elemeket

absztrakt

A fő

A legtöbb petefészekrákkal diagnosztizált, standard protokoll szerint kezelt nő meghal a betegségében, 1 és az eredmények az elmúlt két évtizedben minimálisan javultak. Előrelépés történt a petefészekrák altípusba sorolásának morfológiai kritériumainak javításában, és a diagnosztikai reprodukálhatóság a közelmúltban kiváló reprodukálhatósági szintre emelkedett. A petefészekrák 5, 5 fő altípusa (serózus, tiszta, endometrioid, mucinous és serous), amelyek morfológiai kritériumok alapján azonosíthatók, genetikai kockázati tényezők, prekurzor elváltozások, molekuláris változások a megjelenés szakaszában és klinikai viselkedés, 3, 5, 6, 7, és a legjobban különböző betegség-entitásoknak tekinthetők. A petefészekrák altípusai közötti kemoszenzitivitási különbségek miatt felhívás van szükség altípus-specifikus klinikai vizsgálatokra, amelyek célja hatékonyabb terápiák azonosítása a hagyományos platina/taxán kemoterápiával szemben rezisztens altípusok (azaz tiszta sejtek, mucinos) esetében. 9, 10, 11

modern

Nemrégiben kimutatták, hogy a neoadjuváns kemoterápia, majd a bontó műtét hasonló eredményeket hoz, mint a posztoperatív kemoterápia előrehaladott petefészekrákban szenvedő betegeknél, csökkentett morbiditás, rövidített műtéti idő és gyorsabb műtét utáni gyógyulás előnyével. A neoadjuváns kemoterápia hatékony erősen serózisos rákos megbetegedések esetén, másoknál azonban nem. Amikor a neoadjuváns kemoterápiát csak a petefészekrák egy meghatározott altípusának adják, kérdéseket vet fel, hogy mennyire megbízhatóan diagnosztizálható az altípus korlátozott mintákon, például nukleáris biopsziás mintákon vagy finom tűbiopszián. Bár a kiváló reprodukálhatóság akkor lehetséges, ha a diagnózis egy jól összegyűjtött daganat több tárgylemezének vizsgálatán alapszik, 4 nincs bizonyíték arra, hogy hasonló reprodukálhatóság lehetséges volna egy kis tumorminta alapján. Nemrégiben kimutattuk, hogy a petefészekrák főbb altípusai jelentősen különböznek a biomarkerek 8 expressziós profiljától, ami arra utal, hogy a biomarker expresszió hasznos lehet az altípusok diagnosztizálásában. Ezért kerestük a legkisebb immunohisztokémiai biomarkerek paneljét, amely a petefészekrák öt fő altípusának diagnosztizálásához mutatta a legnagyobb érzékenységet és specifitást.

Anyagok és metódusok

Etikai megállapítás

A csoportok e vizsgálatra való felhasználásának jóváhagyását a British Columbia Cancer Agency Etikai Kutatási Tanácsa és a British Columbia Egyetem szerezte.

Tanulmányi csoportok és felvételi kritériumok

Ez a tanulmány három független kohortot használ, kettőt prediktív egyenletek előállítására, egyet pedig a prediktív egyenletek validálására (1. ábra).

A vizsgálat kísérleti felépítése részletesen leírja a markerek immunohisztokémiai paneljének független felfedezését két, egymással nem összefüggő kohorszból, az κ (κ) statisztikai érték által képviselt előrejelzés pontosságát és a belső validálást.

Teljes méretű kép

Az első kohorsz, a továbbiakban archív kohorsz, összesen 500 formalinnal fixált petefészekrákos paraffinszövetet tartalmazott egy korábban leírt retrospektív kohorszból, az 1984 és 2000 között diagnosztizált brit columbiai populáció alapján. Ezek a minták> 20 British Columbia kórházak., rögzítés vagy minta feldolgozás szabványosítása nélkül. Az elsődleges alkalmassági kritérium a kemonikus petefészekrák diagnosztizálása volt, a betegek a primer citoruktív műtétet követően mentesültek a makroszkopikus reziduális betegségtől, ami nem eredményezett makroszkopikus reziduális betegséget. Ez az esetdefiníció viszonylag nagy számú nem szeros rákot eredményezett, összehasonlítva azzal, amit egy minden petefészekrákos betegből álló sorozattól elvárnak. 6.

