elemeket
absztrakt
A keratinociták és a fibroblasztok a növekedési faktorok és a citokin 9 szekrécióján keresztül kommunikálnak. A sebgyógyulás során a sebágyban lévő fibroblasztok szekretálják a keratinocita növekedési faktort (KGF), ami kiváltja a keratinocita proliferációt, ami megkönnyíti a reepithelializációt 10. Ezenkívül a KGF-1 exogén expressziója genetikai diabéteszes egérmodellek excíziós sebjeiben javította a sebgyógyulási arányt és az epithelializációt 11. Megállapították, hogy a 12-O-tetradekanoil-forbol-13-acetát (TPA) által kiváltott hámsejtek proliferációja és a helyi gyulladás csökkent proliferáló fibroblaszt 12 hiányában. Röviden: a fibroblasztok fontos szerepet játszanak a keratinocita proliferációhoz szükséges növekedési faktorok szekréciójában a bőr sebgyógyulási folyamata során.
A sejtvándorlást, az adhéziót, a morfológiát, a növekedési faktor szekrécióját, a szaporodást és az egyéb kritikus sejtes folyamatokat az aktin citoszkeleton szabályozza 13. N-WASP (Neural-Wiskott Aldrich-szindróma szindróma) fehérje, amely mindenütt expresszálódik, és az Arp2/3 komplexen keresztül 14 átalakuló aktin citoszkeletális átalakulásának kritikus szabályozója. A fibroblasztok N-WASP hiánya csökkent sejt-ECM adhézióhoz és fokozott sejtmotilitáshoz vezet 15. Az N-WASP szabályozza az invadopodia 16 képződését az Src 17, 18-val transzformált fibroblasztokban, és a 19-et vagy a clathrin-függő független endocitózist 20 érinti. Ezenkívül az N-WASP kritikus szerepet játszik az RNS-polimeráz-II-függő transzkripció szabályozásában, az RNS-feldolgozásban és a DNS-javításban a PSF-NonO 21 komplexszel való kölcsönhatás révén. Megállapították, hogy az N-WASP expresszió alacsonyabb az emlőrákos sejtekben 22, míg a májsejtes karcinómában 23 .
Az N-WASP-hiányos egereknél rendellenességek voltak az idegcső kialakulásában, a szív differenciálódásában és a mezodermában, és az E11.5 24, 25 embrió szakaszában pusztultak el. Az N-WASP expresszió feltételes elutasítása az egér agyában súlyos hydrocephalushoz és koraszülés utáni halálhoz vezet 26. Az N-WASP szintén kritikus a T-sejtek fejlesztése szempontjából 27. Az N-WASP expresszió feltételes ablációja a keratinocytákban fekélyhez, alopeciához és markáns epidermális hiperproliferációhoz vezet. Ez a szőrtüsző megszakadt ciklusának oka a fokozott TGFβ 28 jelátvitel vagy a csökkent Wnt 29-függő transzkripció volt. .
az eredmény
Az N-WASP expressziójának elvesztése dermális fibroblasztokban epidermális hiperproliferációt okozott idős egerekben
( A ) Az N-WASP 3. és 4. exon deléciójának genomiális PCR-elemzése kontroll és N-WASP FKO egerekből izolált dermális fibroblaszt sejtekben. ( B ) Elszigetelt egerek dermális fibroblaszt sejtjeinek N-WASP expressziójának Western blot-analízise 13 hetes korban. (Megjegyzés: az egér bőrének fibroblasztjainak izolálására alkalmazott módszerünkkel több mint 80% -os tisztaságú fibroblaszt populációt értünk el, ez más sejttípusok kis populációját is tartalmazza). ( C ) H & E festett háti bőrrészek 13 hetes és 1 éves egerektől. Az epidermális mennyiségi meghatározása ( D ) és bőrön keresztül ( E ) kontroll és N-WASP FKO egérbőr szakaszok vastagsága. Az N-WASP FKO egereknek kettőnél több epidermális rétege van a kontroll egerekhez képest. ** Képviseli p
( A ) Az E-kadherin megoszlása a kontroll és az N-WASP FKO egerekben normális volt, de az N-WASP FKO egerek több epidermális sejtréteget mutattak. Piros: DAPI ( B ) Az epidermális proliferáció 13 hetes és 1 éves kontroll és N-WASP FKO egerek paraffinba ágyazott háti bőrszakaszainak PCNA-immunfestésével mérve. Kék: DAPI ( C ) N-WASP FKO egerekben történő mennyiségi meghatározással megnövekedett számú PCNA pozitív sejtet/MF-t azonosítottunk. * P FKO egereket képvisel. Az N-WASP FKO egerek megnövekedett PCNA expressziót mutattak a bőrben a kontroll egerekhez képest.
