átrendeződés

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • A Tempol megvédi az egereket az elhízástól és az inzulinrezisztenciától
  • A Tempol befolyásolja a bél mikrobiotikumait és a BSH aktivitását
  • A Tempol növeli a bél taurin epesavakat
  • A T-P-MCA gátolja az FXR jelátviteli utat
  • A bélspecifikus FXR megzavarása csökkenti az elhízást
  • A Tempol javítja az elhízást azáltal, hogy gátolja a bél FXR-ét
  • vita
  • mód
  • Vegyszerek és reagensek
  • Állatkísérletek
  • Elsődleges hepatociták előállítása és tenyésztése
  • RNS elemzés
  • Luciferáz vizsgálatok
  • Metabolikus vizsgálatok
  • A bél mikrobiomjának 16S rRNS génszekvenálása
  • Metagenomikus adatok elemzése
  • UPLC-ESI-QTOFMS elemzés
  • Adatfeldolgozás és többdimenziós adatelemzés
  • BSH aktivitás
  • Adatelemzés
  • További részletek
  • További információ
  • PDF fájlok
  • További információ
  • Hozzászólások

elemeket

  • Sejtjelzés
  • mikrobiom
  • Elhízottság
  • Terápiák

absztrakt

Az antioxidáns tempol csökkenti az egerek elhízását. Itt bemutatjuk, hogy a tempol megváltoztatja a bél mikrobiómáját azáltal, hogy előnyösen csökkenti a Lactobacillus nemzetséget és epesó-hidroláz (BSH) aktivitását, ami a bél tauro-β-muricholsav (T-P-MCA) felhalmozódásához vezet. A T-P-MCA a farnesoid X receptor (FXR) nukleáris receptor antagonistája, amely részt vesz az epesav, a lipid és a glükóz metabolizmusának szabályozásában. A tempol-kezelés során megemelkedett szintje gátolja az FXR jelátvitelt a bélben. A magas zsírtartalmú étrenddel táplált Fxr-null magas zsírtartalmú egerek (Fxr AIE) alacsonyabb étrend okozta elhízást mutatnak, hasonlóan a tempolóval kezelt vad típusú egerekhez. A Tempol kezelés nem csökkenti tovább az FxrAIE egerek súlygyarapodását, ami arra utal, hogy a bél FXR közvetíti a tempol elhízás elhízásra gyakorolt ​​hatását. Ezek a tanulmányok bemutatják a mikrobiom, a nukleáris receptor szignalizáció és az anyagcserezavarok közötti biokémiai kapcsolatot, és arra utalnak, hogy a bél FXR gátlását elhízás elleni gyógyszerek célozhatják meg.

Az elhízás globális járványos méreteket öltött, és olyan krónikus betegségekhez kapcsolódik, mint a 2-es típusú diabetes mellitus, a szív- és érrendszeri betegségek, a hepatosteatosis és a rák 1. Az elhízás az energiafogyasztást meghaladó energiafogyasztás eredményeként alakul ki, ami a zsírtartalmú zsírok formájában a felesleges kalóriák nettó tárolásához vezet 2. Ideális gyógyszerészeti megközelítés, amely elnyomja az étvágyat, blokkolja a zsír felszívódását vagy elősegíti a zsír mobilizálódását 3. Tempol (4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-piperidin-1-oxil), antioxidáns és 4,5 sugárvédelemről számoltak be, hogy megakadályozza az egerek elhízását 6. Egy nemrégiben végzett tömegspektrometrián alapuló metabolomikai tanulmány kimutatta, hogy a tempol megváltoztatta a mikrobák által feltételezett bélmikrobák szintjét, kezdeti jelzéseket szolgáltatva arról, hogy a tempol megváltoztathatja a mikrobiom összetételét, vagy megváltoztathatja a bélbaktériumok metabolikus potenciálját 7. Érdekes módon a tempol gátolhatja az ischaemia/reperfúziós károsodás patkány bélszövetekre gyakorolt ​​káros hatásait is, megakadályozva a baktériumok transzlokációját 8. A tempol hatását a bél mikrobiomjára azonban nem vizsgálták.