A második csoport (a továbbiakban tumorbank kohorszok) a Vancouveri Általános Kórház kórházi alapú nőgyógyászati ​​szövetbank-eseteinek egy csoportjából állt, és 2001 és 2008 között petefészekrákban diagnosztizált betegek 292 mintájából állt. Ezek a minták minőségi szöveteket képviselnek rövid devitalizációs idő és standardizált szövetrögzítés és -feldolgozás.

A harmadik csoport (a továbbiakban: validációs kohorsz) a petefészekrák fokozatosan diagnosztizált eseteiből állt össze, amelyeket öt kanadai központban figyeltek meg, és 2006 és 2009 között vett mintákat tartalmazott, amelyek egy nemrégiben végzett szövettani morfológiai vizsgálat részét képezték. 4

A tumor osztályozása

Az összes szövettani tárgylemezt kórosan megvizsgáltuk (CBG és MK), és az öt fő altípus egyikéhez (serózus, tiszta, endometrioid, mucinos, szerózus, szerózus) vagy máshoz (beleértve a kevert rákokat és ritka típusokat, például a differenciálatlan, laphám, rosszindulatú Brenner-daganat), osztályozatlan) a WHO nemrégiben leírt módosított kritériumai szerint. 3, 7, alacsony teljesítményű vizsgálatnál átmeneti növekedési modellt mutató karcinómákat, de a magas fokú szérum karcinóma egyéb jellemzőit, például hasadéktereket vagy mikrocisztás mintázatot a jó minőségű szerózus karcinóma variánsaként osztályozták, azaz szerosus carcinoma (átmeneti tünetekkel). A „petefészekrák öt fő altípusának egyike” -ként diagnosztizált összes esetet kizárták ebből a vizsgálatból. Ezenkívül meg kellett egyezni a megfigyelők között a hisztológiai altípus diagnózisáról a két értékelő patológus között. A meg nem felelés eseteit kizárták (a három esetsorból 873 esetből N = 98 (11, 2%)). Végül csak azokat az eseteket vetették alá statisztikai elemzésnek, ahol az összes immunfestékről teljes adatok álltak rendelkezésre (N = 138 a 775-ből (17,8%) nem rendelkeztek teljes adatokkal mind a 22 markerről, és kizárták őket).

Márka választás

immunhisztokémia

Három szöveti mikrosávot készítettünk a 13. leírás szerint reprezentatív daganat régiókból szövetréteg felhasználásával (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, USA, és Pathology Devices, Westminster, MD, USA). Minden egyes donorblokkból két 0,6 mm átmérőjű magot eltávolítottunk és átvittünk a recipiens blokkba.

A 4 μm vastag metszeteket kivágtuk és a vágást követő 2 héten belül megfestettük. A végső kilenc markerből és a festési eljárásokból származó antitestek részleteit az 1. táblázat mutatja. Függetlenül két patológus (MK vagy BG) vizuálisan értékelte ezeket a biomarkereket digitalizált képek alapján (BLISS szkenner, Bacus Laboratories/Olympus America, Lombard, IL, USA) ). Valamennyi biomarkert pozitívnak vagy negatívnak értékeltük, a sejtek több mint 1% -ának pozitív határértékét használva (2. ábra), kivéve a CDKN2A-t, amelynél a pozitív festődést úgy határoztuk meg, hogy az erős citoplazmatikus és magfestést mutató tumorsejtek> 75% -a meghatározott. korábban, a 24 és a TP53, ahol háromlépcsős pontozási rendszert alkalmaztak (teljes hiányzás - 0, 1-50% - 1 és 50% - 2 pontszám) annak bizonyítéka miatt, hogy a 2. és a 0. pont korrelál az alapmutációkkal, míg az 1. pontszám korrelál a vad típusú TP53 25-gyel (3. ábra). Az esetek kevesebb, mint 5% -a mutatott ellentmondást a két pontozó patológus között, és magasabb pontszámokat használtak ezekre az esetekre.