Teljes méretű kép
Az N-WASP FKO egereknek nincs bőrgátló funkciója
A bőrgát működésének elemzéséhez a bőr egy részét izoláltuk a kontroll és az N-WASP FKO egerekből, és Lucifer sárga színnel inkubáltuk az epidermiszen. Ezután a bőr egy részét szövettani festéssel elemeztük, hogy fluoreszcens mikroszkóppal szemléltetjük a Lucifer sárga jelenlétét. Mind a kontroll, mind az N-WASP FKO esetében a fluoreszcens festék az epidermisz külső rétegére korlátozódott, ami azt jelzi, hogy az N-WASP FKO egereknél (3A. Ábra) nem volt nyilvánvaló hiba az epidermisz bőrzáró funkciójában. A keratinocita differenciálódást az N-WASP FKO és a kontroll egerekben immunfluoreszcens festéssel elemeztük korai és terminális differenciálódási markerek (keratin 10, involucrin, transzglutamináz) szempontjából. Nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget a differenciációs markerek festési mintázatában a kontroll és az N-WASP FKO egerek között, de vastagabb réteg festődött a keratin 10, involucrin és transzglutamináz sejtek között. Ez arra utal, hogy az N-WASP deléciója a dermális fibroblaszt sejtekben nem változtatja meg az epidermális sejtek differenciálódását (3B. Ábra).
( A ) Kis frissen izolált bőrrészeket elemeztek a Lucifer sárga behatolási teszthez. Az N-WASP FKO egereknél a permeabilitási gát funkcióját nem befolyásolta. ( B ) Egy 13 hetes kontroll és N-WASP FKO egér bőrét korai (keratin 10, transzglutamináz) és terminális (involurin) differenciálódási markerekkel festettük. Nem figyeltünk meg nyilvánvaló különbségeket a differenciációs markerek expressziójában a kontroll és az N-WASP FKO egerek között. Piros: DAPI.
Teljes méretű kép
TPA által kiváltott hiperproliferatív válasz
A stressz alatti bőrreakció vizsgálatához a kontroll és az N-WASP FKO egerek bőrét helyileg 12-O-tetradekanoil-forbol-13-acetát-észter (TPA) észterrel kezeltük. Egy 6,5 nM/50 μl TPA 24 órás egyszeri kezelése a háti bőrön várhatóan mind a kontroll, mind az N-WASP FKO egerek epidermiszének jelentős megvastagodását eredményezte a hordozóval kezelt egerekhez képest (4A, B ábra). . A TPA-val kezelt bőrszakaszok szövettani elemzése fokozott hiperproliferatív hatást mutatott az N-WASP FKO egér bőrén a standard alanyokhoz képest. (4A. Ábra), a PCNA-pozitív proliferáló keratinociták számának egyidejű növekedésével az N-WASP FKO egér bőrében (4C. Ábra). A stressz által kiváltott (TPA-val kezelt) N-WASP FKO egér bőrében nem találtunk változást az epidermális sejt sejtjeiben, mert az E-kadherin lokalizációja és mintázata összehasonlítható volt a TPA-val kezelt kontroll egér bőrével (4D. Ábra). Így a TPA kezelés fokozott epidermális sejtek hiperproliferációját eredményezte az N-WASP FKO egerekben a kontroll egerekhez képest.