A bélmikrobiális populációk nagy áteresztőképességű 16S riboszomális RNS (16S rRNS) génszekvenálása és a tömegspektrometrián alapuló metabolomika hatékony eszköz a bél mikrobiomjának, illetve a biológiai mátrixokban található metabolitok jellemzésére. 9, 10. Ismert, hogy a bélben a bél mikrobiális egyensúlyának megzavarása különféle metabolikus utakat befolyásolhat in vivo, például a zsírsavak és az epesavak anyagcseréjét 11. Ez hozzájárulhat ahhoz a megállapításhoz, hogy a Firmicutes és a Bacteroidetes törzs, az egerekben és az emberekben egyaránt uralkodó két mikrobiota populáció elhízott egerekben megváltozott a sovány állatoknál 12. Úgy gondolták, hogy a 16S rRNS-házasság, szekvenálás, metagenomika és metabolomika fényt deríthet a gazda és a bélben talált 100 billió mikroba közötti kölcsönhatásra. A mai napig azonban korlátozott számú tanulmány készült ezen nagy áteresztőképességű megközelítések felhasználásával az elhízás és az inzulinrezisztencia kezelésének lehetséges célpontjainak azonosítására.

Jelen tanulmányban a 16S rRNS génszekvenálás és a tömegspektrometrián alapuló metabolomika kombinációját alkalmazták a bél mikrobiómájának és metabolitjainak változásainak megvizsgálására tempol-tal kezelt magas zsírtartalmú egérmodellben (HFD). Ezenkívül a bélspecifikus Fxr-Null (Fxr AIE) egereket használták annak a mechanizmusnak a vizsgálatára, amely révén a bél mikrobioma befolyásolja az elhízást és az inzulinrezisztenciát. Ez a tanulmány bebizonyítja, hogy a tempol csökkenti az elhízást és az inzulinrezisztenciát a bél mikrobiota átalakításával, ami az epesav összetételének megváltozásához és a farnesoid X receptor (FXR) jelátvitelének ezzel összefüggő gátlásához vezet.

az eredmény

A Tempol megvédi az egereket az elhízástól és az inzulinrezisztenciától

A Tempol befolyásolja a bél mikrobiotikumait és a BSH aktivitását

( a ) A HFD-n tartott egerek tipikus növekedési görbéi. n = 5 egér csoportonként. ( b ) az egerek zsír- és zsírtömegének és a sovány tömegének aránya 6 hét HFD után. n = 5 egér csoportonként. c ) GTT és a 7 hetes HFD görbe alatti terület. n = 5 egér csoportonként. d ) ITT 13 hetes HFD. n = 5 egér csoportonként. e ) Az éhomi glükóz, az éhomi szérum inzulin és a 14 hetes HFD homeosztázis modell indexe. n = 5 egér csoportonként. Az összes adatot átlag ± sd-ként, ANOVA-ként mutatjuk be, amelyet kétoldalas Student t-teszt követ. * P fl/fl .

Teljes méretű kép

A Tempol javítja az elhízást azáltal, hogy gátolja a bél FXR-ét

a ) A vivőanyag és a tempolo Fxr fl/Fl egerek és az Fxr AIE egerek növekedési görbéi HFD-n. n = 4-5 egér csoportonként. b ) A testösszetétel NMR-vizsgálattal a zsírtömeg arányának (balra) és a zsír/sovány arányának (jobbra) megjelenítéséhez vivőanyaggal és tempollal kezelt egerekben 13 hét HFD után. n = 4-5 egér csoportonként. ( c ) GTT és a görbe alatti terület 5 hét templomos kezelt egér után HFD-n. n = 4-5 egér csoportonként. d ) ITT 6 hét HFD után. n = 4-5 egér csoportonként. e ) Az éhomi glükóz, az éhomi szérum inzulin és a homeosztázis modell értékelési mutatója 16 hétig tartó HFD-vel végzett tempol-kezelés után. n = 5 egér csoportonként. Az összes adatot átlag ± sd-ként, ANOVA-ként mutatjuk be, amelyet egyirányú ANOVA követ, Tukey-próbával. * P 7. Kiváló mesenterialis artéria elzáródású patkánymodellben a tempole kezelés megakadályozta az ischaemia/reperfúziós sérülés káros hatásait a bélszövetekre, csökkentve a baktériumok transzlokációját 8. Ezek az eredmények további bizonyítékot szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy a tempol befolyásolhatja a mikrobiomot.