Asztal teljes méretben

Reprezentatív immunfestékek a DKK1, HNF1B, MDM2, PGR, TFF3, VIM, WT1 esetében. A negatív (0. pont) és a pozitív (1. pont) közötti határokat vastag függőleges vonal jelzi.

Teljes méretű kép

Reprezentatív immunfestékek a CDKN2A-hoz és a TP53-hoz. A levágásokat vastag vonal jelzi. A CDKN2A esetében a 0 pontszám negatív vagy gyenge pozitív festés, míg az erős pozitív festés 1. pont. A TP53-at háromrészes pontozási rendszer alkalmazásával értékelték: 0-negatív, 1-gyenge pozitív, 2-pozitív. A pontozással kapcsolatos részletekért lásd: Anyagok és módszerek.

Teljes méretű kép

Statisztikai analízis

Készenléti elemzést és Pearson 2. statisztikáját (kiigazítatlan P értékekkel) alkalmaztuk az expressziós heterogenitás tesztelésére az egyes biomarkerek esetében az archív és a tumor kohorszok között az egyes altípusokon belül. A valódi regressziós logó modellmodell modellezésével modellmodellt használtunk prediktív egyenletek létrehozására, amelyek a 22 marker egész paneljén indulnak. Az adott marker kizárásának kritériuma a valószínűségi arány teszt legnagyobb P-értékén alapult. A modell előrejelzéséhez a vevő-vevő jelleggörbéjét a görbe alatt (AUC)> 0,95 határoztuk meg, mint a kívánt eredményt az egyes szövettani típusokhoz e vizsgálat céljából.

A prediktív egyenletek validálását egy végső immunhisztokémiai panel alkalmazásával végeztük el a validációs kohorszon, hogy megjósolt szövettani altípusokat állítsunk elő, amelyeket összehasonlítanánk a hisztopatológiai altípus konszenzusával. Az az altípus, amelyet a modell valószínűnek tart, még akkor is, ha a valószínűség 27 volt

az eredmény

Az archív, a tumor bankok és az validációs fájlok alapvető klinikai paramétereit és morfológiailag kiértékelt altípus-diagnózisait a 2. táblázat tartalmazza. A mind a 22 immunjelzőre vonatkozó értelmezhető festési eredmény követelménye miatt a 314 predikciós egyenlet előállításának végső száma az archív csoportra vonatkozott. és 242 a tumorbank kohorsznál. A daganat altípus gyakorisága alapján nem volt különbség a mellékelt és a kizárt esetek között.

Asztal teljes méretben

Az archív és a tumor banki kohorszok esetében az eredeti, a petefészekrák altípusokban különböző módon expresszált 22 markert tartalmazó panelt teljes modellillesztésnek vetették alá, fokozatosan nominális logisztikus regressziónak a hátsó elimináció segítségével. A hátsó eliminációs folyamat leállítási kritériuma annak biztosítása volt, hogy a vevő működési jellemzője a görbe alatt (ROC AUC) ≥0,95 legyen minden altípusnál. Ez az iteratív folyamat ugyanazt a kilenc markert tartalmazó panelt biztosította, függetlenül mind az archívum, mind a tumor kohorszaiból. bankok (1. ábra). Mindkét egyenletet a hisztológiai altípus megjóslására használták a saját kohorszukban az érzékenység, a specificitás, a vevő működési jellemzőinek a görbe alatt (ROC AUC) és Cohen K (κ) együtthatójának felhasználásával. Összességében az egyenletek kiváló munkát végeztek az altípus konszenzus hozzárendelésének előrejelzésében mind az archív (κ = 0, 88 ± 0, 02), mind a tumorbankok (k = 0, 86 ± 0, 04) esetében (3. és 4. táblázat).

