elemeket
absztrakt
Az elhízás és a kapcsolódó anyagcsere-betegségek világszerte növekszik, míg az elhízás biztonságos és hatékony kezelése továbbra is megfoghatatlan. Mivel a táplálékfelvételt és a testsúlyt a központi idegrendszer (CNS) vezérli, a központi idegrendszer komplex mechanizmusainak megértése, amelyek szabályozzák az energiaháztartást, elengedhetetlenek a sikeres elhízás elleni terápiák felfedezéséhez.
A laterális hipotalamust (LH) történelmileg kritikus "etetési központként" ismerik, és erősen koordinálják az evést, az ivást és a testmozgást. Ennek a magnak az etetésszabályozásban betöltött kulcsszerepét talán a kétoldalú LH elváltozások által kiváltott mély afázia szemlélteti leginkább. 1, 2, 3, 4 Ezzel szemben az LH stimuláció étrendet indukál, még telített patkányokban is. Ezt a magot a homeosztatikus és a hedonikus etetésszabályozás közötti interfészként is tervezték. A patkányok türelmetlenül nyomják a kart, hogy stimulálják LH-jukat, ami azt sugallja, hogy maga az LH aktiválása is kifizetődő. 6, 7, 8
Az étel nagyon hatékony jutalmazó inger lehet. Az ételfogyasztást és a jutalmat részben az agy divergáló, részben átfedő magjai szabályozzák: azok a területek, amelyek reagálnak a hormonális és anyagcsere jelekre, amelyek a perifériából és az agy más részeiből származnak. 9, 10 A mezolimbikus neurocirkulátorok, különösen a ventrális tegmentális terület (VTA) és dopaminerg vetületei a nucleus accumbens-be (NAc), nagy figyelmet kaptak az ételjutalom idegi szabályozásában. 11, 12, 13 sejt, 7, 14, bár az is lehetséges, hogy a középső előagyi köteg stimulálása, amely a VTA-t az NAc-hez köti és az LH-t keresztezi, hozzájárulhat a koponyán belüli önstimulációs vizsgálatok potencírozó hatásához. Az LH-t glukagonszerű peptid-1 idegsejtek (GLP-1) és az LH-ban expresszált GLP-1R receptorok (GLP-1R) innerválják. 16 Ennek a közleménynek a javadalmazásra gyakorolt lehetséges hatásait nagyrészt nem vizsgálták.
Anyagok és metódusok
A hím és nőstény Sprague-Dawley patkányokat (érkezéskor 5 hetesek, Charles River, Sulzfeld, Németország) 12 órás világos/sötét ciklusban (07:00 órakor világos) helyeztük el az egyes ketrecekben, az ad libitum fonthoz való hozzáféréssel. Globális 16% fehérjés rágcsáló-étrend (2016), Envigo, Huntingdon, Egyesült Királyság) és a víz, hacsak másképp nem jelezzük. Valamennyi tanulmány etikai engedéllyel készült a Göteborgi Egyetem Állatvédelmi Bizottságától, az Európai Közösség törvényi előírásainak megfelelően (86/609/EGK rendelet). Minden erőfeszítést megtettek a szenvedés minimalizálása érdekében.
drogok
Az Ex4-et és az exendin-9 (Ex9) GLP-1R antagonistát (Ex9) a Tocris-tól (Bristol, Egyesült Királyság) vásároltuk, mesterséges cerebrospinalis folyadékban oldva (Tocris; hordozóanyagként használtuk) és aliquotokban tároltuk -20 ° C-on.
Agy kanülezése
A vezető kanüleket a fent leírtak szerint ültették be az LH-ba (a részletekért lásd a kiegészítő információkat). A kiválasztott koordinátákkal manipulációink/injekcióink következetesen elérték a centrális, laterális és dorzális LH-t. Az injekciók elérhetik a zona incerta-t is; azonban az LH-val ellentétben ez a régió nem fejezi ki a GLP-1R 16 értéket (S1 kiegészítő ábra).
Működési kondicionálás
A műtéti kondicionáló eljárással értékelhető a jutalom, ebben az esetben élelmiszer-jutalom szacharóz-pellet formájában történő elnyerésének motivációja (45 mg TestDiet, Richmond, IN, USA). A képzést és tesztelést a fenti 30., 31. és a kiegészítő információkban leírtak szerint hajtották végre. Az összes operatív válasz tesztet progresszív arányban (PR) hajtották végre.