Az FXR kulcsszerepet játszik az epesavak, a lipidek és a glükóz metabolizmusában. Az Fxr -/- egereknél fokozott volt az étrend glükóz intoleranciája 33, az FXR agonisták pedig javították az inzulinérzékenységet az elhízás genetikai modelljében 34. Más tanulmányok azonban azt sugallják, hogy az Fxr -/- egereknél javult a glükóz homeosztázis, és hogy az FXR agonisták súlyosbították a lipidanyagcsere és az inzulinrezisztencia zavarait elhízott egérmodellekben 35, 36. Ez az ellentmondásos bizonyíték arra, hogy az FXR szerepet játszik az anyagcsere-rendellenességek patogenezisében, a máj FXR-szignalizációjának tudható be, ellentétben ezzel a bél FXR-t magában foglaló vizsgálattal. Ezenkívül a bél mikrobiotájának különbségei megmagyarázhatják a fenti kísérleti eredményeket. Jelen tanulmány bizonyítékokkal támasztja alá azt a nézetet, hogy a bél FXR gátlása mind az Fxr AIE egerek, mind a tempollal kezelt egerek genetikai ablációs modelljében javítja az étrend okozta elhízást és inzulinrezisztenciát.

Bár a bél FXR szignalizációjának az elhízást befolyásoló teljes mechanizmusa még nem teljesen megállapított, a lipidomika kimutatta, hogy a szérum C14, C18, C18: 1, C20: 4 SM és a ceramid/S1P arány Fxr AIE-ben és tempollal kezelt egerekben számos tanulmány az elmúlt évtizedben támogatják az SM és metabolitjainak szerepét az elhízással járó anyagcserezavarok patogenezisében 22. Az SM metabolizálható ceramiddá, szfingozinná és S1P 37-vé. A ceramid aktiválja a protein-kináz C-t, a c-jun N-terminális kinázt, és gátolja az inzulinjelátviteli út transzmisszióját a perifériás inzulin célszövetekben, például a májban és a zsírszövetben. Beszámoltak arról, hogy az S1P ellensúlyozza a ceramid hatásait. Kimutatták, hogy a keramid és a SIP arányának növekedése hozzájárul az inzulinrezisztenciához és az elhízáshoz 39. Hogy ez a fő módszer a tempol és az FXR elhízásra gyakorolt ​​hatásainak közvetítésére, további vizsgálatot igényel.

Összefoglalva, a metagenomika és a metabolomika kimutatta, hogy a bél FXR szignalizációjának tempol-kezeléssel történő gátlása a Lactobacillus aktivitás és BSH aktivitásának csökkenésével járt. A T-P-MCA felhalmozódása a bélben FXR-gátlással járt. Egy nemrégiben baktériummentes egerek felhasználásával végzett kutatás feltárta, hogy a T-P-MCA gátolhatja az FXR jelátvitelt in vivo a bélben 21. Ez alátámasztja az itt közölt in vitro vizsgálatokat. Az a megállapítás, hogy a tempol javította az elhízást azáltal, hogy gátolta a bél FXR jelátvitelt, arra utal, hogy a bél FXR potenciális klinikai célpontként működhet az elhízás kezelésében.

mód

Vegyszerek és reagensek

A templomot Sigmától (St. Louis, MO) vásárolták. Az epesavakat a Steraloid, Inc.-től rendelték. (Newport, RI), valamint a Sigma és a TCA-d5 nátrium a Toronto Research Chemicals Inc.-től származik. (Toronto, Ontario). SM-ket és keramidokat az Avanti Polar Lipids-től kaptunk. Az S1P ELISA készletet az Echelon Biosciences Inc. cégtől vásároltuk. (Salt Lake City, UT). Az epesav készletet a Catachem, Inc.-től vásárolták. (Oxford, CT). Minden oldószer és szerves reagens a lehető legjobb minőségű volt.

Állatkísérletek

Elsődleges hepatociták előállítása és tenyésztése

A hepatocitákat az általános perfúziós módszerrel állítottuk elő 41. A 6 hetes C57BL/6N egerekből származó primer májsejteket kollagenáz 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) perfúzióval nyertük. A sejteket 45% -os perkoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) sűrűségű centrifugálással tisztítottuk, és DMEM-ben (Invitrogen) tenyésztettük 10% marha magzati szérummal és 1% inzulin-transzferrin-szelén-etanol-aminnal (Invitrogen). A hepatociták életképességét tripán kék színezék kizárással határoztuk meg, és 85% -nál magasabb életképességűeket alkalmaztunk. A táptalajt 4% -os tenyésztés után 1% fetális marha-szérummal DMEM-re cseréltük. 4 órán át tartó éhezés után a sejteket 24 órán át tempol/TCA/T-p-MCA/TCDCA/TUDCA/CDCA-nak tettük ki.