Asztal teljes méretben

Asztal teljes méretben

Az alacsony fokú predikció pontosságát úgy teszteltük, hogy mindkét predikciós egyenletet alkalmazzuk egy 10 szerosus határdaganatra, és kimutattuk, hogy az archív predikciós egyenlet 10 esetből 9-et alacsony sorosú szerotnak minősített, amelyek közül az egyiket magasnak minősítették. - szerózus szérum, míg a tumorbank egyenlet 10 esetben 1-et alacsony fokú, a 10-ből 3-at serózus szerotként és 10-ből 6-ot endometriumba sorolt. Ezek az eredmények arra késztettek minket, hogy levezessük a tumorbank predikciós egyenletét, és új predikciós egyenletet hozzunk létre ennek a kohorsznak, amely csak négy altípus (serózus, tiszta sejt, endometriid, mucinous) alapján történik, vagyis nem próbálunk különbséget tenni a serosus és a magas szintű betegség között. . fokú serózus. Ez csekély hatással volt a maradék négy altípus jóslási pontosságára (5. táblázat).

Asztal teljes méretben

Ezután a modelleket keresztvalidáltuk a második kohorszhoz képest (6. táblázat). Az archív és a tumor kohorszok predikciós egyenletei közötti különbség meghatározásához szövettanilag specifikus heterogenitási vizsgálatokat végeztünk a teszt és az validációs kohorsz mindegyik markerére. Ez a klinikai kohorthoz képest tendenciát mutatott a csökkent antigenitás irányában az archív csoportban, és ezt a legjobban szemlélteti például a HNF1B festési gyakoriság az endometrioid, a tiszta sejtekben és a mucinous altípusokban (7. táblázat). Ezzel szemben a magas fokú szérus altípusban a PGR eltérő festési gyakoriságot mutatott az ellentétes irányban, az archív és tumoros bankcsoportokban az esetek 35, 8 és 19,1% -a expresszálta a PGR-t (P

Logisztikai regressziós grafikonok, amelyek a helyes klinikai diagnózisok növekvő valószínűséggel növekvő hányadát mutatják be. ( a ) Levéltári jóslat a levéltári kohorszról, ( b ) az archívumok előrejelzése a daganatos bankok kohorszában, ( c ) tumorbank-előrejelzés az archív kohorszon, ( d ) tumorbank-előrejelzés a tumor kohorszaira, ( e ) tumorbank-előrejelzés a validációs kohorszról, ( f ) az érvényesítési kohorszra vonatkozó előrejelzések archiválása.

Teljes méretű kép

Megvizsgáltuk a differenciálatlan és osztályozatlan rákos megbetegedések kizárt eseteinek előrejelzési profilját. Mindkét előrejelzési egyenlet a differenciálatlan karcinóma 9 esetéből 9-et magas fokú szerózus típusnak minősítette. A klasszifikálatlan karcinóma öt esetét jósolták meg, hogy nagyon szerózus szerózus (3) és mucinos (2) az archív predikciós egyenlet és az endometrioid (2), a magas fokú szérum (1) és a mucinous (2) tumorbank predikciója segítségével. egyenlet. Mind a négy, átmeneti funkciójú szerosus carcinoma esetet (az Anyagok és módszerek szakaszban definiálva) mindkét predikciós egyenlet súlyosan súlyosnak minősítette.

vita

Ebben a tanulmányban olyan immunomarkerekből álló panelt dolgoztunk ki, amely pontosan meg tudja jósolni a petefészekrák egyik altípusát. Ez a marker panel könnyen alkalmazható a gyakorlatban, objektív molekuláris támogatást nyújtva a petefészekrákok osztályozásához, ezáltal megerősítve a hagyományos hisztopatológiai osztályozást.

