos májban Kaplan-Meier módszerrel készítettük, és összehasonlítottuk a log-rank teszt vagy a Wilcoxon teszt segítségével.

Teljes méretű kép

A nem neoplasztikus máj vírusreplikációs aktivitása összefüggésben volt a HCC megismétlődési sebességével (2. táblázat, valamint 2A. És B. Ábra). A nem neoplasztikus májban a magas vírusreplikációs aktivitás (alacsonyabb cccDNS/HBV DNS arány) magasabb megismétlődési arányhoz kapcsolódott (2B. Ábra). Magas vírusreplikációs aktivitás (alacsonyabb cccDNS/HBV DNS arány) a nem neoplasztikus májban szintén magasabb HAI-val (4, 1 vs. 3, 4, P = 0,04) és magasabb stádiumú fibrózissal (4, 7 vs. 3, 9) társult, P = 0,01), ami összhangban áll a retrospektív kohorszon végzett korábbi vizsgálatunkkal (3. kiegészítő táblázat). A fibrózis stádium kovariánsként történő hozzáadásakor a neoplasztikus máj vírusreplikációs aktivitása továbbra is szignifikánsan összefüggésben állt a HCC megismétlődésével a Cox arányos veszélyek regressziójával (HR: 2, 1 (1, 0–4, 5), P = 0,04)., ami arra utal, hogy a vírus replikációs aktivitása hozzájárul a fibrózis-független HCC megismétlődéséhez.

A vírus replikációs aktivitásával járó génexpresszió a nem neoplasztikus májban

Feltételezzük, hogy a neoplasztikus máj vírusreplikációs aktivitása és fibrózisa befolyásolhatja a HCC megismétlődésében szerepet játszó különféle biológiai utakat. Ezután a vírus replikatív aktivitásával vagy a neoplasztikus máj májfibrózisával összefüggő génaláírásokat 21 beteg részhalmazában elemeztük RNS-szekvencia alkalmazásával. (4. kiegészítő táblázat). Ezen betegek közül 10-nél volt minimális fibrózis (Ishak 0-2. Stádium), míg 11-nél végstádium fibrózis volt (Ishak 6. stádium). Mind a 21 betegnél HCC −11 volt), ez a lefelé szabályozott gének halmaza, amikor a ZNF217 lokuszt 20q13-nál amplifikálták. rák (Ginestier et al., 2006). A ZNF217 egy cink-ujj fehérje, amely gyakran emelődik 20q13-on mellrákban (Krig et al., 2010). A cinkujjfehérjék egészében gazdagodtak a VRAA génkészletben (1,6-szoros dúsulás, P = 0,01).

1226 olyan gén létezik, amelyek eltérően expresszálódtak az Ishak 0–2 stádiumú neopinetikus májban az Ishak 6. stádiumhoz képest (6. kiegészítő táblázat). Ezeket a géneket funkcionálisan dúsítottuk három májrákkal kapcsolatos aláírás esetén (7. kiegészítő táblázat). Az Ishak fibrózis fázishoz kapcsolódó gének kissé átfedésben vannak a VRAA génkészlet génjeivel, és csak 26 közös gént azonosítottak (8. kiegészítő táblázat).

Azt is meghatározták, hogy ezek a differenciáltan expresszált gének gazdagodnak-e bármilyen kromoszóma-helyzetben. A VRAA géneket dúsítottuk a chr19, chr16 és chr3 régiókban (P

A daganat sejtenként kevesebb cccDNS-kópiával rendelkezett, mint a neoplasztikus máj. Ennek oka lehet a tumorsejtek osztódásával történő hígítás. A plazminogén urokináz aktivátor/súlyos kombinált immunhiány (SCID) egérmodelljében a hepatocita proliferáció cccDNS veszteséget indukál (Lutgehetmann és mtsai, 2010). Kacsa modellen végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a vírusellenes terápia nagyobb mértékű cccDNS-csökkenést indukál magasabb hepatocita proliferációjú állatokban (Addison és mtsai, 2002). Adataink arra is utalnak, hogy a sejtosztódás szerepet játszik a cccDNS kópiaszám szabályozásában, mivel kiderült, hogy a kis daganatok magasabb cccDNS kópiaszámot tartalmaznak, mint a nagy daganatok; és kis daganatos betegeknél a daganatban lévő cccDNS kópiaszáma nem különbözött a párosított, nem neoplasztikus máj számától.

A daganat alacsonyabb cccDNS-szintjének megfigyelése összhangban áll a HBV-HCC-ben szenvedő 42 beteg közelmúltbeli jelentésével (Wang et al., 2013a), de különbözik egy korábbi, 25 HBV-HCC-ben szenvedő betegtől, akiknek magasabb a kópiaszáma daganatos cccDNS mint tumoros májbetegek (Wong és mtsai., 2006). Az előző vizsgálathoz képest a különbségek okai nem egyértelműek, bár tanulmányunk számszerűsítette a HBV DNS és a cccDNS sejtenkénti kópiaszámát azáltal, hogy az összes mintában mérte és normalizálta az albumin kópiaszámot, és nem számolta ki a sejtszámot 6,667 becslés alapján. pg genomiális DNS sejtenként (Wong és col., 2006).

Korábbi retrospektív vizsgálataink kimutatták, hogy a vírusreplikációs aktivitás a neoplasztikus májban a műtéti reszekció utáni gyenge teljes túléléssel jár, de nem a megismétlődésmentes túléléssel. Ez a jelenlegi tanulmány több szempontból különbözik ettől a tanulmánytól. Ez a jelenlegi vizsgálat 2008 és 2013 között műtéti reszekcióval rendelkező betegeket tartalmazott, míg az előző vizsgálat 1991 és 2008 között vett részt. Néhány különbséget is meg kell jegyezni, például a jelenlegi daganat kisebb méretét (4, 3 ± 3, 6 vs. 7,3 ± 5, 0 cm). Ebben a jelen vizsgálatban a vírus DNS-ét friss műtéti reszekcióval mértük, míg az előző vizsgálatban a vírus DNS-t archivált paraffin blokkokból izolált DNS felhasználásával mértük. Mindezen különbségek ellenére ez a jelenlegi tanulmány megerősíti korábbi megfigyeléseinket, miszerint a vírusreplikációs aktivitás korrelál a HAI és Ishak stádiummal, és hogy a magas vírusreplikációs aktivitás rossz eredménnyel jár. Mivel ezeket a betegeket továbbra is figyelemmel kísérik, a vírusreplikációs aktivitás hatását a kiújulásmentes túlélésre és a teljes túlélésre tovább értékeljük.

Összefoglalva, ez a tanulmány az intracelluláris HBV DNS, a cccDNS és a vírus replikációs aktivitásának közvetlen összehasonlítását nyújtja tumorban és nem plasztikus májban. Az adatok azt mutatták, hogy a nem neoplasztikus májban a magas replikációs aktivitás a HCC megújulásának magasabb arányával jár együtt az Ishak fibrózis stádiumától eltérő és attól független mechanizmusok révén.

A változások története

További információ

Word dokumentumok

Kiegészítő anyagok és módszerek

PDF fájlok

1-8. Kiegészítő táblázatok

Ez a munka a szerződés közzétételére vonatkozó szabványos licenc alapján jelenik meg. 12 hónap elteltével a munka szabadon elérhetővé válik, és a licencfeltételek nem nyilvános Creative Commons Nevezd meg-Nem-kereskedeled-Oszd meg 4.0-s licencre váltanak.