RNS elemzés

A belek nyálkahártyáját óvatosan összekaparták és folyékony nitrogénben lefagyasztották, és -80 ° C-on tárolták, amíg RNS-t nem készítettek. Az RNS-t fagyasztott belekből extraháltuk TRIzol-reagenssel (Invitrogen). 1 μg teljes RNS-ből komplementer DNS-t szintetizáltunk Superscript II reverz transzkriptáz (Invitrogen) alkalmazásával. A qPCR primereket qPrimerDepot alkalmazásával terveztük, és a szekvenciákat az S1 kiegészítő táblázat mutatja. A qPCR-t SYBR green PCR master mix alkalmazásával hajtottuk végre egy ABI Prism 7900HT szekvencia detektáló rendszerben (Applied Biosystems, Foster City, CA). A mért mRNS szinteket a 18S riboszomális RNS szintjére normalizáltuk, és a kontrollcsoportéhoz viszonyítva a változás változásaként fejeztük ki.

Luciferáz vizsgálatok

Grace Guo (Rutgers University) biztosította a PGL4-Shp-TK szentjánosbogár luciferáz konstrukciót és az emberi Fxr expressziós plazmidot. Paul A. Dawson (Wake Forest Egyetem Orvostudományi Kar) biztosította az emberi Asbt expressziós plazmidot. A plazmidokat Caco2 (ATCC HTB-37) sejtekbe transzfektáltuk az X-tremeGENE HP DNS transzfekciós reagens (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) alkalmazásával. A sejteket lizáltuk, és a luciferáz aktivitásokat Dual-Luciferase assay készlettel (Promega, Madison, WI) mértük. A Firefly luciferáz aktivitást normalizálták a Renilla luciferase aktivitásra.

Metabolikus vizsgálatok

A GTT esetében az egereket 16 órán át éheztettük, vért vettünk, és az egereknek intraperitoneálisan 1 g kg -1 glükózt adtunk. Az ITT esetében az egereket 4 órán keresztül éheztettük, vért vettünk, majd intraperitoneálisan injektáltunk inzulint (Eli Lilly, Washington, DC) 1 U kg -1 testtömeggel. Vérmintákat vettünk a farokból 15, 30, 60 és 90 perccel az injekció beadása után, és a glükózt glükométerrel (Bayer, Pittsburgh, PA) mértük. Az éheztetett szérum inzulint enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálati készlettel (Crystal Chem Inc., Downers Grove, IL) mértük.

A bél mikrobiomjának 16S rRNS génszekvenálása

A székletben és a vakbél tartalmában lévő baktériumokat a PowerSoil DNS izoláló készlet (Mo Bio laboratórium, Inc., Carlsbad, Kalifornia) segítségével extraháltuk. A PCR-termékek (

1000 bp) tisztítottuk az AgencourtAMPure technológiával (Beckman Coulter, Brea, CA), a 454-es műszaki közlemény 2011-002 számú rövid töredékeltávolítási eljárásában leírtak szerint. Tisztítás után a termékeket mind a Qubit (Lifetech, Carlsbad, CA), mind a qPCR segítségével mennyiségileg meghatároztuk a KAPA Biosystems Library Quantification Kit (KapaBiosystems, Woburn, MA) segítségével. A termékeket moláris mennyiségek alapján egyesítettük, 1% -os agarózgélen futtattuk és extraháltuk. QIAquick PCR tisztító készlettel (Qiagen, Valencia, Kalifornia) végzett tisztítás után a minőséget és mennyiséget egy DNS 7500LabChip alkalmazással értékeltük az Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) és a Qubit kvantifikációval. A szekvenálást negyed Picotiter lemez felhasználásával hajtottuk végre egy 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX + (Roche Diagnostics) készüléken. A qPCR-t SYBR green PCR master mix segítségével hajtottuk végre egy ABI Prism 7900HT szekvencia detektáló rendszerben (Applied Biosystems). A PCR-körülmények 50 ° C-on voltak 2 percig; 95 ° C-on 10 percig; 40 ciklus 95 ° C-on 15S esetén; és 60 ° C-on 1 percig.