A petefészekrák típusai a prekurzor elváltozások, a klinikai viselkedés, a molekuláris változások és a biomarkerek expressziója tekintetében változnak. 7, 8 Ami az emlőrákokat illeti, ahol az immunjelzők hozzájárulnak a daganat altípusok pontos diagnosztizálásához, és felhasználhatók a terápiás döntéshozatal irányítására, a petefészekrák esetében 28 specifikus daganatkezelési módot is javasoltak. Például a nyálkahártya vagy tiszta sejtes karcinómában diagnosztizált nőknél a kemoterápia hatástalan lehet, míg az előrehaladott, magas fokú szerózus karcinómában szenvedő nők számára előnyös lehet a neoadjuváns kemoterápia. A molekuláris eredmények beépítése a petefészekrákok osztályozásába növelheti a diagnózis reprodukálhatóságát és pontosságát, amely a jövőben egyre fontosabbá válik. Például a neoadjuváns terápiában, amely az előrehaladott petefészekrák kezelési lehetőségévé válik, a kezelés előtt az alapvető biopsziák vagy citológiai minták pontos beírására lesz szükség.

A tanulmány erősségei közé tartozik két nagy, független kohorsz használata, amelyek közül az egyik nagyobb arányban tartalmazta a kisebbségi altípusokat (tiszta sejt, endometrium és mucozus); ugyanaz a kilenc jelölőpanel származott 22 alkotójelölttől függetlenül ebben a két kohorszban. Egy harmadik független validációs kohortot is alkalmaztak, amely az altípusok gyakoriságát reprezentáló esetekből állt. 4, 6 Azok az esetek kiválasztásával elért morfológiai "aranystandard", amelyben két nőgyógyászati ​​szakorvos függetlenül állapodott meg egy altípus-diagnózisban, biztosította, hogy az esetdiagnózisok mindhárom esetsorban következetesek és a lehető legpontosabbak legyenek. Ezenkívül a reprodukálhatóság biztosítása érdekében korlátoztuk az IHC jelölt markereinket azokra, ahol a kereskedelemben kapható antitestek és egyszerű pontozási rendszerek használhatók.

A vizsgálat másik korlátja, hogy a tumorbank modell nem képes megkülönböztetni az alacsony fokú szerózus karcinómát és a magas fokú szerózisos karcinómát. Az alacsony minőségű szérum karcinómák a petefészekrák 3% -át teszik ki, ami megnehezíti a modell kidolgozásához elegendő eset megszerzését. Az alacsony fokozatú szérum karcinómával rendelkező szérum karcinómák sok esetben serózus határdaganatokból származnak, és nem a serózus gumós intraepithelialis karcinómák, nem társulnak csíra mutációkkal vagy BRCA1/2 szomatikus mutációkkal vagy TP53 mutációkkal, gyakran BRAF vagy KRAS mutációkkal rendelkeznek. nincsenek mutációi. válaszolnak a platina alapú kemoterápiára is, mint erősen serózisos karcinómák. Bár az alacsony fokozatú karcinómák és a magas fokú szerotin karcinómák újra diagnosztizálhatók, ha hisztopatológiai vizsgálathoz nagy szövetminták állnak rendelkezésre, a kis példányokban az alacsony fokú karcinóma és a magas fokú szerózisos karcinóma közötti különbség problematikus, és további fejlett. biomarkerek segítenek ebben a differenciáldiagnózisban.

Pillanatkép a petefészekrák altípus-előrejelző webkalkulátorról (COSP). A COSP felhasználható az általunk „archív” vagy „tumorbank” anyagnak. A felhasználónak kell meghatároznia, melyik egyenlet a legalkalmasabb a mintáihoz. A COSP alkalmazható egyetlen adagolásban vagy kötegelt programként a nagy retrospektív szöveti mikroarray kohorszok elemzésének lehetővé tétele érdekében táblázatos formátumban rögzített adatokkal.

Teljes méretű kép

A bonyolult tipizálás, amely tükrözi az alapvető tumorbiológiát és korrelál a terápiás reakcióval, segít javítani a petefészekrákban diagnosztizált nők klinikai kezelését.