Az LH GLP-1R farmakológiai aktiválásának vagy blokkolásának hatása az élelmiszer-bevitelre, a testsúlyra, a fizikai aktivitásra és az étellel motivált viselkedésre
A GLP-1R aktiváció hatásainak teszteléséhez 11 hetes patkányoknak Ex4-et (0, 05 vagy 0,15 μg) vagy vivőanyagot (mesterséges cerebrospinalis folyadék) injektáltunk, és a műtétre adott operatív reakciót 20 perccel az injekció beadása után teszteltük. Ezenkívül az északi ciklusnak az LH GLP-1R aktiválódására gyakorolt hatását különálló, 8 hetes nőstények csoportjában értékelték (lásd a további információkat). A GLP-1R blokád hatását vizsgáló kísérletek során a 11 hetesnél idősebb patkányokat egy éjszakán át éheztettük, majd 20 percig lisztet adtunk hozzájuk, és étkezés után azonnal Ex9-et (10 μg) injektáltunk. Ezt a tervet Hayes és munkatársai módosították. 32. és endogén GLP-1 felszabadulásának indukálására szolgál egy kontrollált étkezés során. A patkányokat 10 perccel az injekció beadása után műtéti alkalmassági feladatban teszteltük. Az élelmiszerkeresést úgy értékelték, hogy egy 60 perces operációs ülés során a fejfejek számát injektálták az etetési kamrába. Az operatív vizsgálat után 1 és 24 órával mértük a chuf bevitelt. Mindegyik kezelés kiegyensúlyozott volt, ahol minden állapotot 4 napos periódus választott el egymástól. A mozgásszervi aktivitást vízszintes infravörös sugarakkal mértük a műtőkamrákban (Med-Associates, Georgia, VT, USA).
GLP-1R leütés
A GLP-1R transzkriptumokat célzó rövid hajtű RNS-t (shRNS) használtuk a GLP-1R expressziójának elnyomására LH-ban (a részleteket lásd Schimdt és mtsai. Előzetes in vitro vizsgálatok azt mutatták - a GLP-1R expresszió 88% -os leütése az ezzel az shRNS-sel transzfektált patkány neuronok sejtvonalában. A GLP-1R expresszió in vivo elnyomására ezt az shRNS-szekvenciát klónozták és adeno-asszociált vírusba (AAV) csomagolták (1. szerotípus; titer = 5.22e12) a Pennsylvaniai Egyetem vírusmagjával együttműködve. Kimutatták, hogy ez a konstrukció 50% -kal csökkenti a GLP-1R expresszióját in vivo patkány VTA-ban. Kontrollként zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) expresszáló AAV-t (titer = 5,0e12) használtunk.
Az endogén GLP-1R szignalizáció funkcionális jelentőségének meghatározásához LH-ban patkányokat műtéti úton beültetünk egy LH-orientált vezető kanülre, a fentiek szerint. Miután a patkányok stabil szacharóz-motivált PR viselkedést értek el (9 hetes korban), az AAV-t expresszáló GFP-t (AAV-GFP) vagy a GLP-1R shRNS-t (AAV-GLP-1R-shRNS) adtuk kétoldalúan az LH-nak (0,5 μl per félgömböt 5 percig). A mikroinjektorokat az infúzió után 10 percig a helyén hagytuk, hogy lehetővé tegyük a diffúziót az injekció helyétől távol. Az egyes kezelési csoportokhoz kiválasztott patkányokat a testsúlyhoz, az élelmiszer-bevitelhez és az élelmiszer-növelési paraméterekhez igazították a PR-ben.
A testtömeget és a táplálékfelvételt naponta mértük az AAV konstrukció infúziója után, kivéve azokat a napokat, amikor koplalást vagy ételkorlátozást alkalmaztunk. A szacharóz beadásának motivációját az AAV injekciók után 3, 7 és 10 nappal a PR-séma alkalmazásával határoztuk meg. A 7. napon a patkányokat egy éjszakán át éheztettük annak megállapítására, hogy az LH GLP-1R szignalizáció hozzájárulása az étellel motivált viselkedéshez változott-e az éhezés állapotában.
Három héttel a vírusinjekciók után két kísérletet hajtottak végre, amelyekhez élelmiszer-korlátozás szükséges: az éhomi vércukorszint mérése, amelyet orális glükóz tolerancia teszt (intraperitoneális glükóz tolerancia teszt; a részletekért lásd a kiegészítő információkat) és egy éhomi/újratáplálási kísérlet.
Négy héttel az AAV injekció után lemérjük a zsírszövetet és eltávolítjuk az agyakat. Az agyakat boncoltuk, és LH, NAc és NTS-t gyűjtöttünk, hogy valós idejű kvantitatív PCR-rel értékeljük a GLP-1R expressziót (a részletekért lásd a kiegészítő információkat). Minden agyból LH-t (10 μm) tartalmazó koronális metszetet vettünk az AAV-injekciók helyes helyének ellenőrzésére a GFP fluoreszcencia megjelenítésével (reprezentatív helyet a 4. ábra mutat be).
Az első vizsgálat után egy másik kisebb patkánycsoportot (n = 20, 10 hím és 10 nő, 13 hetes korosztály) vontunk be annak megállapítására, hogy vannak-e nemi különbségek az LH GLP-1R leütés hatásaiban, és figyelemmel kísérjük a napi táplálékfelvételt és testtömeg megszakítás nélkül a tesztekben, amelyek egy éjszakán át tartó korlátozást igényeltek az első patkánycsoportban. Ezenkívül egy másik nőstény patkánycsoportot (n = 16) teszteltek annak érdekében, hogy tovább értékeljék az LH GLP-1R szükségességét fiatalabb nőknél, akiknél a testtömeg-növekedés gyorsabb volt, mint a 13 hetes nőknél; ezek a patkányok 9 hetesek voltak az AAV-shRNS infúzió idején.