( A ) A kontroll és az N-WASP FKO egerek oldószerének (aceton) és TPA (24 óra) szövettani elemzése H&E festéssel. ( B ) Az acetonnal és TPA-val kezelt háti egerek epidermális vastagságának meghatározása. Az N-WASP FKO egerek bőre lényegesen vastagabb, mint a kontroll egerek TPA kezelést követően. ( C ) TPA-val kezelt egerek bőrének immunfestése a PCNA-pozitív sejtek elemzéséhez. Az N-WASP FKO egerek bőre szignifikánsan nagyobb számú PCNA-pozitív epidermális sejtet mutatott a kontroll egerek bőréhez képest. ( D ) Sejt-sejt kapcsolat elemzés E-kadherin festéssel TPA-val kezelt egerekben.
Teljes méretű kép
Az N-WASP expressziójának elvesztése a dermális fibroblasztokban a seb gyorsabb lezárásához vezet
A dermális fibroblasztok fontos szerepet játszanak a sebgyógyulásban és a szövetek helyreállításában 30. A bőr fibroblasztjainak N-WASP hiányának a szövetek helyreállítására gyakorolt hatásának meghatározásához sebgyógyulási tesztet végeztünk 13-15 hetes kontrollokon és N-WASP FKO egereken. Az egereket teljes vastagságú kivágási sebeknek vetették alá, és az egerek sérült területét lefényképezték és számszerűsítették a megjelölt időpontokban (5. ábra). Az N-WASP FKO egerek szignifikánsan gyorsabb sebzáródást mutattak a sérülés után 2, 5 és 7 nappal a kontroll egerekhez képest (5A, B ábra). Ezenkívül szignifikánsan csökkentett sebátmérő (nyilakkal ábrázolva) volt megfigyelhető a 7. napon N-WASP FKO egerekben (5C. Ábra, D). Az N-WASP FKO egerek gyorsított sebgyógyulási fenotípusának jellemzésére a sérülés után a 7. napon PCNA festést végeztünk a bőrszakaszokon. Az N-WASP FKO egerekben szignifikánsan nagyobb számú PCNA pozitív sejtet találtunk mind a dermális, mind az epidermális területeken a kontroll egerekhez képest (5E. Ábra). Ez arra utal, hogy a sérülés után a bőr/epidermális bőrsejtek proliferációjának megnövekedett sebessége elősegíti a seb gyorsabb bezáródását az N-WASP FKO egerekben. .
Az N-WASP FKO egerekben fibroblasztok és kollagénszint emelkedett
A sebgyógyulás egy többlépcsős folyamat, amely gyulladásos, proliferációs és érési fázist foglal magában 32. Annak megállapítására, hogy a gyulladásos válaszok különbségei hozzájárulhatnak-e az N-WASP FKO egerek fokozott sebgyógyulásához, a limfocita (CD3/CD4) és a neutrofil (Ly-6G antigén) festést végeztük a granulációs szövetben. Az N-WASP expressziója nem változtatta meg jelentősen a sérült szövet neutrofil sejtek megszerzésének képességét, de mérsékelten fokozta a limfociták toborzását (S4A ábra). Ezenkívül bazális körülmények között a kontroll és az N-WASP FKO egerek bőrének nagyon alacsony volt az immunsejt tartalma (az adatokat nem mutatjuk be). A gyengén gyógyuló sebek fő jellemzője a tartós gyulladásos válasz a sérülés helyén 33. Annak ellenére, hogy az immunsejtek az N-WASP FKO egerek sebeibe beszivárogtak, a seb gyorsabban záródott le, ami arra utal, hogy az N-WASP FKO egerekben a gyulladás valószínűleg nem járul hozzá a sebek gyorsabb gyógyulásához.