Metagenomikus adatok elemzése

A kísérleti elrendezés 14 mintából állt, 6 hordozóreplikátumként és 8 tempol-szondás replikátumként elosztva. Minőségi szűrés és deduplikáció után minden minta átlagosan 11 000 olvasást tartalmaz. A mothur 42 szoftvercsomagot alkalmazták a szekvenálási adatok előfeldolgozásához, és a Ribosomal Database Project 43 multi-osztályozót az egyes szekvenciák rendszertani besorolásához rendelték. Az előfeldolgozás abból állt, hogy átlagosan 20-as minőségre szűrtük le az olvasmányokat, eltávolítottuk a duplikált szekvenciákat és vonalkódokkal osztottuk fel mintákra, miközben lehetővé tettük a vonalkód egyetlen eltérését. A varianciaanalízist (ANOVA) alkalmazó, a faktoriális kezelés tervezésével készült egyedi statisztikai eszköz taxonómiai rangokat detektál, amelyek statisztikailag jelentős változásokat mutatnak a minták között. A mintánkénti összes olvasás különbségének figyelembevétele érdekében az osztályozásokat az összes olvasás százalékára konvertáltuk. Ez a megközelítés lehetővé tette a pontos összehasonlítást a csoportokon belül és között.

ANOVA elemzést faktoriális kezeléssel vezettek be a számban jelentősen megváltozott baktériumok kimutatására.

A teljes modellt fix effektus modellnek nevezzük.

Kezelések tempol és jármű

Tanulmány: 1. vizsgálat, 2. vizsgálat (az 1. vizsgálat újraszekvenálása)

Hipotézis: a baktériumok változatlanok különböző dózisokban.

i = 1,2,3; j = 1,2; k = 1, 2, 3, 4

i = 1,2,3; k = 1, 2, 3, 4

A teljes modell a két vizsgálatot (1. és 2. vizsgálat) blokkként kezeli, hogy először lássa, van-e „tanulmányi” hatás. Ha a „tanulmány” hatás szignifikáns, akkor a vizsgálatokat blokkhatásként külön tartják a problémában 42. Ha nem, akkor eltávolítják és két vizsgálat adataival kombinálják 43. Végül a Š-érték korrekciót alkalmaztuk a P-érték korrekciójára.

UPLC-ESI-QTOFMS elemzés

Adatfeldolgozás és többdimenziós adatelemzés

A nyers adatokat a MarkerLynx szoftver (Waters Corp.) segítségével összehangoltuk, hogy olyan mátrixot állítsunk elő, amely egyedi m/z és retenciós időnek megfelelő normalizálás nélküli csúcsterületekből áll. A főkomponens-elemzést és a PLS-DA modelleket is tartalmazó metabolomanalízist a SIMCA-P + 12 (Umetrics, Kinnelon, NJ) 44 alkalmazásával végeztük. A modellel 0,8 korrelációjú ionok jelentősen hozzájárultak a kontrollcsoport és a tempol-kezelt csoport közötti elválasztáshoz.

BSH aktivitás

A székletfehérjéket a székletmintából (0,5 g) pH = 7,4 PBS-ben (5,0 ml) állítottuk elő 45 ultrahangos kezeléssel. A BSH aktivitást a székletben a TCDCA-ból származó CDCA keletkezése alapján mértük. Röviden, az inkubálást 3 mM nátrium-acetát pufferben (pH 5,2) végeztük, amely 0,1 mg ml -1 székletfehérjét és 50 μM TCDCA-d5-t tartalmazott 200 μl végtérfogatban. 20 perces, 37 ° C-on végzett inkubálás után a reakciót a minták szárazjégbe merítésével leállítottuk. Száz mikroliter metanolt adunk közvetlenül a 100 μl reakcióelegyhez. Miután 20 percig 14 000 × g-vel centrifugáltuk, a felülúszó 5 μl-ét egy automata mintavevő fiolába helyeztük, amelyet egy UPLC rendszer elemzésének vetett alá XEVO hármas kvadrupolos tandem tömegspektrométerrel (Waters Corp.).

Adatelemzés

A kísérleti értékeket átlag ± sd-ként adjuk meg, a statisztikai elemzést a kétfarkú Student t-teszt és az egyirányú ANOVA segítségével Tukey-próbával, illetve Dunnett-próbával végeztük. P értékek