Vírustraktus monitorozás és in situ hibridizáció
A kolera toxin B alegység injekcióit és az in situ hibridizációt a fent leírtak szerint hajtottuk végre. 33 További részletekért lásd a További információkat.
Az Ex4 vagy táplálás hatása az LH gén expressziójára
Négy hím egertől 8 hetes korban megörökített hipotalamusz idegsejteket alkalmaztunk a GLP-1R aktiváció neuronok LH neuropeptidekre gyakorolt hatásának értékelésére. Annak meghatározása érdekében, hogy az immortalizált hipotalamusz sejtvonalban megváltozottnak talált gének expresszálódtak-e LH-ban in vivo és megváltoztak-e zsír, étel vagy szacharóz lenyelésével, a patkányokat 1 hétig napi 1 órán át megfelelő étrendnek tették ki. minden másnap. Az agyakat eltávolítottuk, és az LH-t az utolsó etetés után azonnal feldaraboltuk. Ezután elemezték a génexpressziót (a részletekért lásd a kiegészítő információkat és a kiegészítő táblázatot). Minden takarmánycsoportban volt egy állat, amely 11, 12, 13 elfogyasztotta (1f-m. Ábra). A táplálékfelvétel visszaszorítása szintén nagyon hatékony volt (F (2, 26) = 11, 10; P 
A laterális hipotalamusz (LH) glukagon-szerű peptid-1 receptor (GLP-1R) akut farmakológiai blokádja növeli az élelem növelését, de az élelmiszer-fogyasztást nem. A GLP-1R antagonista, az Exendin 9 (Ex9; 10 μg) intra-LH mikroinjekciója növelte a kapott szacharóz mennyiségét ( a, b ) és a javadalmazáshoz szükséges emelőkarok számát ( c, d ) a progresszív arány ütemtervében, az inaktív tőkeáttételi tevékenység változása nélkül ( e, f ) hím patkányokban. Hasonlóképpen, ez a kezelés jelentősen megnövelte a táplálékfelvételt (az adagolók száma az adagolóban) hím patkányokban ( g, h ). E paraméterek egyike sem változott nőstény patkányokban. Ételbevitel 1-ben mérve ( én, j ) és 24 óra ( k, l ) a táplálékfelvételt egyetlen nem sem befolyásolta. A mozgásszervi aktivitás szintén nem változott jelentősen ( m, n ). Az adatokat átlag ± sem n = 8–10-ben fejezzük ki (hím patkányok: m ) és n = 14 (nőstény patkányok: f ). * P # P = 0,07.
Teljes méretű kép
- Töltse le a PowerPoint diát
Az LH-ra irányuló GLP-1R krónikus elnyomása megnövekedett súlygyarapodáshoz, táplálékfelvételhez és tápláléknöveléshez vezet
Annak meghatározása érdekében, hogy az LH-ban az endogén GLP-1R jelzés szükséges-e a súlykontrollhoz, az élelmiszer-bevitelhez és az élelmiszer-ösztönzéshez, az AAV-GFP-t vagy az AAV-GLP-1R-shRNS-t kétoldalúan, közvetlenül adtuk az LH-nak. Ez körülbelül 50% -os és 80% -os csökkenést eredményezett (férfi/fiatalabb nők és idősebb nők) a GLP-1R transzkript expresszióban AAV-GLP-1R-shRNS-fertőzött patkányokban a kontrollokhoz képest (4n. Ábra, S8A. Kiegészítő ábra). és B). Ez a kezelés elegendő volt a normál testtömeg és az étrend-szabályozás megzavarására 9 hetes hím patkányokban, mivel az AAV-GLP-1R-shRNS patkányok lényegesen nagyobb súlyt kaptak (F (23, 644) = 10, 69; P
50% az AAV-GLP-1R-shRNS-sel (rövid hajtű RNS) kezelt LH patkányokban a kontrollokhoz képest ( n ). A koronális agy metszete a kontroll LH-célzott infúzióit és az AAV-GLP-1R-shRNS-t mutatja ( ról ről ). Nukleáris festés, a DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) kék színnel látható. Panelek ( o a q ) zöld fluoreszcens fehérjét expresszáló sejteket mutatnak LH-ban. * P # P
vita
Adataink azt mutatják, hogy a korábbi megállapításokkal ellentétben az agyban, és különösen az LH-ban található GLP-1R nélkülözhetetlen a férfiak és a nők testtömegének és testzsírjának szabályozásához. Hasonlóképpen, elengedhetetlenek ahhoz, hogy megfékezzék a férfiak táplálékkal való jutalmának viselkedését. Figyelembe véve az egyetlen génmanipulációval az LH-ban elért robusztus és tartós változásokat, ennek a magnak óriási lehetősége van mind az elhízás kialakulásához, mind pedig a túlevés szabályozására szolgáló stratégiák azonosításához.