Teljes méretű kép
A TGFβ jelátvitel fokozódik az N-WASP FKO egér bőrén
Az N-WASP FKO egerek granulációs szövetében a magasabb kollagéntartalom jelezte a növekedési faktor szekréciójának fokozásának lehetőségét. Ezenkívül a fibroblasztok és a keratinocyták közötti áthallás szekretált növekedési faktorok révén történik, amelyek nélkülözhetetlenek a sebgyógyulás során. A fibroblaszt növekedési faktor (FGF) család tagjai az FGF7/KGF mellett széles mitogén spektrummal rendelkeznek, amely a hámsejtek specifikus mitogénje 38. Az FGF7 expressziójának elemzése az FGF7 festés növekedését mutatta az N-WASP FKO egér bőrében (6E. Ábra). Ezenkívül a pro-gyulladásos citokin IL-1α enyhe növekedését figyelték meg az N-WASP FKO egerek bőrén (S4B ábra). Kimutatták, hogy az N-WASP expressziója keratinocitákban szabályozza a TGFβ 28 jelátvitelt. Ezen információk alapján elemeztük a TGFβ jelátvitelt kontroll egerek és N-WASP FKO egerek bőr lizátumával. Az N-WASP FKO egerek magasabb TGFβ-RII, Samd2/3, TAK1 és aktivált formáik (p-Samd2/3, pTGFβ-RII) szintjét fejezték ki (6F. Ábra, S4C). Eredményeink azt sugallják, hogy az N-WASP expresszió törlése a dermális fibroblasztokban a fibroblasztok számának növekedéséhez vezet, ami megnövekedett kollagéntartalomhoz és növekedési faktor/citokin szekrécióhoz/fokozott TGFβ jelátvitelhez vezet, ami epidermális hiperproliferációhoz és gyorsabb sebgyógyuláshoz vezet az N-WASP F-ben egerek.
vita
Az N-WASP, a WASP fehérjecsalád tagja, az Arp2/3 komplex aktivitásának szabályozásával szabályozza az aktin polimerizációt 14. Az N-WASP mindenütt expresszálódik, és az N-WASP knockout egerek embrionális halálosak voltak, ami arra utal, hogy az N-WASP a 24, 25 egerek kifejlődése során elengedhetetlen gén. Az N-WASP kiütési embriókról kiderült, hogy túlélik a gasztruláció előző szakaszában, és megkezdték az organogenezist, de az embrionális 12. nap előtt idegcsövekkel és szívhibákkal 25 haltak meg. Így számos tanulmány a lox P-Cre rendszert használta kondicionált N-WASP knockout egerek előállítására, hogy tanulmányozzák az N-WASP szerepét a különböző szövetekben. Az N-WASP feltételes eliminációja az izmokban Myf5-cre és MyoD-cre-vel posztnatális halált eredményezett 39. Hasonlóképpen, az N-WASP feltételes kiütése az agyban a Nestin-cre segítségével posztnatális halálhoz vezetett, valószínűleg a hydrocephalus okozta 26. Két kutatócsoport feltételes knockout egereket generált, amelyek N-WASP-t expresszáltak ablatálódva keratinocitákban, K5-cre 28, 29 alkalmazásával, de két csoport ellentétes szerepről számolt be az N-WASP-nek a keratinocitákban. Leferver és mtsai. kimutatta, hogy az N-WASP expresszió hiánya a keratinocytákban csökkent keratinocita növekedést okozott, míg Lyubimova és mtsai. kimutatta, hogy az N-WASP hiány epidermális hiperproliferációhoz vezet 28, 29 .
Megállapítottuk, hogy a fibroblasztokban található N-WASP döntő szerepet játszik a sejt-ECM 15 tapadásában. Az N-WASP fibroblasztokban betöltött szerepének jellemzésére a bőr fejlődésében és fenntartásában létrehoztunk olyan egereket, amelyeknek hiányos volt az N-WASP expressziója a fibroblasztokban, az Fsp-cre segítségével. N/WASP genotípusú fl/fl egerek; Az Fsp-cre, N-WASP FKO Mendel genetikája után született, és a laboratóriumi növekedéstől számított 1 éven belül nem mutatott rendellenességet. Nem figyeltünk meg fizikai rendellenességeket vagy csökkent szexuális energiát az N-WASP FKO egerekben a kontrollokhoz képest (az adatokat nem közöljük).
Anyagok és metódusok
szövettan
Sebgyógyító teszt
13-15 hetes kontroll egereket (n = 16) és hím N-WASP FKO egereket (n = 16) ketamin/xilazin (90 μg/10 μg) alkalmazásával altattunk. Az egereket a hátára borotválták és alkohollal megtisztították. Minden egér esetében (legalább 1 cm-es sérülés nélküli bőrrel elválasztva) két teljes vastagságú körsebet (átlagos átmérője 10 mm átmérőjű) két csipesszel és ollóval készítettünk a dorzális oldalon, csipesszel és ollóval a dorzális oldalon. az alsó izom károsodása . a 62., 63. leírások szerint. A sebeket a fertőzés megakadályozása érdekében okkluzív kötéssel (Tegaderm; 3M TM) borítottuk be. A sebeket skála segítségével digitális fényképezőgéppel fényképeztük a sérülés után a 0., 2., 5. és 7. napon. A seb területét imageJ szoftverrel határoztuk meg, és a seb bezáródási sebességét a seb területének a kezdeti sebmérethez viszonyított százalékában határoztuk meg. A sebészi vizsgálathoz szükséges bőrbiopsziákat minden sebből a műtét után a 0. és a 7. napon végeztük. A kollagén láthatóvá tétele érdekében a bőr egyes részeit trichrom masonnal festették (kat. Sz .: 25088A-F, Polysciences Inc.).
TPA által kiváltott hiperproliferáció
A kontroll egereket 13-15 hetes korban és az N-WASP FKO egereket 24 órával a borotválkozás előtt a TPA-t (6,5 nM/50 μl oldószerben (acetonban)) a háti bőrre helyeztük. Az egereket 24 órán át tartó TPA-kezelés után feláldoztuk; a bőrt izoláltuk, 4% paraformaldehid/PBS-ben rögzítettük 4 ° C-on egy éjszakán át, és paraffinba ágyazottuk a szövettani metszetekhez. A metszeteket hematoxilinnal és eozinnal, PCNA és E-kadherin antitestekkel festettük.
Lucifer sárga penetrációs teszt
A Lucifer sárga behatolási teszthez 1 mM lucifer sárga színt (háti bőr, epidermális oldal) öntöttünk óvintézkedésekkel 1 cm 2 méretű bőrszövetre (háti bőr, epidermális oldal), mert a festék nem tudott áthaladni a bőr bőrén. 1 órán át 37 ° C-on végzett inkubálás után a bőrt alaposan PBS-sel mostuk, és a bőrt felszeleteltük. A kriozekciókat DAPI-val festettük és fluoreszcens mikroszkóppal elemeztük.
Kollagén gél összehúzódási teszt
A kísérletet a fent leírtak szerint hajtottuk végre, néhány módosítással 64. Az N-WASP WT és N-WASP KO egér embrionális fibroblaszt sejteket DMEM/10% FBS tápközegben tartottuk. Az N-WASP WT és az N-WASP KO MEF egy kedves ajándék a Scott B Snapper lab 25-től. Egér embrionális fibroblaszt sejteket tripszinezünk, megszámlálunk, és 200 000 sejtet adunk 0,5 mg/ml Corning Rat Tail Collagen I oldathoz (Corning, USA). Az elegy semlegesítéséhez azonnal hozzáadunk 1 μM NaOH-t. Az egész keveréket azonnal egy 24-lyukú lemezre vittük át. A gélt 37 ° C-os CO 2 inkubátorban állni hagytuk 3 órán át. A gél megszilárdulása után teljes DMEM-et adunk hozzá. Szilárd kollagén gélt választunk el a kút oldalától. Előhígított TGFβ1-et adtunk hozzá, hogy elérjük a 4 ng/ml végkoncentrációt. A teljes táptalajt 24 óránként megújítottuk TGFβ1-t tartalmazó teljes DMEM alkalmazásával. A képet 24 óránként ImageJ alkalmazásával, 0 órától kezdve számszerűsítettük. A képeket úgy készítettük, hogy a gélt tartalmazó 24 lyukú lemezt egy fénydoboz fölé helyeztük, a vonalzóval a gél mellett, a pixelméret kalibrálásához.
Statisztikai analízis
A szignifikancia statisztikai elemzéséhez párosítatlan tanulói t-tesztet és p-értéket végeztünk